全 文 ：收稿日期:2010-03-08;修回日期:2010-07-16
基金项目:新疆维吾尔自治区科技公关重大专项(200831108)
作者简介:王春艳(1983), 女 , 博士研究生 , 研究方向为功能
食品与生物活性物质 。
通讯作者:王　强 , 研究员 , 博士生导师(E-mail)caaswang
qiang@hotmail.com。
油料蛋白
Neutrase和 N120P蛋白酶同步水解杏仁
蛋白制备杏仁短肽工艺研究
王春艳 ,田金强 ,王　强
(中国农业科学院 农产品加工研究所 ,北京 100193)
摘要:采用 Neutrase和 N120P蛋白酶同步水解杏仁蛋白制备杏仁短肽 , 以短肽得率(TCA-NSI)及
水解度(DH)为指标对制备工艺进行优化 ,并建立了回归模型。结合实际生产确定出了 Neutrase和
N120P蛋白酶水解杏仁蛋白的最适条件为:底物质量浓度 0.04 g/mL, pH6.0,水解温度 52.5℃,
Neutrase与 N120P复合酶比例 2∶1,复合酶用量 7 200U/g,水解时间 173.5 min。在此条件下 ,短肽
得率为 71.49%,水解度为 26.20%。
关键词:杏仁蛋白;Neutrase蛋白酶;N120P蛋白酶;杏仁短肽
中图分类号:TS229;TQ936.1　　 文献标志码:A　　 文章编号:1003-7969(2010)10-0025-05
PreparationofalmondoligopeptidesbyNeutraseandN120Penzymatic
hydrolysisfromapricotkernelprotein
WANGChunyan, TIANJinqiang, WANGQiang
(InstituteofProcessingforAgricultureProducts, ChineseAcademyof
AgriculturalSciences, Beijing100193, China)
Abstract:Apricot(PrunusarmeniacaL.)kernelproteinwashydrolyzedbyNeutraseandN120Pprote-
asessimultaneouslytopreparealmondoligopeptides.Theyieldofoligopeptidesandthedegreeofhydroly-
siswereusedasindexes, andthehydrolysisconditionswereoptimizedandtheregressionmodelswerees-
tablished.Theresultsindicatedthattheoptimalconditionswereasfolows:pH 6.0, temperature
52.5℃, massconcentrationofsubstrate0.04g/mL, enzymeactivityratioofNeutrasetoN120P2∶1, pro-
teasesdosage(basedonproteinmass)7 200U/g, time173.5 min.Undertheconditions, theyieldof
almondoligopeptideswas71.49%, andthedegreeofhydrolysiswas26.20%.
Keywords:apricotkernelprotein;Neutraseprotease;N120Pprotease;almondoligopeptides
　　杏仁是蔷薇科落叶乔木植物杏(Prunusarme-
niacaL.)的种仁 ,我国杏仁产量居世界前列 。杏仁
中蛋白质含量达 25%,其氨基酸组成平衡合理 ,营
养价值较高 [ 1] 。杏仁广泛用于食品加工的配料以
及冷榨杏仁油的提取 。榨油后的杏仁饼中蛋白质含
量高达 40%以上 ,可作为良好的蛋白质来源。但目
前仅有少量用于制备杏仁蛋白粉或加工饲料 ,且制
备的杏仁蛋白粉溶解性和功能性质较差 ,而大部分
杏仁饼被浪费 。因此 ,深入研究和开发杏仁蛋白资
源 ,生产高附加值产品成为杏仁蛋白加工中亟待解
决的问题 。
酶法水解制备功能性短肽具有反应条件温和 、
产物营养价值较高等特点。在目前报道的短肽制备
工艺中 , 多选用 Alcalase碱性蛋白酶作为工具
酶[ 2-4] ,虽然水解效果较好 ,但存在产品精制工艺繁
琐 ,脱盐困难等难题 ,而采用两种中性蛋白酶进行复
合酶水解不仅可获得较高的水解度和短肽得率 ,还
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可避免精制中的脱盐问题 。 Neutrase蛋白酶来源于
枯草芽孢杆菌 ,具有广泛的酶切作用位点;N120P酶
是由选育出的芽孢杆菌生产而得 ,主要作用于丙氨
酸 、缬氨酸以及芳香族氨基酸等参与组成的肽键 。
而甜杏仁饼中丙氨酸 、缬氨酸以及苯丙氨酸等氨基
酸含量占氨基酸总量 20%以上[ 5, 6] , 因此 Neutrase
和 N120P是研究水解杏仁蛋白的理想蛋白酶 。
本文以冷榨杏仁饼为原料 , 用 Neutrase和
N120P两种中性蛋白酶对其进行复合水解 ,研究水
解过程中水解度和短肽得率的变化 ,确定酶解制备
杏仁短肽的最佳工艺条件 ,以期为深入开发利用杏
仁蛋白资源及杏仁蛋白深加工提供参考。
1　材料与方法
1.1　主要材料 、试剂
　　杏仁蛋白粉:冷榨杏仁饼粉碎 ,过 100目筛制得
(新疆奥力克生态农业公司);Neutrase蛋白酶(酶活
力 1.611 ×105 U/g, Novo公司);N120P(酶活力
2.192×105 U/g, Kerry公司);Folin-酚试剂(Sigma
公司);其他试剂均为分析纯。
1.2　主要仪器 、设备
　　Kieletecanalysiser全自动凯氏定氮仪 (瑞典
Foss公司), SoxtecAvanti2050自动索氏总脂肪分析
系统(瑞典 Foss公司), CS501-SP超级数显恒温
器 , UV-1201紫外分光光度计 。
1.3　分析方法
1.3.1　杏仁饼中各组分的测定　水分测定:GB/T
5009.3— 2003;灰分测定:GB/T5009.4— 2003;蛋白
质测定:GB/T 5009.5— 2003;脂肪测定:GB/T
5009.6— 2003;粗纤维测定:GB/T5009.10— 2003;
总糖测定:苯酚硫酸法 [ 7] 。
1.3.2　蛋白酶活力的测定　Folin-酚法 [ 8] 。
1.3.3　可溶性氮的测定　Folin-酚法。
1.3.4　短肽得率测定　三氯乙酸(TCA)可溶性氮
法 [ 9] 。
　　 短肽得率 =N1 /N0 ×100%
式中:N1———在 10%TCA中可溶性氮含量 , mg;
N0———原料中总氮含量 , mg。
1.3.5　水解度(DH)的测定　OPA法 [ 10, 11] 。
1.4　杏仁短肽的制备
1.4.1　单因素试验　基于 Novo公司和 Kerry公司
推荐的 Neutrase和 N120P酶适宜作用条件 ,确定复合
酶水解的单因素试验条件。酶水解基本条件定为:底
物质量浓度 0.04g/mL, Neutrase和 N120P复合酶比
例 2∶1,酶总用量 3 000 U/g(以蛋白质量为基准),
pH6.0,水解温度 55℃,水解时间 180 min。反应结
束后 90℃水浴 15 min灭酶 ,定容至 250 mL,测定短
肽得率和水解度。改变其中 1个条件 ,固定其他条件
分别考察复合酶比例 、复合酶用量 、水解 pH、底物质
量浓度 、水解温度和水解时间对短肽得率和水解度的
影响。
1.4.2　正交旋转组合试验　根据单因素试验结果 ,
选择适当的试验因素及水平 ,进行正交旋转组合试
验 ,以优化确定最佳水解条件 。
2　结果与分析
2.1　杏仁饼组成(见表 1)
表 1　杏仁饼的组成 %
蛋白质 脂肪 灰分 粗纤维 总糖 水分
51.52 7.00 4.79 7.83 25.2 3.67
2.2　复合酶水解制备杏仁短肽单因素试验
2.2.1　Neutrase和 N120P复合酶比例的确定　Neu-
trase和 N120P酶按 2∶5、1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2
(酶活比)比例添加 ,其他条件同 1.4.1,考察复合酶
比例对短肽得率和水解度的影响 ,结果见图 1。
图 1　酶比例对短肽得率和水解度的影响
　　由图 1可看出 ,短肽得率和水解度随 Neutrase比
例的增大呈先增加后降低趋势 ,当 Neutrase与 N120P
酶活比为 2∶1时均达到最大 ,因此确定适宜的复合酶
比例为 2∶1。
2.2.2　复合酶用量的确定　试验以酶用量 550 U/
g为基础进一步提高复合酶的用量 ,来研究酶用量
对短肽得率和水解度的影响 ,结果见图 2。
图 2　复合酶用量对短肽得率和水解度的影响
26 CHINAOILSANDFATS　　　　　　　　　　　　　　2010 Vol.35No.10
　　由图 2可见 ,在水解初期 ,大分子蛋白迅速减
少 ,小分子肽迅速增加;当酶用量达到 5 400 U/g
时 ,短肽得率和水解度分别达到(56.84±1.59)%
和(15.14±0.33)%;继续增加酶用量短肽得率和
水解度增幅变缓 。这是因为此时底物饱和 ,蛋白酶
的作用位点已经大大减少 ,再进一步增加酶用量对
提高短肽得率的效果已不显著 ,尽管此时蛋白酶仍
会产生作用 ,但体系中的水解度上升非常缓慢 。
2.2.3　水解 pH的确定　pH对酶促水解反应的影
响可通过改变酶的空间构象和底物的解离状态 ,进
而影响底物与酶的结合[ 12] 。一般来说 ,一种酶仅在
一个狭窄的 pH范围内才具有最高的活力 ,即酶的
最适 pH。试验分析了 pH在 5.0 ～ 8.5范围内体系
短肽得率和水解度的变化 ,结果见图 3。
图 3　pH对短肽得率和水解度的影响
　　由图 3可见 ,随着 pH的升高 ,短肽得率和水解
度均呈先增大后降低趋势 ,并在 pH为 6.0时 ,二者
达到最大值 ,分别为(64.88 ±1.59)%和 (17.15±
0.88)%。当体系 pH超过 6.5时 ,短肽得率和水解
度相比于 pH6.0时呈现迅速下降趋势。因此 ,选择
pH6.0 ～ 6.5作为复合酶水解的最适 pH。
2.2.4　底物质量浓度的确定　试验分析了底物质
量浓度在 0.005 ～ 0.10g/mL范围内 ,短肽得率和水
解度的变化 ,结果见图 4。
图 4　底物质量浓度对短肽得率和水解度的影响
　　由图 4可知 ,底物质量浓度在 0.01 ～ 0.10 g/mL
范围内 ,体系存在底物抑制现象 ,即随着底物质量浓
度的增加短肽得率和水解度均有所下降。过高底物
质量浓度易造成水解液黏度增大 ,影响蛋白酶扩散 ,
降低水分活度 ,对水解反应有抑制作用 。底物质量
浓度在 0.005 ～ 0.01 g/mL范围内短肽得率和水解
度差异不显著 ,当底物质量浓度为 0.01 g/mL时短
肽得率和水解度最大。但在实际生产中底物质量浓
度过低造成生产效率低 ,因而不宜选择过低的底物
质量浓度 。
2.2.5　水解温度的确定　试验分析了 40 ～ 65℃范
围内短肽得率和水解度的变化 ,结果见图 5。
图 5　水解温度对短肽得率和水解度的影响
　　由图 5可见 ,复合酶的作用温度范围较宽 ,在
40 ～ 55℃都具有较强的活性 。短肽得率和水解度
随水解温度升高均呈先增加后降低趋势 , 50℃时水
解度达最大值(17.16±0.33)%, 55℃时短肽得率
达到最大值(55.15±1.03)%,超过 55℃后体系短
肽得率和水解度则迅速下降 。酶催化反应都有其最
适温度 ,一般在酶的最适温度以下 ,随着温度的升高
反应物的能量和分子间有效接触的频率增加 ,因而
反应速度加快 。当温度上升到一定程度时 ,酶分子
吸收了过多的能量 ,引起了维持酶分子结构的次级
键解体 ,导致酶变性 ,从而使得酶活性减弱或丧失 。
2.2.6　水解时间的确定　不同水解时间对短肽得
率和水解度的影响见图 6。
图 6　水解时间对短肽得率和水解度的影响
　　由图 6可见 ,随着水解时间的延长 ,短肽得率和
水解度总体呈上升趋势。在水解 150 min时 ,短肽
得率和水解度分别达到(73.88±0.68)%和(19.94±
0.38)%,而后继续水解 ,短肽得率和水解度虽然仍
有所上升 ,但到 270 min时上升幅度仅为 2.01%和
0.81%。这可能是因为在水解过程中 ,酶切位点逐
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渐减少 ,反应达到一定程度时 ,即使继续水解 ,能够
与蛋白酶发生作用的底物也越来越有限。
2.3　正交旋转组合试验
　　根据单因素试验结果 , 确定水解 pH为 6.0,
Neutrase和 N120P复合酶比例为 2∶1,着重研究复合
酶用量 、水解温度 、底物质量浓度 、水解时间 4个因
素。以短肽得率和水解度为指标 ,选用四元二次正
交旋转组合设计进行研究 ,以确定最佳水解条件。
试验因素水平编码见表 2,试验设计及结果见表 3。
表 2　因素水平
水平编码 水解温度 /℃X1
复合酶用量 /(U/g)
X2
底物质量浓度 /(g/mL)
X3
水解时间 /min
X4
1.682 65.0 7 200 0.08 210
1 59.5 5 851 0.066 173.5
0 52.5 3 875 0.05 120
-1 45.1 1 898 0.032 66.5
-1.682 40.0 550 0.02 30
表 3　正交旋转试验结果
试验号 X1 X2 X3 X4 短肽得率/%
水解度
/%
1 1 1 1 1 52.54 21.29
2 1 1 -1 -1 59.58 27.04
3 1 -1 1 -1 41.47 15.07
4 1 -1 -1 1 57.54 28.02
5 -1 1 1 -1 46.68 24.21
6 -1 1 -1 1 63.22 30.56
7 -1 -1 1 1 49.32 19.50
8 -1 -1 -1 -1 57.75 24.80
9 -1.682 0 0 0 53.89 23.84
10 1.682 0 0 0 46.38 18.68
11 0 -1.682 0 0 50.51 24.40
12 0 1.682 0 0 59.21 29.08
13 0 0 -1.682 0 70.32 30.57
14 0 0 1.682 0 48.20 19.37
15 0 0 0 -1.682 51.52 23.31
16 0 0 0 1.682 60.47 27.58
17 0 0 0 0 58.46 27.49
18 0 0 0 0 56.40 27.69
19 0 0 0 0 60.00 27.48
20 0 0 0 0 61.03 26.97
21 0 0 0 0 59.23 26.49
22 0 0 0 0 60.00 26.49
23 0 0 0 0 59.30 26.49
2.3.1　模型的数学分析　采用 DPS数据处理系统
用标准多项式回归方法对试验数据进行拟合 ,剔除
α=0.05显著水平不显著项后 ,得到短肽得率的回归
方程为:Y=59.178 42-1.352 45X1 +12.238 55X2 -
6.244 58X3 +2.357 21X4 -3.171 52X21 -1.500 98X22 -
1.099 7X24;水解度的回归方程为:Y=26.983 78 -
1.195 59X1 +1.726 66X2 -3.601 57X3 +1.129 93X4 -
1.991 44X22 -0.679 75X23 -0.511 82X24 -0.653 75X1X2 -
0.881 25X1X3 +0.768 75X1X4。
对表 3试验结果进行方差分析 ,结果见表 4。
表 4中短肽得率和水解度的回归方程显著性检
验的 F值分别为 69.655 1及 39.172 1,且 p<0.01,
表明回归方程达到极显著水平 ,反映出该方程式在
试验点上与试验结果相吻合 。失拟性检验 F值分
别为 2.224 05及 0.983 168,说明回归方程无失拟
因素存在(p>0.05)。水解温度 、复合酶用量 、底物
质量浓度和水解时间的影响均较大(p<0.05),以
短肽得率为指标时各因素的交互作用不显著 (p>
0.05),而以水解度为指标时 X1X2、X1X3 、X1X4间存
在显著的交互作用(p>0.05)。
　　综合考虑各指标 ,通过求方程偏导得出 4个因
素对于指标的最优水平分别为:X1 =0.000 0, X2 =
1.681 8, X3 =-1.681 8, X4 =1.000 0,即复合酶水
解制备杏仁短肽最佳工艺条件:水解温度 52.5℃,
复合酶用量 7 200 U/g,底物质量浓度 0.02 g/mL,
水解时间 173.5 min。
表 4　试验结果方差分析
项　目 F 平方和 剩余平方和 均方 决定系数 R2 调整决定系数 R2adj p
短肽得率 69.655 1 343.121 5 4.926 005 31.192 87 0.985 8 0.971 7 <0.001
水解度 39.172 1 928.407 0 23.700 68 84.400 64 0.975 1 0.950 2 <0.001
2.3.2　最优工艺参数的选取　由回归模型可知 ,反
应最适底物质量浓度为 0.02 g/mL,底物质量浓度
值较低。由于生产时提高底物质量浓度可以减少能
耗 、提高设备利用率 ,因而实际生产中可根据模型选
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用较高底物质量浓度 。因此 ,在模型得出的最佳工
艺基础上 ,提高底物质量浓度以得出较适宜的操作
条件 ,结果见表 5。由表 5可见 ,选取 0.04 g/mL作
为适宜的底物质量浓度 ,其他因素均为最优条件 ,短
肽得率为 (71.49 ±1.48)%, 水解度为 (26.20 ±
0.35)%。
表 5　不同底物质量浓度下的短肽得率和水解度
底物质量浓度
/(g/mL)
短肽得率
/%
水解度
/%
0.02 82.42±2.27a 34.10±5.25a
0.03 75.82±1.22b 30.71±0.25ab
0.04 71.49±1.48c 26.20±0.35c
0.05 66.74±0.39d 20.97±0.58d
0.06 61.86±1.58e 15.28e
　注:a、b、c、d、e表示显著性差异 , p<0.05。
3　结　论
　　采用 Neutrase和 N120P中性蛋白酶作为工具
酶水解杏仁蛋白制备杏仁短肽 ,通过单因素试验和
正交旋转组合试验建立了水解度和短肽得率与各影
响因素间的回归模型 。结合实际生产 , 确定 Neu-
trase与 N120P复合酶水解杏仁蛋白的最佳条件为:
水解温度 52.5℃, Neutrase与 N120P复合酶比例
2∶1,复合酶用量 7 200 U/g,底物质量浓度 0.04 g/
mL,水解时间 173.5 min。在此条件下短肽得率为
71.49%,水解度为 26.20%。
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