全 文 ：·综述与专论· 2015, 31(3):25-34
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
随着人们绿色环保意识的加强，寻找绿色、无
污染的新型材料越来越受到关注，而 γ-聚谷氨酸
（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）由于水溶性好，可生
物降解与食用，以及对人类、动物和环境无毒的特
点，目前已成为生物多聚物中的研究热点之一。
γ-PGA 是一种水溶性可生物降解的新型绿色生物材
料，由 D- 或 L- 谷氨酸通过 α- 氨基和 γ- 羧基通过 γ-
酰胺键结合而成的阴离子聚合物。γ-PGA 的结构式
如图 1 所示。
γ-PGA 具有可食用性、无毒性、成膜性、黏结
性、保湿性等特点，其应用非常广泛，既可应用于
医药、食品和化妆品中，又可以作为保水剂及水果、
蔬菜的防冻剂、保鲜剂，还可以作为污水处理的絮
凝剂、重金属螯合剂。更重要的是，还可应用于饲
料添加剂方面，提高动物对钙、铁、磷等微量元素
的吸收，减少动物排泄物对环境造成的污染。γ-PGA
的合成方法有化学合成法、提取法和微生物发酵法。
其中化学合成法包括传统的肽合成法和二聚体缩合
法，由于产物纯度难以控制、副产物比较多，同时
产物的相对分子质量比较小，所以限制了该方法的
应用 ；提取法是从日本传统食品纳豆（类似中国的
豆豉）中分离得到 γ-PGA，由于纳豆中成分复杂，
收稿日期 ：2014-08-09
作者简介 ：严涛，男，硕士，研究方向 ：微生物发酵 ；E-mail ：yantao2112@126.com
微生物合成 γ- 聚谷氨酸的相关基因、合成机理及
发酵的研究进展
严涛  郗洪生
（江苏恒丰强生物技术有限公司，海门 226100）
摘 要 ： γ- 聚谷氨酸（γ-PGA）是一种天然的氨基酸聚合物，由于其水溶性好、可生物降解、食用，以及对人类、动物和环
境无毒等特点，因此，在环境、医药、食品和化妆品、饲料添加剂等领域有广泛的应用前景。主要是对微生物合成 γ-PGA 所采用
的菌株、相关基因、合成机理及发酵方面进行综述。
关键词 ： γ-PGA ；基因 ；机理 ；发酵
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.004
Progresses of Microbial Synthesis of Poly-γ-Glutamic Acid of Related
Genes，Synthesis Mechanism and Fermentation
Yan Tao Xi Hongsheng
（Jingsu Hengfengqiang Bio-technology Co.，Ltd，Haimen 226100）
Abstract: γ-polyglutamic acid（γ-PGA）is naturally occurring poly amino acids with characteristics of water solubility, biodegradability,
edible and non-toxicity towards human, animals and the environment. Therefore, γ-Poly（glutamic acid）and its derivatives have been of interest
in a broad range of industrial fields such as environment, medicine, food, cosmetics and feed additives. This paper focuses on the microbial
synthesis of γ-PGA of related genes, synthesis mechanism and fermentation.
Key words: γ-polyglutamic acid ；gene ；mechanism ；fermentation
CH2CH2
COOH O
CH2 nCHN 
图 1 γ-PGA 的结构式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.326
γ-PGA 的含量不稳定，使该方法不能广泛运用。目
前合成 γ-PGA 的主要方法是微生物发酵法［1，2］，该
法工艺相对简单，产物分离纯化容易，微生物发酵
法在近几年得到了广泛的采用与快速发展。本文主
要是对微生物合成 γ-PGA 所采用的菌株、相关基因、
合成机理及发酵方面进行综述。
1 合成 γ-PGA 的菌株
γ-PGA 是最早于 1933 年在炭疽芽孢杆菌（Baci-
llus anthracis）的荚膜上发现的，主要功能是保护细
菌免受外界不利环境的影响。据报道［3］，表皮葡萄
球 菌（Saphylococcus epidermidis） 也 能 合 成 γ-PGA，
合成的 γ-PGA 结合在细胞壁上。另外，3 种古生菌，
如嗜盐球菌（Planococcus halophilus），盐藻芽孢八
叠球菌（Sporosarcina halophila）和亚洲嗜盐碱杆菌
（Natrialba asiatica）也能合成 γ-PGA，用来降低细菌
周围的盐浓度。目前发现的唯一一种真核 γ-PGA 合
成生物为腔肠动物（Cnidaria）。
通过微生物来发酵合成 γ-PGA，其研究主要集
中在芽孢杆菌属细菌的炭疽芽孢杆菌、地衣芽孢杆
菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus
subtilis）等［4］菌株上。根据细胞生长的营养要求，
按是否需要 L-谷氨酸，可以把 γ-PGA 合成菌分为两
大类［5］：一类是谷氨酸依赖型，即培养时需要 L-
谷氨酸才能积累 γ-PGA，这类菌种主要有 Bacillus
anthracis、Bacillus subtilis MR-141、Bacillus lichenifo-
rmis ATCC-9945、Bacillus subtilis IFO3335 和 Bacillus
subtilis F-2-01 等 ；另一类是谷氨酸非依赖型，即培
养时不需要 L-谷氨酸也能积累 γ-PGA 的，如 Bacillus
subtilis 5E、Bacillus licheniformis A35、Bacillus subtilis
TAM-4 等［6］。21 世纪以来，筛选可以高效合成 γ-PGA
的微生物，受到越来越多的学者的关注，曹明飞等［7］
成 功 从 土 壤 中 分 离 到 一 株 γ-PGA 合 成 菌 Bacillus
licheniformis NK-03，其合成的 γ-PGA 中 L- 谷氨酸单
体达到 98%，在已报道的同种菌株 L- 谷氨酸单体含
量中尚属最高。而发现的能够大量合成 γ-PGA 的多
种芽孢杆菌都具有潜在的工业应用价值，本研究组
合成 γ-PGA 所用到的菌株为枯草芽孢杆菌。
2 微生物合成 γ-PGA 的相关基因研究
合成 γ-PGA 的相关基因，根据其命名可分为
cap（Capsule） 和 pgs（Polyglutamate synthase）。 前
者是将 γ-PGA 做为荚膜的结构组成部分，为结构
型，其代表菌株为 Bacillus anthracis ；后者是将产生
的 γ-PGA 分泌到胞外，为分泌型，其代表菌株类型
为 Bacillus subtilis。在 Bacillus anthracis 的菌体中包
含两个质粒，即 pXO1（108 kb）和 pXO2（951 kb），
最 初 将 有 关 PGA 编 码 的 相 关 基 因 定 位 在 Bacillus
anthracis 的 pXO2 质粒上，称之为 cap BCA，这也是
Makino 等［8］在 1989 年首次报道编码 γ-PGA 生物合
成过程的相关基因研究，他们通过基因互补技术，
在质粒 pXO2 上鉴定出呈簇状分布的 3 个顺反子，并
确定其排列顺序为：cap B、cap C 和 cap A，如图 2-A
所示。通过对 cap BCA 这 3 个蛋白的氨基酸序列进
行分析、定位及对理化处理的敏感性，推测这些属
于膜交联酶。后来 Urushibata 等［9］将 cap BCA 基因
克隆转到大肠杆菌（Escherichia coli）中进行表达发
现，cap B 是一个重叠基因，能编码 2 个蛋白 cap B
和 cap B，cap BCA 酶以膜结合蛋白形式存在。另外，
在 cap BCA 基因簇下游发现了编码 γ- 聚 D- 谷氨酸
解聚酶的基因 dep，该基因主要是菌体在饥饿条件下，
启动该基因的表达来降解 PGA 为菌体提供氮源。
cap B
pgs Byws CAB pgs Cywt A pgs Aywt B pgd Sywt Dywt Ccap C cap A dep
A ：Capsule synthase genes cap BCA of Bacillus anthracis ；
B ：Synthesis genes pgs BCA of Bacillus subtilis
图 2 炭疽芽孢杆菌荚膜基因 cap BCA（A）与枯草芽孢杆
菌合成酶基因 pgs BCA（B）
Ashiuchi 等［10］ 从 Bacillus subtilis IFO3336 基 因
组文库中，筛选到编码 γ-PGA 合成酶复合体的克
隆，其能在胞外合成更高分子量的 γ-PGA。此合成
基 因 包 含 ：pgs B、pgs C 和 pgs A（ 也 有 学 者 称 为
yws C、ywt A 和 ywt B）3 个基因，排列成簇，如图
2-B 所示。下游 ywt C 基因功能未知，可能是编码
γ-PGA 解聚酶 pgd S（也有学者称为 ywt D）基因的
先导小蛋白，Bacillus subtilis IFO3336 中 pgs BCA 基
因与 Bacillus anthracis 的 cap BCA 基因同源性分别为
66%、77% 和 50%。Cao 等［11］筛选到一株谷氨酸非
2015,31(3) 27严涛等：微生物合成 γ-聚谷氨酸的相关基因、合成机理及发酵的研究进展
依赖型 γ-PGA 合成菌，即解淀粉芽孢杆菌 LL3，并
从菌体中克隆到 pgs BCA 的 PGA 合成基因，通过与
谷氨酸依赖型 Bacillus subtilis IFO3336 序列比对发
现，pgs B、pgs C 和 pgs A 这 3 个基因的相似性分别
为 81.39%、83.33% 和 73.8%。Uruchibata 等［12］ 从
Bacillus subtilis IFO16449 中获得包含 4 个开放阅读
框的 4.2 kb 片段，Northern 杂交显示其组成一个操
纵子，其中 yws C（pgs B）、ywt A（pgs C）和 ywt B
（pgs A） 为 γ-PGA 合 成 必 要 的 基 因 ；Western 杂 交
发现 yws C 蛋白由 44 kD的 yws C 和 33 kD 的 yws C’
两部分组成，且由同向重叠的 yws C 基因编码，然
而两蛋白具体功能尚不清楚。pgs BCA 系统是分泌
型芽孢杆菌菌体内唯一的 γ-PGA 合成体系［13］，石
峰等［14］从 Bacillus subtilis ZJU-7 的基因组中扩增得
到合成 γ-PGA 的 pgs BCA，通过把 pTrc99A 作为载
体转化到大肠杆菌 JM109 中，构建出来的工程菌大
肠杆菌 JM109 能合成 γ-PGA ；有些枯草芽孢杆菌，
如 Bacillus subtilis 168，虽然含有 pgs BCA 这 3 个基
因，但是由于 γ-PGA 合成酶操纵子受不同启动子控
制，在 Bacillus subtilis 168 菌体中转录水平太低，使
其不能合成 γ-PGA，而马婕等［15］从 Bacillus subtilis
168 基因组中获得合成 γ-PGA 的 3 个基因，即 yws C、
ywt A 和 ywt B，这 3 个基因被连接酶连接后，导入
到 pTrcHisA 中，电转化至转录水平比较高的大肠杆
菌 TOP10 及大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达，结
果显示宿主菌都具备了 γ-PGA 的合成能力。
Xu 等［16］ 从 Bacillus subtilis IFO 16449 菌 中 克
隆出了一个新基因，命名为 ywt D，其功能是编码
可降解 γ-PGA 的一种酶。经 DNA 序列分析将其定
位于 ywt ABC 和 yws C 基因的相连的下游，并与 yws
C 和 ywt ABC 构成控制 γ-PGA 生物合成的一个操纵
子，如图 2-B 所示。同时还证明，ywt D 基因与编
码 DL- 内肽酶的基因序列部分相同。纯化的这种
酶，具有降解 γ-PGA 的功能，降解后可产生两种酶
解产物，一种高分子质量产物（490 kD，100% 由 L-
谷氨酸组成）；另一种低分子质量产物（11 kD，其
中 D- 谷氨酸与 L- 谷氨酸的比为 80∶20）。再用羧
肽酶 G 分析证明这两种产物，这种 ywt D 酶为一种
只降解 γ-PGA 的 D- 与 L- 谷氨酸所形成的 γ- 谷氨酰
键，为 γ-DL- 谷氨酰基水解酶。王计伟等［17］通过在
pET-28b（+）大肠杆菌表达系统中克隆表达 Bacillus
licheniformis ATCC9945A 的 ywt D 基 因， 采 用 SDS-
PAGE 和 Western Blot 方法检测目的蛋白的表达，并
进行体外酶解试验验证其活性，体外酶解试验表
明该表达产物具有降解 γ-PGA 的活性。笔者在用
Bacillus subtilis 发酵合成 γ-PGA 时，在发酵后期，发
酵液变得十分黏稠，但当超滤后，高黏度的发酵液
若不及时提取 γ-PGA，放置几日后，则黏度逐渐消失，
这是由于 γ-DL- 谷氨酰基水解酶对 γ-PGA 降解的原
因。目前，虽然已经得知 γ-PGA 合成的必需基因（即
cap BCA 和 pgs BCA），但是其合成的各个蛋白的具
体功能，仍然不清楚，需要后期进一步的研究。
3 γ-PGA 合成机理的研究
3.1 γ-PGA中碳骨架的来源
组成 γ-PGA 碳骨架是来源于葡萄糖中的碳，还
是来自谷氨酸中的碳，不同菌体其来源不尽相同。
有学者［18］通过 13C 标记葡萄糖，对 Bacillus subtilis
NX-2 中 γ-PGA 分子链中的碳骨架进行了跟踪分析，
结果发现葡萄糖作为碳源大部分用于能量代谢和菌
体合成，只有少部分参与了 γ-PGA 合成，而谷氨酸
则为 γ-PGA 单体的主要来源 ；Cromwick 和 Gross［19］
用 13C 标记柠檬酸和谷氨酸作为培养基碳源，通过
核磁共振技术对该菌合成 γ-PGA 的代谢途径进行了
研究，结果发现柠檬酸和谷氨酸均作为前体参与了
γ-PGA 碳骨架的合成 ；另外，在 Bacillus subtilis MR-
141［20］中，除了 35% 的外源 14C- 谷氨酸整合入 γ-PGA，
还有 6% 的 14C- 葡萄糖也整合入 γ-PGA。由此可知，
不同微生物，其 γ-PGA 碳骨架来源有种属特异性，
根据这一现象有助于为培养基成分的设计及 γ-PGA
的合成提供理论依据。
3.2 γ-PGA的聚合机制研究
最早推测出 γ-PGA 合成机制的是 Troy 等［21］首
先在 Bacillus licheniformis 中发现的，其合成机制为 ：
首先，ATP 激活 L- 谷氨酸，然后由 ATP 脱去 ppi 形
成的 AMP，与谷氨酸在 γ位结合，形成谷氨酰 -γ-AMP；
然后该物质与一种带 -SH 的酶或者受体（如一些硫
脂，暂以 X 代称）结合，并随后异构化为谷氨酰 -X；
然后谷氨酰连接到 γ-PGA 片段上，并脱去 X，完成
γ-PGA 片段的延伸。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.328
后来，Ashiuchi 等［13］在一株 Bacillus subtilis 中
分离到了细胞膜成分，在 ATP 和 D- 谷氨酸存在下
体外合成了 γ-PGA。但他们发现该菌在合成 γ-PGA
时，ATP 水解形成的是 ADP，而非 AMP，而由于
cap B 的表达蛋白 cap B 属氨基连接酶，他们提出了
另一条合成机制。即 ATP 被 ATP 水解酶水解为 ADP
与 Pi，然后磷酸基团结合到小分子 γ-PGA 的 C 末端，
之后 D- 或者 L- 谷氨酸的氨基端与 C 端磷酸化了的
小分子 γ-PGA 发生亲核攻击，生成 Pi，在 γ-PGA 合
成酶的作用下，延伸 γ-PGA 链。但是，D- 谷氨酸依
赖型的 ATP 酶活性要比 L- 谷氨酸依赖型的 ATP 酶
活性高，这似乎解释了合成酶系对底物的偏好性，
使得 γ-PGA 中的 D- 谷氨酸单体比例偏高。但此机制
仍有待进一步证明，如小分子 γ-PGA 究竟多大，发
生亲核攻击的具体位置等。笔者认为，虽然不同的
学者得到的合成 γ-PGA 的机制不尽相同，但是不同
的微生物，由于其生物特性及代谢调控的不同，其
合成 γ-PGA 的机制也应该不完全相同。ཆⓀ␫࣐㪑㨴㌆щ䞞䞨
ཆⓀ␫࣐α-䞞ᠺҼ䞨TCAᗚ⧟ D-䉧≘䞨D-≘ส䞨䖜≘䞦L-䉧≘䞨 pgs BCAγ-PGAਸᡀ䞦γ-PGAਸᡀ䞦สഐpgs BCA䈳᧗㳻ⲭDegQ
สഐdegQ 䈳᧗㳻ⲭComP-ComA䈳᧗㳻ⲭDegS-DegU䈳᧗㳻ⲭSwrA
γ-PGA
图 3 γ-PGA 的合成途径及调控示意图
3.3 γ-PGA合成的调控研究
由于 cap BCA 和 pgs BCA 的基因序列相似度很
高，而且微生物合成 γ-PGA 属于结合型还是游离型，
主要是取决于另外的基因 cap D 和 pgs S，所以推测
cap BCA 和 pgs BCA 基因控制的 γ-PGA 合成调控机
理相同［22］，而且 cap BCA 基因合成的 γ-PGA 主要是
炭疽芽孢杆菌荚膜的主要成分，一般不用其大量生
产 γ-PGA，对其调控的研究很少有报道。因此，这
里简述一下 pgs BCA 基因合成 γ-PGA 的调控研究。
Mader 等［23］在 Bacillus subtilis 中发现高浓度的
磷酸化的 DegU 能够活化 pgs B，C，A 的转录。2005
年，Stanley 等［24］报道称在 Bacillus subtilis 中，调控
蛋白 ComP-ComA、DegS-DegU、GegQ 和 SwrA 对 γ-PGA
的合成是必需的。他们将 DegQ 和 SwrA 分别敲除发
现，这两个基因任一的敲除都将导致 γ-PGA 不能合
成。而后对 DegQ 进行了反转录 PCR 发现，高浓度
的 DegQ 对 yws C（与 pgs B 相同）的转录起调节作
用，而 SwrA 对其转录有细微的影响，所以研究者猜
测 SwrA 主要在转录后起调节作用。而之前的研究已
经表明，ComP-ComA 和 DegS-DegU 都能影响 DegQ
的转录，所以他们提出了一种可能的调节途径，如
图 3 所示。Kimura 等［25］于 2009 年发现 pgs B 基因
上游的一段非编码区对其表达起重要作用。他们将
lac Z 与 pgs B 融合，组成融合基因，并通过检测 Lac
Z 的表达来定量表征 pgs B 的表达情况，然后用一种
外切酶从 pgs B 上游 -811 开始切除，进而研究上游
非编码区域对 pgs B 的表达影响。结果表明，-721（+1
为转录起始位点）之后的非编码区对融合基因的表
2015,31(3) 29严涛等：微生物合成 γ-聚谷氨酸的相关基因、合成机理及发酵的研究进展
达起重要作用，猜测可能是 ComA 或者 DegU 需要
与该段区域结合，进而对 γ-PGA 合成基因进行调控。
另外，Bacillus subtilis 168 被广泛用于 γ-PGA 调控研
究，因为该菌是为数不多的、拥有全套的 γ-PGA 合
成基因却不生产 γ-PGA 的菌株。
综 上 所 述，ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ
和 SwrA 对 γ-PGA 的合成都是必需的。其中 ComP-
ComA，DegS-DegU 蛋白对基因 degQ 进行调控，进而
调节 DegQ 的转录，影响 γ-PGA 合成酶的合成，间
接影响 pgs B，C，A 的转录，SwrA 则主要作用于 pgs B，
C，A 的转录后调控，即主要调控 γ-PGA 合成酶的
活性。而 pgs B 上游的非编码区对 pgs B 的表达也有
重要影响。
4 微生物合成 γ-PGA 发酵的研究
通过微生物来发酵生产 γ- 聚谷氨酸，其发酵影
响因素，如碳氮源、通氧量、搅拌速度、金属离子、
微量元素、前体物质、生物素等，对不同菌株生产 γ-
聚谷氨酸的影响是不同的。表 1［26-34］列出了几株谷
氨酸依赖型和非依赖型菌株的培养基配方、发酵周
期和 γ- 聚谷氨酸产量、单体 D/L- 谷氨酸比例及分子
量大小。以发酵菌株、发酵培养基成分及培养条件、
发酵方式 3 个方面来简述微生物发酵合成 γ- 聚谷氨
表 1 γ-聚谷氨酸部分合成菌及发酵条件
菌株 培养基主要成分 / （g·L-1） 发酵周期 /h D/L- 谷氨酸比例
γ- 聚谷氨酸分子
量 （Mw, kD）
γ- 聚谷氨酸产量 /
（g·L-1）
谷氨酸依赖型 B.subtilis IFO3335 Glutamic acid 30 96 83/17 1500 10.0-20.0
Glycerol 20
Citric acid 20
（NH4）2SO4 10
B.subtilis （chungkookjang） Glutamic acid 20 120 （50-60）/（50-40） >1000 13.5
Sucrose 50
（NH4）2SO4 20
B.subtilis ZJU-7 NaCl 0.5-5
L-glutamic acid 81 24 1240 54.4
Sucrose 60 （50-70）/（30-50）
B.subtilis RKY3 Trypone 60
NaCl 10
Glycerol 17.6 24 62 48.7
Yeast extract 2.7
Glutamic acid 59.6 ND
谷氨酸非依赖型 B.licheniformis NK-03 Glutamic acid 30 95 2/98 1360 10.5
Glucose 40
B.licheniformis A35 Biotin 250
Glucose 75 96 （50-80）/（50-20） 300 8.0
B.subtilis TAM-4 NH4Cl 18
B.subtilis C1 KNO3 3
Fructose 75 72 200 10.0-14.0
NH4Cl 18 78/22
B.licheniformis PGA-N-C10 Citric acid 22 144 10200 21.4
Glycerol 170 97/3
B.amyloliquefaciens LL3 NH4Cl 7.0
Sodium citrate 40 50 20-275 11.0
Urea 16 ND
Tryptone 12
Sucrose 50 44 470 4.4
（NH4）2SO4 2 1.5/98.5
注 ：ND ：未检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.330
酸的研究进展。
4.1 发酵合成γ-PGA的菌株研究
由于不同菌株，其本身的特性，决定了其生
长代谢的不同，因此发酵合成 γ-PGA 的能力也不
同，因此，很多研究者在基因分子层面对菌株进行
改造，采用基因工程的手段（基因克隆、敲除，转
录和表达等）来构建基因工程菌，以提高其菌株的
性能，进而提高 γ-PGA 的产量。Su 等［35］首次将细
菌血红蛋白基因（vgb）采用同源重组方式整合入枯
草芽孢杆菌染色体中，突变株枯草芽孢杆菌 S18-3-
vgb+ 能正常表达血红蛋白基因，增强了摄氧能力，
成功克服了发酵时黏度增加引起的溶氧不足，使菌
体浓度提高 1.26 倍，γ-PGA 产量增至 60.5 g/L ；Yeh
等［36］研究组将一种高效合成表达控制序列（synthetic
expression control sequence，SECS）单拷贝形式整合
入非 γ-PGA 合成菌枯草芽孢杆菌 DB430 yws C 基因
上游，获得重组菌枯草芽孢杆菌 PGA 6-2，其在不
添加额外谷氨酸和氯化铵的培养基中，能产生 28 g/L
的 γ-PGA，在遗传研究方面，是优良的选择性菌株。
综上所述，通过将外源基因或调控元件导入到 γ-PGA
菌株的基因组中，可使菌体浓度、摄氧能力或内源
合成酶表达水平得到提高，以增加 γ-PGA 的产量。
4.2 发酵合成γ-PGA的培养基成分及培养条件研究
4.2.1 碳源 对于用 Bacillus 属的几种菌发酵合成
γ-PGA 最适碳源多为柠檬酸、甘油、果糖、淀粉、
葡萄糖和麦芽糖等。其中不同菌株适用不同的碳源。
Bacillus licheniform WBL-3［37］ 最 适 碳 源 为 柠 檬 酸、
甘油 ；Bacillus subtilis NX-2 的最适碳源为淀粉和麦
芽糖，但它不能利用柠檬酸作为碳源［38］；Bacillus
licheniformis ATCC 9945a 以最佳碳源为葡萄糖和甘油
的组合［39］时，其 γ-PGA 的产量可达到 20.5 g/L，它
也是合成 γ-PGA 的主要菌株之一。Yao 等［40］运用
13C 核磁共振的方法跟踪检测 13C 标记的葡萄糖的结
果表明，葡萄糖作为一种速效碳源，主要是作为菌
体生长的营养物质，而添加的 L- 谷氨酸则被用来合
成 γ-PGA，对于谷氨酸依赖型的菌株来说是来自外
加的谷氨酸，对于非谷氨酸依赖型的菌株来说，其
碳源通过内循环能提供合成所需的谷氨酸。大多数
枯草芽孢杆菌以柠檬酸和葡萄糖作为最适宜的碳源，
以供合成 γ-PGA 所需要的能量。就降低合成成本［41］
考虑，宜用柠檬酸或葡萄糖作碳源。
4.2.2 氮 源 对 于 Bacillus sp. 而 言， 最 适 氮 源 包
括有机氮源和无机氮源。无机氮源如氯化铵、硫酸
铵、硝酸铵和尿素等，有机氮源包含豆浆、蛋白
胨、酵母抽提物、玉米浆、玉米浆干粉、黄豆饼粉
和花生饼粉等。无机氮源的组成比较清楚，但是营
养成分比较单一 ；而无机氮源营养比较丰富，含有
许多未知的促生长因子，能显著促进菌体的生长，
但是其组成成分不明确。不同的菌青睐不同的氮
源。如以豆浆作为 Bacillus licheniformis ATCC 9945a
的氮源，γ-PGA 的最高产量可以达到 35 g/L［42］；以
（NH4）2SO4 等作为 Bacillus subtilis IFO3335、Bacillus
subtilis PGS-1 的 氮 源， 在 发 酵 培 养 基 中 额 外 添 加
L- 谷 氨 酸 能 促 进 γ-PGA 的 合 成， 且 没 有 副 产 物
的 产 生［43］；用 酵 母 抽 提 物 代 替 硝 酸 铵，Bacillus
licheniformis CGMCC3336 的 γ-PGA 的产量比之前增
加 17%［44］。不同氮源对微生物的生长和目标产物的
产量具有重要的影响，表现为氮源不仅可以通过同
化作用转变成微生物自身的组成成分，如重要功能
性分子酶类和蛋白质等，而且也是某些目标产物合
成的原料来源，如氨基酸类产物中的氮元素的主要
来源。谷氨酸非依赖型菌株虽然 γ-PGA 产率较低，
但由于可用廉价原料代替价格偏高的谷氨酸，因此
在工业合成中有其实际应用意义。所以需要根据不
同菌株合理选择相适应的氮源。
4.2.3 金属离子 某些金属离子对 Bacillus sbutilis 的
γ-PGA 合成非常重要，K+、Mn2+、Fe3+、Mg2+ 和 Ca2+
等金属离子对枯草芽孢杆菌合成 γ-PGA 是必须的营
养成分之一［45］。低浓度的 Mn2+ 有利于枯草芽孢杆
菌自身的生长，进一步提高培养基中 Mn2+ 的浓度，
枯草芽孢杆菌的生长反而被抑制，尽管如此，发酵
液中 γ-PGA 的积累量仍然增加。同时 Cromwick 等［46］
发现可以通过改变培养基中的 Mn2+ 离子浓度来调节
某些芽孢杆菌产物 γ-PGA 的多聚体链中 D- 型或 L-
型谷氨酸的比例。同样，培养基中添加 Ca2+ 有利于
菌体内多肽的合成，其浓度对于菌体活性具有重要
的影响作用。在发酵合成 γ-PGA 的过程中，Mg2+ 可
能具有控制菌体内专一性很强的 D- 和 L- 多肽合成
酶系统的作用。随着枯草芽孢杆菌原生质体的获得，
2015,31(3) 31严涛等：微生物合成 γ-聚谷氨酸的相关基因、合成机理及发酵的研究进展
金属离子对 γ-PGA 发酵合成的影响作用将会得到进
一步深入研究。因此，培养基中金属离子种类和浓
度对 γ-PGA 的合成具有重要的影响作用。在发酵合
成 γ-PGA 的过程中有许多酶类参加反应，金属离子
对维持这些酶的活性中心构象和保持酶活性方面具
有重要的作用。
4.2.4 其他培养条件 除了碳源、氮源、金属离子
对 γ-PGA 合成造成影响外，还有一些盐类，如 NaCl
的加入，对其合成有一定的影响。有研究发现［32］，
加入一定浓度的 NaCl，可以减小发酵后期发酵液的
黏度，起到消泡的作用。其原因是加入的 NaCl 破
坏了 γ-PGA 形成的凝胶网络结构，甚至使 γ-PGA 的
黏弹性完全丧失，从而降低其黏度，但加入的 NaCl
量太高，会使发酵液中的渗透压过高，会导致细胞
脱水死亡，影响 γ-PGA 的产量 ；另外，培养条件对
其 γ-PGA 合成也有影响，如转速太低，传质不均匀，
溶氧不足 ；转速太高，对菌体产生的剪力越大，会
破坏菌体的细胞壁、细胞膜，不利于菌体的生长，
进而影响产物的生成［44］，因此需要选择合适的转速；
好氧微生物在生长过程中需要给菌体生长提供足够
的溶氧量，供氧量不足时，好氧微生物会在厌氧条
件下，其正常的生理代谢会受到影响［47］；另外，有
研 究 发 现［46］，Bacillus licheniformis ATCC 9945a 在
pH 维持在 6.5 时 γ-PGA 生成量最大，而 pH 小于 5.5
或大于 7.4 则 γ-PGA 生成量显著下降。培养条件的
研究对提高 γ-PGA 的产量具有重要作用，必须创造
适合于菌体产 γ-PGA 的最佳环境，才能让微生物发
酵出更多的 γ-PGA。
4.3 合成γ-PGA的发酵方式研究
发 酵 方 式 有 多 种， 如 液 体 发 酵、 固 体 发 酵、
固定化细胞发酵等。通过微生物的方式发酵合成
γ-PGA，常用的发酵方式为液体发酵，Cromwick 等［46］
以 Bacillus licheniformis ATCC 9945a 菌株在适宜的条
件下液体发酵 γ-PGA，其产量可达到 25 g/L。液体
发酵的优点是发酵过程中的参数容易控制，发酵周
期短，有利于后期分离提取，成本低廉，适合工业
化大生产。Chen 等［48］采用固态发酵，其培养成分
鸡粪、豆饼粉、麦麸用量为 1∶1∶0.2，0.5% 谷氨酸，
0.5% 柠 檬 酸， 含 水 量 65%， 通 过 Bacillus subtilis
CCTCC202048 固 体 发 酵， 可 得 到 42 g/L 的 γ-PGA。
另外，Xu 等［49］采用一种新型的有氧植物纤维床生
物反应器（APFB），对细胞进行固定化发酵，通过
发酵动力学进行分析，固定化细胞发酵表现出更高
效的 γ-PGA 产量，用这个 APFB 反应器进行分批补
料发酵，γ-PGA 的产量达到了 71.21 g/L。固态发酵
与液态发酵相比，其优点是设备和技术较简易，成本、
能源消耗低，培养基原料价格低廉、广泛易得。不
足之处是工艺参数难以控制，发酵速度慢，周期长，
后期分离纯化困难，离工业化生产还有一定的距离；
固定化细胞发酵，虽然其发酵 γ-PGA 的产量比较高，
但由于其发酵设备及相关技术有较高的要求，生产
成本高，目前还处于实验室阶段，不适合工业化大
生产。
综上所述，影响微生物产 γ-PGA 的原因，主要
包括内因（菌株本身的特性）和外因（培养基成分
及发酵方式）两方面。针对内因，可以通过构建工
程菌，从分子水平上来将菌种改造成合成所需要的
高产 γ-PGA 的菌株 ；针对外因，可以通过统计学的
方法（如 PB 设计，CCD 设计、正交实验、响应面
分析等）来进行培养基成分及培养条件的优化，为
微生物提供一个有利于产 γ-PGA 的环境，最大限
度的使菌株产 γ-PGA。另外，改变传统液态发酵方
式，改变发酵设备等，也能提高 γ-PGA 的产量。另
外，为了能迎合工业化大生产的需要，不仅是要提
高 γ-PGA 的产量，而且还要能降低合成成本，合成
可采用廉价的原料，如甘蔗、糖蜜［50］、玉米浆干
粉、牛粪堆肥、合成味精的残渣［51，52］等合成 γ-PGA。
本研究正在从廉价的培养基原料（如玉米浆干粉、
糖蜜、黄豆饼粉、麦麸等）着手，其成分为天然的
营养成分，营养丰富，价格低廉，适合作为工业化
大生产的原料，通过统计学的方法，已筛选出最佳
培养基配方，γ-PGA 的产量可达到 50 g/L。
5 展望
γ-PGA 最吸引人的特性在于它是水溶性的、无
毒、可生物降解、可食用等，这些特性使其有大量
潜在的商业应用前景［53］，目前研究得比较热门的菌
株主要是地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniforms）和枯
草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。而急需解决的是如
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.332
何降低合成成本、提高 PGA 的产量、控制产物分子
量等。根据国内外研究现状，γ-PGA 的未来研究方
向可向这些方面来发展 ：寻求廉价的适合工业化大
合成的原料，如玉米浆、黄豆饼粉等 ；筛选高效高
产的优良菌株，特别是谷氨酸非依赖型合成菌，并
对发酵条件进行优化 ；通过基因工程的手段，构建
工程菌，提高菌株本身的合成性能，进而增加 γ-PGA
的产量。目前，在国外，如日本味之素株式会社利
用纳豆菌对谷氨酸进行聚合，成功的生成了 PGA，
已经投入到商业化生产当中 ；Cell Therapeutics 公司
开发出了以 PGA 作为药物载体，用于治疗肿瘤的药
物——PGA- 紫杉醇药物，其产品已经在日本、中国
台湾、韩国及亚洲其他国家和地区上市销售。而国
内的研究工作大部分仅限于实验室，或者只有中小
规模的生产，且偏重于菌种和发酵工艺，对菌株合
成 γ-PGA 的基因层面、提取工艺研究相对较少。随
着研究的深入和基因改造手段的成熟，传统方法对
γ-PGA 产量的提高越来越有限，而通过对基因和代
谢流的改造，如提高关键酶的活性、增加正向调控
蛋白的浓度、敲除 γ-PGA 的降解基因等，将会扮演
越来越重要的角色。本研究组在分子层面，正在进
行通过基因同源重组［54，55］的方法，通过氨苄青霉
素作为筛选标记，敲除枯草芽孢杆菌中的降解酶基
因［56］，减少 γ-PGA 产物的降解，进而提高 γ-PGA
的得率。
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（责任编辑 狄艳红）