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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
苯酚是石油化工、印染、纺织和煤气等工业废
水中重要的污染物之一［1］。含酚废水排入水体，在
较低浓度时（5-25 mg/L）即可对鱼类的生存构成
威胁［2，3］。
当前，降解酚废水的方法有多种，其中生物处
理技术因投资小、二次污染少、运行成本低、处理
效率高等优点而得到广泛的应用［4，5］。但是高浓度
含酚废水对微生物生长有明显的抑制作用，限制了
含酚工业废水生物处理技术的推广和应用。因此，
获得具有高活力的降酚菌种成为这一技术推广和应
收稿日期 ： 2013-09-30
基金项目 ：山西省青年科技研究基金项目（2013021023-3）
作者简介 ：葛启隆，男，硕士，研究方向 ：环境微生物 ；E-mail ：geqilongde@163.com
通讯作者 ：王国英，博士，讲师，E-mail ：deinvo@126.com
波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究
葛启隆  王国英  岳秀萍
（太原理工大学环境科学与工程学院，太原 030024）
摘 要 ： 从活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌，经形态特征、生理生化试验及 16S rDNA 鉴定，该菌株为波茨坦短
芽孢杆菌。该菌能以苯酚为唯一碳源和能源，最佳降解条件为 ：温度 30℃，初始 pH7.0，摇床转速为 160 r/min。苯酚降解试验表
明，该菌可在 72 h 内将初始浓度为 1 600 mg/L 苯酚完全降解。随着苯酚浓度的增加，底物抑制作用增强。应用 Haldane 方程对菌
株的生长过程进行动力学模拟，拟合曲线与试验测定值相关性良好，各参数分别为 μmax（最大比增长率）0.334 h
-1，Ks（半饱和常数）
14.07 mg/L，Ki（抑制常数）196.89 mg/L，且该菌株苯酚降解动力学与其生长动力学表现出相似的趋势。代谢机制研究表明，苯酚
可诱导该菌合成邻苯二酚 1，2-加氧酶降解苯酚。
关键词 ： 波茨坦短芽孢杆菌 苯酚 生物降解 动力学
Phenol Degradation by Brevibacillus borstelensis and Kinetic Analysis
Ge Qilong Wang Guoying Yue Xiuping
（College of Environmental Science and Engineering，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024）
Abstract:  An effective phenol-degrading strain was isolated from activated sludge, and was identified as Brevibacillus borstelensis
based on morphological, biochemical, physiological experiments and 16S rDNA gene sequence analysis. The strain could utilize phenol as sole
carbon and energy source and the optimum degradation condition were temperature of 30℃, initial pH7.0 and shaking speed of 160 r/min. The
biodegradation experiment indicated that the strain could completely degrade 1 600 mg/L phenol in 72 h. Also, the results showed that the higher
the phenol concentration was, the stronger the substrate inhibition imposed. The process of its growth was also investigated using Haldane kinetic
model. The parameters were ：μmax（maximum specific growth rate）=0.334 h
-1, Ks（half-satruration constant）=14.07 mg/L, Ki（inhibition
constant）=196.89 mg/L. The phenol degradation kinetics of the strain followed a similar trend to that of its growth. Metabolic pathway research
showed that the strain could be induced to synthesize extracellular catechol-1, 2-dioxygenase.
Key words:  Brevibacillus borstelensis Phenol Biodegradation Kinetics
用的关键。研究表明，苯酚能被多种微生物降解，
主要包括假单胞菌（Pseudonomonas.sp）［6］、酵母菌
（Yeast trichosporon）［7］、 根 瘤 菌（Rhizobia）［8］、 醋
酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）［9］等，其中，大部
分研究主要集中在酵母菌与假单胞菌，而对短芽孢
杆菌属（Brevibacillus. sp）的研究鲜见报道。
此外，建立动力学模型表征菌株生长和苯酚降
解能力对于理论研究和实际应用也有重要的指导意
义，一般对单底物生物降解，采用 Monod 动力学
模型描述细菌的比生长速率［6］，而对于苯酚、甲
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期118
苯等自抑制物质，基质抑制型的 Haldane 方程更为
适合［10，11］。
本研究从驯化的活性污泥中分离筛选到一株高
效苯酚降解菌株，对该菌株进行鉴定，研究其苯酚
降解特性，并对其生长过程进行动力学研究。
1 材料与方法
1.1 材料
LB 富集培养基 ：用于细菌的富集与活化，成
分（g/L）胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 ：5，NaCl ：10，
pH7.0。
选择培养基 ：用于苯酚降解菌的培养筛选及性
能测定，成分（g/L）：NH4NO3 ：0.5，Na2HPO4·7H2O
7.9 ；KH2PO4 1.5 ；MgSO4·7H2O 0.1，微量元素溶液
2 mL，pH7.0，苯酚利用 0.2 μm 孔径纤维膜过滤除菌，
在接种前按需要量加入培养基中。
微量元素溶液成分（g/L）：EDTA 50.0 ；ZnSO4
2.2 ；CaCl2 5.5 ；MnCl2·4H2O 5.06 ；FeSO4·7H2O 5.0 ；
（NH4）6Mo7O2·4H2O 1.1 ；CuSO4·5H2O 1.57 ；CoCl2·
6H2O 1.61。
上述培养基在 121℃条件下高压蒸汽灭菌 20
min，固体平板和斜面培养基均在上述培养基中加入
2% 的琼脂粉。
1.2 方法
1.2.1 活性污泥的驯化 活性污泥取自太原市某焦
化厂废水生物处理系统，在液体选择培养基中利用
苯酚作为唯一碳源进行梯度驯化，驯化的同时对水
质进行监测并观察微生物相，根据驯化情况逐步增
加苯酚浓度（最后达到 1 600 mg/L）驯化约 2 个月后，
活性污泥体系基本达到稳定。
1.2.2 菌种的分离纯化 驯化后的活性污泥经稀释
后，置于含 10 mL LB 培养基的 100 mL 三角瓶中，
在 30℃，160 r/min 下摇床培养 24 h。再以得到的菌
悬液按 5% 的接种量接种于 LB 培养基中，再次富
集培养 72 h。将所得培养液转接到苯酚浓度为 500
mg/L 的选择培养基中，在 30℃，160 r/min 下培养 36 h。
取 1 mL 培养液倍比稀释，涂布于 LB 培养基平板上，
于 30℃恒温培养箱中倒置培养，然后根据菌落形态
（菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、
边缘形状和菌落颜色的差别）挑取高度分散的单菌
落至 LB 培养基斜面上，保存在 4℃的冰箱中。
1.2.3 菌种的复筛 将初筛的菌株分别接种至装有
10 mL LB 培养基的三角瓶中，在 30℃，160 r/min 摇
床中连续活化 2 代，并将次级培养物活化至 OD600
为 1.2 左右，作为接种体使用。
按 5% 的接种量将次级培养物接种到 50 mL 选
择培养基（苯酚浓度为 1 000 mg/L）中，摇床培养，
每隔一定时间检测培养物中苯酚浓度，选取同一降
解时间内苯酚降解率最大的菌株。
1.2.4 菌种鉴定 参照文献［12］进行该细菌的生
理生化鉴定，试验结果根据文献［13］进行检索鉴定。
16S rDNA 测序由上海生工生物工程股份有限公司
完成。
1.2.5 最适降解条件优化 将筛选出的细菌种子液
接种至含 1 600 mg/L 苯酚的模拟含酚废水中进行温
度（20、25、30、35、40）、pH（5.0、6.0、7.0、8.0、
9.0）和振荡速率（120、140、160、180、200 r/rmin）
等降酚条件进行优化，根据 70 h 后残余苯酚浓度和
菌体浓度，绘制生长曲线和降酚曲线，所有试验均
重复 3 次。
1.2.6 细胞粗酶液提取 将筛选出的菌株分别接种
到含 200 mg/L 苯酚的选择培养液和 LB 培养基中，
30℃，160 r/min 摇床培养，取对数生长期后期菌液
10 mL，4℃，10 000 r/min 高速离心 8 min，收集菌体，
上清液留取待用，用 pH7 磷酸盐缓冲液将菌体清洗
两次，然后重悬细胞，置于冰水混合物中，用超声
破碎仪破碎细胞，再次离心 20 min，收集上清液即
为粗酶［14］。
1.2.7 分析方法 采用紫外可见分光光度法测定培
养液的吸光度 OD600，细胞干重采用干燥恒重法测量，
建立 OD600 和细胞干重的线性关系式。干燥恒重法是
取培养液，7 500 r/min 离心 10 min，收集菌体并用
无菌水洗涤，将湿菌体置于 105℃干燥箱中干燥 24 h，
冷却至室温称重，如此重复烘至恒重，得菌体干重。
苯酚浓度测定采用 4-氨基安替比林比色法测定［15］。
邻苯二酚 -1，2-加氧酶（C12O）活力及邻苯二酚 -2，
3 加氧酶（C23O）活力测定 ：分别以单位时间内反应
产物（黏糠酸）在 260 nm 处吸光度变化与反应产物（2-
羟基黏糖酸半醛）在 375 nm 处吸光度变化表示［16］，
测定系统总体系 9 mL，内含 0.3 mmol/L 反应底物 8.01
2014年第3期 119葛启隆等 ：波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究
mL，磷酸缓冲液（pH7.0）0.39 mL 和 0.6 mL 粗酶液，
以磷酸缓冲液为参比。定义 C12O（或 C23O）活力单
位（U）为 25℃条件下每分钟反应产生 1 μmol 黏糠
酸（或 2-羟基粘糖酸半醛）所需酶量。总蛋白含量
用 Bradford 法测定［17］，酶的比活力以每毫克的蛋白
质中所含酶的活力单位数计算。
2 结果
2.1 菌种的筛选与鉴定
从活性污泥中分离、纯化得到 37 个单菌落，应
用涂布画线等纯化手段，得到 9 株具有较高降酚能
力的菌株，再根据苯酚降解试验进一步复筛得到一
株苯酚降解速率最高的菌株。显微镜观察下该菌体
大小为（0.35-0.45）μm×（2-8）μm，呈杆状、有
芽孢、无鞭毛，菌落特征表现为圆形、乳白色、表
面光滑、不透明，其生理生化部分生理生化特性
鉴定如表 1 所示。经 16S rDNA 测序获得的序列与
GenBank 数据库中已收录的 16S rDNA 基因序列进
行同源性比较分析得，该菌株 16S rDNA 基因序列
（GenBank 登 录 号 ：KF052620） 与 GenBank 数 据 库
中菌株 Brevibacillus borstelensis 具有 99% 的同源性，
结合其个体形态特征、菌落形态特征、生理生化试
验及 16S rDNA 序列分析，将该菌种定为波茨坦短芽
孢杆菌（Brevibacillus borstelensis）。
表 1 菌株的生理生化特性
试验项目 结果 试验项目 结果
生化试验 同化生长试验
革兰氏染色 - 葡萄糖 +
明胶液化 + 琥珀酸 +
硝酸盐还原 + 柠檬酸 +
柠檬酸盐利用 + 苯酚 +
氧化酶 - 碳酸钠 -
淀粉水解 - 乙醇 -
V.P 反应 - 酒石酸钾钠 -
吲哚试验 - 亚硝酸盐 +
甲基红反应 - 硝酸盐 +
2.2 温度对波茨坦短芽孢杆菌生长和降酚能力的
影响
温度对波茨坦短芽孢杆菌生长和降酚能力的影
响如图 1。当温度小于 30℃时，菌体生长及其苯酚
的去除率随温度的升高而增大 ；在 30-35℃范围内，
菌体生长及其苯酚去除率略有降低 ；进一步提高温
度，菌体生长及苯酚去除率随温度的升高迅速降低。
30℃时，OD600 值达到最大，此时苯酚的去除率也最
高。这可能是由于温度过低时，胞内酶的活性受到
抑制而温度过高可引起酶蛋白质变性，使波茨坦短
芽孢杆菌的降酚能力下降。所以，选择 30℃作为波
茨坦短芽孢杆菌生长和降酚的最适温度。
100 䱽䞊⦷
OD600
90
80
70
60
50
40㤟䞊
䱽䀓
⦷%

O
D
60
0
30
20
10
0
15 20 25 30⑙ᓖć 35 4540
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
图 1 温度对菌体生长及苯酚降解的影响
2.3 pH对波茨坦短芽孢杆菌生长和降酚能力的
影响
如图 2 所示，当 pH 小于 7 时，菌体生长及其
苯酚的去除率随 pH 的升高而增大 ；进一步提高 pH，
菌体生长及苯酚的去除率趋于稳定；当 pH 大于 8 时，
苯酚的去除率随 pH 的升高而降低。这可能是由于
pH 过高时，会抑制波茨坦短芽孢杆菌的生长和降酚
酶的活性 ；当 pH7.0 时，波茨坦短芽孢杆菌的生长
最旺盛，苯酚的去除率高达 93.25%，故确定培养基
初始 pH 值为 7.0。
2.4 摇床转速对波茨坦短芽孢杆菌生长和降酚能
力的影响
波茨坦短芽孢杆菌对苯酚的降解是好氧过程，
氧气量可影响其降酚能力。摇床转速对波茨坦短芽
孢杆菌生长及降酚的影响结果如图 3 所示，随着振
荡速率的增加，溶解氧浓度大大增加，波茨坦短芽
孢杆菌生长迅速，降酚速率陡增 ；当摇床转速达到
160 时，降酚速率渐趋稳定，趋于最大值 ；振荡速
率大于 160 r/min，氧气已不再为波茨坦短芽孢杆菌
降酚的限制因素。虽然提高通氧量可以提高降酚率，
但也会加大能耗，综合考虑，本试验选择 160 r/min
作为最佳摇床转速。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期120
随着苯酚浓度的增加，底物抑制作用在增大。100
90
80
70
60
50
40㤟䞊
৫䲔
⦷%

O
D
60
0
30
20
10
0
4 5 6 7
pH
8 109
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6䱽䞊⦷
OD600
图 2 pH 对菌体生长及苯酚降解的影响
100
90
80
70
60
50
40㤟䞊
৫䲔
⦷%

O
D
60
0
30
20
10
0
100 120 140 160 180᩷ᒺ䖜䙏r/min 200 240220
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
䱽䞊⦷
OD600
图 3 摇床转速对菌体生长及苯酚降解的影响
2.5 苯酚降解试验
根据实际情况进行了温度、pH 值和转速对苯酚
降解影响的试验，确定了最适宜降解工艺条件 ：培
养温度为 30℃，选择培养基初始 pH 为 7.0，摇床转
速为 160 r/min。
以 5% 的初始接种量接种到初始苯酚浓度分别
为 1 200、1 400 和 1 600 mg/L 的选择培养基中。细
胞生长曲线及苯酚降解曲线如图 4。苯酚浓度为
1 200、1 400、1 600 mg/L 时，细胞生长延滞期分别
为 20、24、32 h，苯酚浓度越高，延滞期越长。菌
株处于指数生长期时，细胞浓度快速增长，底物降
解较快。从图 4 也能看出，随着苯酚浓度的增加，
最终细胞浓度也相应提高。但是初始苯酚浓度从
1 200 mg/L 增加到 1 400 mg/L 时，最终细胞浓度约增
加了 36.7 mg/L，而从 1 400 mg/L 增加到 1 600 mg/L 时，
最终细胞浓度只增加了 17.9 mg/L。这表明苯酚的消
耗并不是完全用来生成新的细胞，而是被用来克服
强烈的底物抑制作用。表明了在高浓度苯酚溶液中，
㤟䞊
⎃ᓖ
mg
/L

200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0
0 6 12 18 24 30 36ᰦ䰤h42 48 66 726054
㧼փ
⎃ᓖ
mg
/L

200
300
400
500
100
0
1 600 mg/L
1 400 mg/L
1 200 mg/L
图 4 菌体生长曲线和苯酚降解曲线
2.6 动力学研究
本研究用 Haldane 方程描述高浓度苯酚降解动
力学，方程式为 ：μX=μmax S/（KS+S+S
2/Ki）
式中，μ 为细胞比生长速率（h-1）；μmax 为最大
比生长速率（h-1）；S 为限制性底物质量浓度（mg/L）；
KS 为饱和常数（mg/L）；Ki 为抑制常数（mg/L）。
动力学试验选取苯酚初始浓度范围为 ：0-100
mg/L 之 间， 每 20 mg/L 一 个 浓 度 梯 度 ；100-600
mg/L 之间，每 100 mg/L 一个浓度梯度 ；600-1 600
mg/L 之间，每 200 mg/L 一个浓度梯度。对每一个
初始苯酚浓度 S，比生长速率 μ 由指数生长期决定。
对每一个摇瓶指数生长期的细胞含量和时间的半对
数图做线性最小二乘拟合得到 μ。
将试验所得数据应用 Matlab 软件利用非线性最
小二乘法拟合，试验所得细胞生长 Haldane 方程拟
合曲线如图 5 所示，试验数据与模型预测吻合良好。
方程动力学参数为 ：μmax=0.334 h
-1，KS=14.07 mg/L，
Ki=196.89 mg/L（R
2=0.992）。 从 图 5 可 以 看 出， 随
着苯酚浓度的减少，比生长速率逐渐增大，在 52.63
mg/L 时达到最大值。这是由于随着苯酚浓度的减少，
底物抑制作用逐渐减弱。低于 52.63 mg/L 时，随着
苯酚浓度的减少，比生长速率急剧下降。这是由于
苯酚浓度较低时，培养基中缺乏足够的碳源供细胞
生长，使得底物限制作用起主导作用。
2.7 相关酶的活性
在有氧气条件下，通过测定波茨坦短芽孢杆菌
2014年第3期 121葛启隆等 ：波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究
式中，μx，μs，，，，m 均为常数，分别表示微生
物菌体比生长速率（h-1），苯酚比消耗速率（h-1），
产物比生成速率 ；细胞生长得率系数，产物生成得
率系数及维持系数。由 Luedeking-Piret 方程可将产
物比生成速率与菌体比生长速率进行关联 ：
qp=αμx+β （3）
式中，α，β 分别为菌体生长相关系数和非生长
相关系数，均为常数 ；可将公式改写为 ：
μs=（1/Yx/s+α/Yp/s）μx+（m+β/Yp/s） （4）
令 M=1/Yx/s+α/Yp/s，N=m+β/Yp/s，则
上式可写为 ：
μs=Aμx+B （5）
M，N 均为常数。由此可见，苯酚比消耗速率
与菌体比生长速率二者动态变化有相似的趋势。应
用 Matlab 软件对试验数据拟合得，M=0.76，N=0.047
h-1，回归分析的复相关系数为 R2=0.988，说明回归
分析能够确切的描述试验数据。
在有氧条件下苯酚被苯酚羟化酶转化为邻苯二
酚，邻苯二酚进一步被邻苯二酚 1，2-双加氧酶或
邻苯二酚 2，3-加氧酶催化进行邻位或间位开环［23］，
由上述试验结果推断该菌株降解苯酚以邻位开环降
解为主。菌体破碎后上清液中邻苯二酚 1，2-双加氧
酶的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，这表
明该酶为胞内酶。以 LB 培养基（不含苯酚）为基
质的两种上清液酶的活性均未检测到，说明该菌株
邻苯二酚 1，2-加氧酶是诱导酶。
4 结论
从活性污泥中分离得到一株具有较高活力的苯
酚降解菌，经鉴定为波茨坦短芽孢杆菌。该菌株可
利用苯酚作为唯一碳源和能源进行苯酚降解，降酚
0.25
0.20
0.15
0.10
㓶㧼
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0.05
0.00
0 200 400 600 800 1000ࡍ࿻㤟䞊⎃ᓖmg/L1200 18001400 1600
䈅傼ᮠᦞ
Haldane模型
图 5 试验数据与方程回归曲线对比
粗酶液中邻苯二酚 1，2-加氧酶和邻苯二酚 2，3-加
氧酶的活性，初步判断该菌株降解苯酚的代谢途径。
菌株粗酶活性检测如表 2 所示，在以苯酚为唯一碳
源的无机盐培养液中，菌体粗酶液中邻苯二酚 1，2-
加氧酶的比活力为 0.269 U/（mg protein），而邻苯二
酚 2，3-加氧酶的比活力仅为 0.007 U/（mg protein）。
表 2 不同基质中邻苯二酚双加氧酶的比活力
基质
邻苯二酚 2，3-
加氧酶比活力
U/（mg protein）
邻苯二酚 1，2-
加氧酶比活力
U/（mg protein）
LB 培养基 上清液 未检测到 未检测到
LB 培养基 粗酶液 未检测到 未检测到
选择培养基 上清液 0.001±0.0003 0.009±0.0033
选择培养基 粗酶液 0.007±0.0026 0.269±0.0041
3 讨论
随着培养基中的苯酚浓度的提高，底物抑制作
用越强，降解难度增大，细菌相应细胞得率越小，
导致细胞生长的停滞期越长。菌株处于对数生长期
时，细胞浓度快速增长，底物降解较快。当苯酚等
营养成分被大量或者完全利用后，菌株进入稳定期，
细胞浓度增长速率开始下降。试验所得动力学参数
值与其他文献的动力学参数数值的比较（表 3）可
以看出，本研究分离得到的波茨坦短芽孢杆菌菌株
的动力学参数数值在文献范围之内，具有较大的μmax，
表明该菌株有较强的苯酚降解能力。
苯酚的消耗速率取决于 3 个因素 ：细胞生长速
率、底物消耗于维持能量的速率、产物生成速率和。
因此，底物的消耗可用如下动力学模型表示 ：
μs=1/Yx/sμx+m+1/Yp/sqp （2）
表 3 不同微生物的苯酚降解动力学 Haldane 方程参数
菌种
μmax
（h-1）
KS
（mg/L）
Ki
（mg/L）
温度
（℃）
pH
波茨坦短芽孢杆菌
（本研究）
0.334 14.07 196.89 30 7.2
恶臭假单胞菌［18］ 0.217 24.40 121.70 30 7.2
Candida albicans［19］ 0.315 19.54 208.57 35 6.5
Alcaligenes faecalis［20］ 0.150 22.20 245.40 25 7.0
热带假丝酵母［21］ 0.481 11.71 207.88 30 6.0
菌群［22］ 0.405 55.44 970.33 32 7.0
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期122
能力达到 1 600 mg/L。在苯酚的生物降解过程中，
由苯酚羟化酶催化转化为邻苯二酚，再由邻苯二酚
1，2-双加氧酶将其转化为黏糖酸，邻苯二酚 1，2-
双加氧酶是该菌株催化邻苯二酚开环的诱导型关
键酶。
参 考 文 献
［1］ Wei GH, Yu JF, Zhu YH, et al. Characterization of phenol
degradation by Rhizobium sp.CCNWTB 701 isolated from Astragalus
chrysopteru in mining tailing region［J］. Journal of Hazardous
Materials, 2008, 151（1）：111-117.
［2］ Lu DB, Zhang Y, Niu SQ, Wang LT. Study of phenol biodegradation
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（责任编辑 李楠）