全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
植物内生真菌（endophytic fungus）是指那些在
其生活史中某一段时期生活在活的植物组织内、不
引起植物组织产生明显病害症状的真菌［1］。研究发
现，寄生在植物体内的内生真菌可以产生多种活性
物质，如吡咯烷类生物碱、麦角碱、吲哚二萜等活
性物质，可以提高植物的抗病菌、抗线虫的能力，
如 Istifadah 等［2］研究发现，将内生真菌球毛壳菌
（Chaetomium globosum）接种到小麦后，能够减轻由
小麦德氏霉（Drechslera tritici-repentis）引起的小麦
黄斑叶枯病的症状。因此，植物内生真菌具有作为
收稿日期 ： 2013-07-29
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270061）
作者简介 ：刘琴英，女，硕士研究生 ；研究方向 ：应用微生物学 ；E-mail ：rk371970746@163.com
通讯作者 ：女，教授，硕士生导师，研究方向 ：微生物学和植物病理学 ；E-mail ：jdh@ zjnu. cn
淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1 菌株产生
抗菌物质的发酵条件优化
刘琴英  蒋冬花  齐育平  孙蕾  陈璨  谢祥聪 
（浙江师范大学 化学与生命科学学院，金华 321004）
摘 要 ： 以淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1 菌株发酵液乙酸乙酯粗提物对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae
pv. oryzae，Xoo）抑菌活性为检测指标，采用单因素试验优化 Bo-1 菌株产生抗菌物质培养所需的碳源、氮源、无机盐 ；通过正交
试验优化培养基配方和摇瓶发酵条件。研究结果表明，Bo-1 菌株产生抗菌物质适宜的碳源、氮源和无机盐分别为淀粉、蛋白胨、
MgSO4·7H2 O ；优化的培养基配方为 ：淀粉 30 g/L，蛋白胨 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L ；适宜的发酵条件为 ：温度 30℃，转速
150 r/min，装液量 80 mL/250 mL，pH 6.5。
关键词 ： 淡色生赤壳菌 正交试验 发酵 优化 抑菌活性
Fermentation Optimization of Antimicrobial Substance Produced by
Bionectria ochroleuca Strain Bo-1
Liu Qinying Jiang Donghua Qi Yuping Sun Lei Chen Can Xie Xiangcong
（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004）
Abstract:  Based on the index of antimicrobial activity of ethyl acetate extracts from culture liquid of Bionectria ochroleuca strain Bo-1
to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, the optimal carbon source, nitrogen source and salt for the production of antimicrobial substance by strain
Bo-1 were tested by single factor experiments. The medium composition and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiments.
The results showed that the optimal carbon source, nitrogen source and salt were starch, peptone, MgSO4·7H2O, respectively. The optimal
composition of the medium was 30 g/L starch, 2 g/L peptone, 0.5 g/L MgSO4·7H2O. The optimal fermentation conditions were the combination
of temperature 30℃ , agitation speed 150 r/min, medium volume 80 mL/250 mL, initial pH6.5.
Key words:  Bionectria ochroleuca Orthogonal experiments Fermentation Optimization Antimicrobial activity
新型抗菌药物筛选源的巨大潜力［3］。
生 赤 壳 属（Bionectria） 是 1999 年 Rossman
等［4］ 根据形态学及分子生物学特征将一部分丛
赤 壳 科（Nectriaceae） 菌 种 独 立 出 来 建 立 的 一 个
属，被归类为生赤壳科（Bionectriaceae），肉座菌
目（Hypocreales），子囊菌纲（Ascomycetes），子囊
菌门（Ascomycota）。据相关研究报道，某些生赤壳
菌（Bionectria spp.）所产生的抗生素类物质可以对
某些病原菌起特异性拮抗作用，如曹晋忠［5］从黄芩
内分离出的淡色生赤壳菌 N.SBA35 对枯草芽孢杆菌
2014年第1期 167刘琴英等 ：淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1 菌株产生抗菌物质的发酵条件优化
（Bacillus subtilis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、
镰孢霉（Fusarium）等具有较好抑菌效果。
本实验室以水稻白叶枯病菌（Xoo）P6 生理小
种为指示菌，筛选得到一株对其抑菌效果明显的
水稻内生真菌淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）
Bo-1 菌株。此外，其发酵液乙酸乙酯粗提物对大
肠 杆 菌（Escherichia coli）、 白 色 念 珠 菌（Monilia
albican）、 枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis）、 李 斯
特氏菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌
（Staphyloccocus aureus）等也有较强抑菌活性。本研
究以 Bo-1 菌株对白叶枯病菌的抑菌活性为检测指
标，优化发酵工艺以期提高发酵液中抑菌活性物质
的含量，并测定其次级代谢产物的最低抑菌浓度。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 淡色生赤壳菌（Bionectria ochrol-
euca）Bo-1 菌株由本实验室从浙江省金华市水稻田
健康水稻叶片内分离获得，保藏于中国典型培养物
保藏中心，保藏号为 CCTCC NO ：M 2013027。
1.1.2 供 试 病 原 菌 水 稻 白 叶 枯 病 菌（Xoo）P6
生理小种，由浙江师范大学生化学院遗传实验室
提供。
1.1.3 主要培养基 马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基
（PDP）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨 1.0 g，
水 1 000 mL，pH6.0-6.5，（固体培养基加琼脂粉 18 g）；
用于 Bo-1 菌株的培养与优化。
改良 PD 培养基 ：马铃薯 300 g，蛋白胨 5.0 g，
蔗 糖 15.0 g，Ca（NO3）2·4H2O 0.5 g，NaHPO4·
12H2O 2.0 g，水 1 000 mL，pH6.0-6.5，（固体培养基
加琼脂粉 18 g）；用于 Xoo P6 生理小种的培养。
1.2 方法
1.2.1 Bo-1 菌株发酵液粗提物的制备 采用液体发
酵的方法，挑取已纯化菌丝体接种到装有约 100 mL
PDP 液体培养基的 250 mL 锥形瓶中，于摇床上（220
r/min、28℃）振荡培养。培养约 7 d 后，获得发酵液。
所得发酵液在室温下经纱布过滤后得滤液，滤液经
乙酸乙酯萃取多次，直至上层乙酸乙酯层无色为止。
将得到的乙酸乙酯层溶液合并，在旋转蒸发仪上蒸
发浓缩至干即得 Bo-1 菌株发酵液粗提物。
1.2.2 Bo-1 菌 株 抑 菌 活 性 的 生 物 测 定 参 照 文
献［6，7］，用牛津杯法测定发酵液粗提物对白叶枯病
菌拮抗活性，具体操作如下 ：取保藏于 -80℃冰箱
Xoo P6 生理小种接种于改良 PD 液态培养基摇床活
化培养（120 r/min，28℃），当菌悬液浓度达到 OD
值 0.6 时，取 100 μL 菌液均匀涂布到 PDA 固体培养
基上，待用 ；把发酵液粗提物用乙酸乙酯稀释成浓
度为 200 μg/mL 的药液，待用 ；采用牛津杯法测定
抑菌效果，用十字交叉法测量抑菌圈的大小。以乙
酸乙酯溶液作为空白对照，每处理重复 3 次（以下
所有试验均重复 3 次）。
1.2.3 发酵培养基优化
1.2.3.1 碳源优化 采用单因素试验［8］以 PDP 为基
础培养基，将其中的碳源依次替换为蔗糖、乳糖、
甘油、麦芽糖、淀粉，以基础培养基为对照。培养
7 d 后，按 1.2.1 方法处理发酵液，测定发酵液粗提
物的抑菌活性。
1.2.3.2 氮源优化 采用单因素试验［8］以 PDP 为基
础培养基，将其中的氮源依次替换为硝酸铵、胰蛋
白胨、尿素、硝酸钾、牛肉浸膏，以基础培养基为
对照。培养 7 d 后，处理发酵液，测定发酵液粗提
物的抑菌活性。
1.2.3.3 无机盐优化 以优化的碳、氮源培养基作
为对照，根据微生物对大量元素与微量元素的利用
情况不同，按 0.5 % 的量分别加入 NaCl 和 K2HPO4，
按 0.05% 的量分别加入 MgSO4·7H2O 和 CaCl2，按
0.000 5% 的 量 分 别 加 入 FeSO4·7H2O，ZnSO4 和
CuSO4。培养 7 d 后，处理发酵液，按测定发酵液粗
提物的抑菌活性。
1.2.3.4 培养基配方正交优化 在上述单因子筛选
的基础上，以淀粉、蛋白胨、MgSO4·7H2O 为考察
因素，设置 3 个水平，用 L9（3
4）正交设计试验（表
1）［9］。培养 7 d 后，处理发酵液，测定发酵液粗提
物的抑菌活性。
1.2.4 发酵条件正交优化 采用优化后的培养基，
以装液量、初始 pH、培养温度、摇床转速为考察因
素，每个因素设计 4 个水平，用 L16（4
5）正交设计
试验（表 2）［9］。培养 7 d 后，处理发酵液，测定发
酵液粗提物的抑菌活性。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期168
表 2 发酵条件正交试验的因素和水平设计
因素 A（温度℃） B（转速 r/min） C（装液量 mL） D（pH）
1 24 120 40 6.5
2 27 150 60 7.0
3 30 180 80 7.5
4 33 210 100 8.0
1.2.5 优化验证试验 将活化后的 Bo-1 菌株分别接
种到优化后培养基和原始培养基中，并对应采用优
化后的培养条件和原始条件进行发酵。培养 7 d 后，
处理发酵液，测定发酵液粗提物的抑菌活性。
1.2.6 最低抑菌浓度测定（MIC） 使用优化后的培
养基及条件进行发酵，制备发酵液粗提物，称取一
定质量的该粗提物溶于乙酸乙酯中，对倍稀释配制
浓 度 分 别 为 2 000、1 000、500、250、125、62.5、
31.25、15.6、0 μg/mL 的药液，琼脂稀释法［10，11］测
定 Bo-1 菌发酵液粗提物对白叶枯病菌的 MIC。以原
始培养基及条件发酵所得的发酵液粗提物作为对照。
2 结果
2.1 发酵培养基优化
2.1.1 Bo-1 菌株发酵的碳源优化 由表 3 可知，不
同碳源对 Bo-1 菌株发酵液粗提物抑菌活性强弱明显
不同。其中，以淀粉为碳源时，发酵液粗提物抑菌
活性最强，抑菌圈直径达 34.2 mm ；其次蔗糖，抑
菌圈直径为 29.1 mm ；在所有供试的碳源中，甘油
最不适合该菌株产生抗菌物质，所得抑菌圈直径仅
18.3 mm。由此可见，选用淀粉作为碳源最有利于
Bo-1 菌株产生抗菌物质。
2.1.2 Bo-1 菌株发酵的氮源优化 由表 4 知，以不
同氮源替代基础培养基蛋白胨后，其发酵液粗提物
抑菌活性均不如蛋白胨（28.9 mm）。但各氮源间还
是存在一定差异，牛肉浸膏仅次于蛋白胨，抑菌圈
直径为 27.5 mm ；接着依次为胰蛋白胨、硝酸铵、
硝酸钾、尿素。因此，选择蛋白胨作为氮源最有利
于 Bo-1 菌株产生抗菌物质。
表 4 氮源对 Bo-1 菌株发酵液粗提物抑菌活性的影响
氮源 抑菌圈（mm） 标准偏差
CK 28.9 0.894
硝酸铵 26.5 0.811
硝酸钾 22.2 1.692
尿素 21.6 1.454
胰蛋白胨 27.2 1.356
牛肉浸膏 27.5 1.642
2.1.3 无机盐对 Bo-1 菌株发酵的影响 在优化后的
碳、氮源培养基中，分别加入不同无机盐培养 Bo-1
菌株，所得发酵液粗提物抑菌活性有显著差异（表
5）。与基础培养基相比，加入无机盐后，Bo-1 菌株
发酵液粗提物抑菌活性出现促进、抑制、无影响 3
种情况。当加入 MgSO4·7H2O 时，其抑菌能力略有
升高，抑菌圈直径为 37.6 mm（对照 34.2 mm）；当
加入 CuSO4 和 ZnSO4 时，其抑菌活性显著下降，抑
菌圈直径分别为 22.1 mm、25.5 mm。其余 4 种无机
盐（NaCl、K2HPO4、CaCl2、FeSO4·7H2O）的加入，
对其抗菌活性均无明显影响。由此可见，在基础培
养基中加入 MgSO4·7H2O 有利于 Bo-1 菌株产生抗
菌物质。
2.1.4 优化的发酵培养基配方 正交优化试验结果
见表 6，由极差 R 值的大小可以看出，培养基配方
的 3 种组分对 Bo-1 菌株抑菌活性能力影响的主次顺
序为 ：B（蛋白胨）>A（淀粉）>C（MgSO4·7H2O）。
对正交试验进行方差分析（表 7）发现，仅 B 因素
的 P 值小于 0.05，因此，仅 B 因素对试验具有显著
性的影响 ；F 值由大到小依次为 B>A>C，F 数值越
大表明该因素的变化对结果影响越大。由此可知，
对 Bo-1 菌株发酵液粗提物抑菌活性的影响顺序为 B、
A、C，这与直观分析结果基本一致。综上分析，确
定 Bo-1 菌株优化的发酵培养基配方为 A1B1C2 即淀
表 1 发酵培养基正交试验的因素和水平设计
因素 A（范粉） B（受白胨） C（MgSO4· 7H2 O）
1 3% 0.2% 0.1%
2 2% 0.1% 0.05%
3 1% 0.05% 0.01%
表 3 碳源对 Bo-1 菌株发酵液粗提物抑菌活性的影响
碳源 抑菌圈（mm） 标准偏差
CK 28.8 0.992
蔗糖 29.1 0.917
麦芽糖 26.8 0.863
淀粉 34.2 1.315
甘油 18.3 1.235
乳糖 23.4 0.874
2014年第1期 169刘琴英等 ：淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1 菌株产生抗菌物质的发酵条件优化
粉 30 g/L，蛋白胨 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。
表 6 培养基配方正交试验结果
处理号 A B C D 抑菌圈（mm）
1 1 1 1 1 41.2
2 1 2 2 2 36.9
3 1 3 3 3 21.9
4 2 1 2 3 36.5
5 2 2 3 1 24.2
6 2 3 1 2 19.4
7 3 1 3 2 35.9
8 3 2 1 3 25.1
9 3 3 2 1 20.4
K1 100 113.8 85.8
K2 80.1 86.1 93.9
K3 81.4 61.8 81.9
k1 33.3 37.9 28.6
k2 26.7 28.7 31.3
k3 27.1 20.6 27.3
R 6.6 17.3 4
A ：淀粉 ；B ：蛋白胨 ；C ：MgSO4·7H2O ；D ：误差
表 7 培养基配方正交试验方差分析
变异来源 自由度 Seq SS Adj SS Adj MS F P
A 2 82.629 82.629 41.314 6.10 0.141
B 2 449.402 449.402 224.701 33.17 0.029
C 2 24.282 24.282 12.141 1.79 0.358
误差 2 13.549 13.549 6.774
合计 8 569.862
2.2 发酵条件的优化
从表 8 可以看出，发酵条件对 Bo-1 菌株发酵液
粗提物抑菌活性有显著影响。由极差 R 值分析可见，
4 种因素对 Bo-1 菌抑菌活性能力影响的强弱顺序为：
C（装液量）>A（温度）>B（转速）>D（pH）。装
液量对其活性影响最显著，并与其活性呈负相关 ；
pH 对其活性影响最为微弱。对正交试验进行方差分
析（表 9）知，F 值由大到小依次为 C（装液量）>A（温
度）>B（转速）>D（pH），这与直观分析结果基
本一致。因此，最优发酵条件组合 ：A3B2C3D1 即
温度 30℃，转速 150 r/min，装液量 80 mL/250 mL，
pH6.5。
表 8 发酵条件正交试验结果
处理号 A B C D E 抑菌圈（mm）
1 1 1 1 1 1 36.4
2 1 2 2 2 2 35.1
3 1 3 3 3 3 32.8
4 1 4 4 4 4 28.7
5 2 1 2 3 4 27.6
6 2 2 1 4 3 30.1
7 2 3 4 1 2 35.9
8 2 4 3 2 1 37.8
9 3 1 3 4 2 37.5
10 3 2 4 3 1 42.8
11 3 3 1 2 4 26.5
12 3 4 2 1 3 33.8
13 4 1 4 2 3 32.2
14 4 2 3 1 4 31.9
15 4 3 2 4 1 35.8
16 4 4 1 3 2 31.1
K1 133.0 133.7 124.1 138.0
K2 131.4 139.9 132.3 131.6
K3 140.6 131.0 140.0 134.3
K4 131.0 132.5 139.6 132.1
k1 33.25 33.425 31.025 34.5
k2 32.85 34.975 33.075 32.9
k3 35.5 32.75 35 33.575
k4 32.75 33.125 34.9 33.025
R 2.75 2.，225 3.975 1.6
A ：温度（℃）；B ：转速（r/min）；C ：装液量（mL）；D ：pH ；E ：误差
表 9 发酵条件正交试验方差分析
变异来源 自由度 Seq SS Adj SS Adj MS F P
A 3 15.08 15.08 5.03 0.08 0.968
B 3 12.66 12.66 4.22 0.06 0.975
C 3 42.06 42.06 14.02 0.21 0.881
D 3 6.36 6.36 2.12 0.03 0.991
误差 3 195.82 195.82 65.27
合计 15 272.00
2.3 优化验证试验结果
采用优化过的培养基和条件发酵 Bo-1 菌株，其
抑菌活性较原始抑菌活性（29.3 mm）显著增强，抑
菌直径达 42.5 mm（图 1）。
表 5 无机盐对 Bo-1 菌株发酵液粗提物抑菌活性的影响
无机盐 抑菌圈（mm） 标准偏差
CK 34.2 0.834
NaCl 32.9 0.817
K2HPO4 34.1 1.635
MgSO4·7H2O 37.6 0.992
CaCl2 33.9 0.924
FeSO4·7H2O 34.3 0.883
ZnSO4 25.5 1.313
CuSO4 22.1 1.436
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期170
参 考 文 献
［1］ Strobel G, Daisy B. Bioprospecting formicrobial endophytes and their
natural products［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 2003, 67（4）：
491-502.
［2］ Istifadah N, McGee P. Endophytic Chaetomium globosum reduces
development of tanspot in wheat caused by Pyrenophora tritici-repen-
tis［J］. Australasian Plant Pathology, 2006, 35（4）：411-418.
［3］ 易晓华 , 孙之潭 , 胡美英 , 等 . 内生真菌的研究进展［J］. 仲恺
农业技术学院学报 , 2005, 18（10）：61-65.
［4］ Rossman AY, Samuels GJ, Rogerson CT, Lowen R. Genera of
bionectriaceae, hypocreaceae and nectriaceae（Hypocreales,
Ascomycetes）［J］. Stud Mycol, 1999, 42（7）：1-260.
［5］ 曹晋忠 , 郑朝辉 , 等 . 4 个黄芩内生真菌菌株的鉴定及抗菌活性
研究［J］. 安徽农业大学学报 , 2011, 38（3）：393-399.
［6］ 刘冬梅 , 李理 , 杨晓泉 . 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力［J］.
食品研究与开发 , 2006, 27（3）：110-111.
［7］ 董金甫 , 李瑶卿 , 洪绍梅 . 茶多酚（TPP）对 8 种致病菌最低抑
制浓度的研究［J］. 食品科学 , 1995, 16（1）：6-12.
［8］ 段 传 人 , 姚 月 良 , 汪 中 文 , 等 . 海 洋 链 霉 菌 Streptomyces sp.
SCSIO 1666 活性代谢产物替达霉素 A 和 B 的发酵优化及分离
鉴定［J］. 中国海洋药物 , 2010, 12（6）：12-20.
［9］ 王如平 , 吴婷 , 等 . 正交设计优选白芨多糖包合丹皮酚最佳工
艺以及包合物的鉴定［J］. 食品科学 , 2008, 29（12）：259-
263.
［10］ 朱晓松 , 贾林 , 王蜜蜜 , 等 . 商陆提取物抑菌活性评价研究［J］.
中国现代中药 , 2010, 12（12）：33-39.
［11］ 徐龙权 , 陆军 , 葛丽丽 , 等 . 红薯茎叶多糖提取物抑菌研究［J］.
食品科技 , 2011, 36（1）：163-166.
［12］ 袁献温 , 杨瑞丽 , 曹雪 . 抗肿瘤海洋放线菌 ACMA006 发酵条
件的优化［J］. 中国海洋药物 , 2008, 27（6）：5-9.
［13］ 胡小媛 , 滕达 , 张勇 , 等 . 防腹泻布拉酵母培养条件的响应面
法优化［J］. 生物技术通报 , 2013（6）：194-199.
［14］ 刘 冬 梅 , 吴 晖 , 李 理 , 梁 世 中 . Lactobacillus casei rhamnosus
的抑菌作用及最佳抑菌作用发酵条件优化［J］. 食品科学 ,
2008, 6 ：237-242.
（责任编辑 李楠）
A ：优化前 ；B ：优化后
图 1 优化验证试验结果
A B
2.4 最低抑菌浓度测定（MIC）
较原始 Bo-1 菌株发酵液粗提物对白叶枯病菌
的 MIC（250 μg/mL），优化后的 MIC 值有了显著的
下降，其值仅为 125 μg/mL。
3 讨论
微生物的发酵受外部环境条件的影响较大，不
同的环境条件往往使得微生物具有不同的生长状态
和不同的代谢途径，从而产生出不同的代谢产物［12］。
在前期的研究中筛选得到了一株具有较强拮抗水稻
白叶枯病菌活性的淡色生赤壳菌 Bo-1 菌株，本研
究对其进行了一系列发酵条件优化试验，从而得到
Bo-1 菌株产生抗菌物质的最优培养条件，Bo-1 菌株
抑菌活性（42.5 mm）比优化前（29.3 mm）提高了
45.1%。类似的报道，如胡小媛等［13］通过单因子法
及响应面法优化布拉酵母培养基及培养条件，经验
证发现，该菌在优化后的条件下培养，菌体湿重（32.2
g/L）比优化前（20.9 g/L）提高了 54.1%，而活菌数
（8.3×108 CFU/mL）比优化前（5.5×108 CFU/mL）提
高 50.9% ；刘冬梅等［14］通过单因素试验与正交试验
法 相 结 合， 优 化 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
LCR 719 培养基配方及发酵条件后，其对 S. aureus
抑菌圈直径达 42 mm，对枯草芽孢杆菌和肠炎沙门
氏菌也有较好的抑菌效果。
4 结论
在优化条件下，Bo-1 菌发酵液粗提物抗菌活性
有了较大的提高，抑菌圈直径达 42.5 mm，对水稻
白叶枯病菌的 MIC 为 125 μg/mL。