全 文 ：拟南芥 WRKY2 转录调控因子可能参与调控渗透胁迫反应 ?
江文波1 ,2 , 余迪求1
??
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 , 云南 昆明 650223 ; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049)
摘要 : 拟南芥 WRKY2 蛋白定位于细胞核 , 表明 WRKY2 是转录调控因子。 WRKY2 在不同器官组织中的表
达分析显示在叶的表达量是最高的。在各种逆境条件下的表达分析显示 : WRKY2 的表达受 NaCl 和甘露醇
比较强的诱导 ; KCl、LiCl、CaCl2 和 NaH2 PO4 均不诱导 WRKY2 的表达 ; ABA 处理基本上不影响 WRKY2 基
因的表达 ; 另外 , WRKY2 的表达也不受病原菌、冷害和高温的诱导。这些结果表明 WRKY2 可能在 NaCl 和
甘露醇引起的渗透胁迫反应中起一定的作用。
关键词 : AtWRKY2; 转录调控因子 ; NaCl ; 甘露醇 ; 渗透胁迫
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 05 - 427 - 06
Arabidopsis WRKY2 Transcription Factor may be
Involved in Osmotic Stress Response
J IANG Wen-Bo1 , 2 , YU Di-Qiu1 **
( 1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223 , China;
2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China)
Abstract: Thefact that Arabidopsis WRKY2 protein was nuclear-localized supported that WRKY2 functioned as a tran-
scription factor . The expression levels of WRKY2 in leaves werethehighest in all tissues . Theexpression profile indicated
that theexpression levels of WRKY2 wereelevated by NaCl andmannitol treatments, whilewhichwerenot induced byother
treatments including KCl , LiCl , CaCl2 , NaH2 PO4 , pathogenic germs, cold, heat and ABA . These results suggested that
WRKY2 might be involved in osmotic stress induced by NaCl andmannitol .
Key words: AtWRKY2; Transcription factor; NaCl; Mannitol; Osmotic stress
转录调控因子 WRKY 基因家族是植物特有
的超级基因家族 , 在拟南芥 ( Arabidopsis thali-
ana) 中发现了 70 多个成员 (Dong等 , 2003; Eulgem
等 , 2000, 2007)。WRKY 蛋白质含有高度保守的氨
基酸序列 WRKYGQK 和 Cys2 His2 或 Cys2 HisCys 锌
指型结 构 ( Dong 等 , 2003; Eulgem 等 , 2000 )。
WRKY 蛋白质通过特异地结合靶基因启动子区域
的特异序列 TGACC (A?T) (W盒 ) 而调节靶基因
的表达 (Ulker and Somssich, 2004; Yu等 , 2001)。
许多研究表明 WRKY 基因调控植物生物逆境反
应。有许多 WRKY 基因调控水杨酸介导的抗病
反应 (Asai 等 , 2002; Chen andChen, 2000; Della-
gi 等 , 2000; Eulgem等 , 2000; Kim等 , 2000) , 除
此之外 , WRKY 基因也参与了伤害反应的调控
(Hara等 , 2000 )。 WRKY 基因还调控植物非生物
抗逆性反应。如冻害 ( Huang and Duman, 2002 )、
冷害 (Seki 等 , 2002)、高温 ( Rizhsky 等 , 2002 )、
氧化胁迫 ( Rizhsky 等 , 2004 )、干旱 ( Pnueli 等 ,
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (5) : 427～432
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09046
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ydq@ xtbg. ac. cn
收稿日期 : 2009 - 03 - 12 , 2009 - 05 - 06 接受发表
作者简介 : 江文波 (1977 - ) 男 , 在读博士研究生 , 主要从事植物基因功能分析研究。E-mail : jwb2001108@163 . com ?
基金项目 : ?国家高科技研究发展计划 (863 计划 ) ( 2006AA02Z129 )、中国科学院“百人计划”择优支持、云南省自然科学基金
(2003C0342M ) 和中国科学院基金项目 ( KSCX2-YW-N-007 )
2002; Rizhsky 等 , 2002) 及盐害 ( Jiang and Deyho-
los, 2009; Seki 等 , 2002) 等。 WRKY 基因调控植
物的代谢 , 例如花青素和淀粉的合成 ( Johnson
等 , 2002; Sun 等 , 2003 )。也有一些研究表明 ,
WRKY 基 因 调 控 植 物 的 生 长 发 育 , 如 胚 胎
(Lagace and Matton, 2004 )、种子大小 ( Luo 等 ,
2005) , 种皮和毛状体的发育 ( Ishida 等 , 2007;
Johnson 等 , 2002 )、衰老 ( Hinderhofer and Zent-
graf , 2001; Miao and Zentgraf, 2007; Robatzek and
Somssich, 2001) 等。
Dong 等 ( 2003 ) 的 研 究 表 明 : WRKY2、
WRKY34 和 WRKY44 的氨基酸序列的相似性程度
高 , WRKY34 特异地在小孢子和雄配子体中表达
(Honys等 , 2006)。到目前为止 , WRKY2 基因功
能方面的研究未见报道。我们按照反向遗传学的
研究思路 , 分析基因的表达谱 , 以初步推测基因
的功能。实验结果表明 WRKY2 可能在 NaCl 和甘
露醇引起的渗透胁迫反应中起一定的作用。
1 材料和方法
1 .1 材料
实验使用的拟南芥为野生哥伦比亚生态型 ( Arabi-
dopsis thaliana Col .) , 拟南芥种子表面灭菌后均匀散布在
MS培养基 (含 0.7 % agar) , 4℃春化 3 天后转移到 22℃
培养箱培养 5 天移栽到土里。培养条件为 22℃ , 相对湿
度 50% , 光照周期 10 光照?14 黑暗 (光照时间 8 : 30～
18: 30)。用于各种逆境处理表达分析的野生型叶片为 3
周苗龄 , 处理后液氮冷冻 - 80℃保存。各器官组织的材
料从同一批种植的野生型获得。用于亚细胞定位分析的
烟草 ( Nicotiana benthamiana) , 生长条件与拟南芥一样。
用 4 周苗龄的叶片用于注射农杆菌。
1 .2 核酸的提取及 AtWRKY2 cDNA 的克隆
用 TRIZOL 试剂盒 ( BRL Life Technologies, Rockville,
MD) 提取总 RNA。根据 NCBI 公布的 AT5G56270 序列设
计用于 WRKY2 cDNA 克隆的引物分别为 A : 5′-AAACCAT-
GGCTGGTTTTGATGAAAATG-3′, B : 5′-AAAGGATCCTCAA-
ATCTGAGGTAATCTACTCATGA-3′。首先将 RNA 用 DNA 酶
处理 , 再使用 2μg RNA 样品和引物 B 进行反转录 , 反转
录产物取 1μl 进行 PCR。PCR 产物 DNA 电泳后片段胶回
收。以上所用试剂均由 Fermentas公司生产。
1 .3 质粒构建与农杆菌转化
为了在 E. coli 表达WRKY2蛋白 , 用 NcoI 和 BamHI 酶切
WRKY cDNA 后插入 pET-32a表达载体 (Novagen) , 然后转入
BL21 (DE3)。为了检测 WRKY2 蛋白的亚细胞定位 , 首先用
引物 5′-AAACCATGGGGATCCGAGATGGTGAGCAAGGGCGA-
3′, 5′-AAATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3′,
以 pBIEGFP ( Clontech) 载体为模板扩增出 EGFP 片段 ,
然后用引物 5′-AAACCATGGCTGGTTTTGATGAAAATG-3′和
5′-AAAGGATCCAATCTGAGGTAATCTACTC-3′获 得 WRKY2
cDNA, 用 NcoI 和 BamHI 酶切插入在 EGFP 的 5′端。构建
表达载体 , 转入 Agrobacterium tumefaciens (strain GV3101)。
1 .4 亚细胞定位
将含有 WRKY2-EGFP 和 EGFP的 Agrobacterium tumefa-
ciens (strain GV3101 ) 在 LB (含有 10 mmol L - 1 MES 和 20
μmol L - 1 乙酰丁香酮 ) 中培养过夜 , 离心后重新悬浮在
10 mmol L - 1 MES-NaOH, pH 5 .6 和 10 mmol L - 1 MgCl2 中。
调整溶液的 OD600 为 0 .5 , 然后加入乙酰丁香酮使其浓
度为 150μmol L - 1 , 在 22℃保育 2 h。将准备好的农杆菌
直接注射入烟草叶片 , 40 h后用激光共聚焦显微镜观测
结果。
1 .5 Northern杂交
3 周苗龄的叶片用 NaCl ( 300 mmol L - 1 )、mannitol
(300 mmol L - 1 )、ABA ( 100 μmol L - 1 )、KCl ( 300 mmol
L - 1 )、LiCl ( 40 mmol L - 1 )、CaCl2 ( 100 mmol L - 1 ) 和
NaH2 PO4 (300 mmol L - 1 ) 采用离体水溶液浸泡处理。PS-
DC3000 处理 : 采用 10 mmol L - 1 MgCl2 稀释到 OD600 =
0 .001 , 活体注射。冷害采用 0℃黑暗条件下离体处理 ,
高温处理采用 42℃活体处理。用 TRIZOL 试剂盒 ( BRL
Life Technologies, Rockville, MD) 提取总 RNA。使用 1 .5%
甲醛-MOPS琼脂糖凝胶分离总 RNA 后 , 转移到尼龙膜
上。杂交温度为 68℃ ; 杂交液选用 Perfect HybTM Plus
buffer (Sigma-Aldrich) ; 使用 WRKY2cDNA 的后 1 000 bp做
探针 ; 探针通过 klenow fragment (Takara) 进行32 P-dATP 标
记。洗膜 : 2×SSC 和 0 .5 %SDS, 每次 10 min, 1 次 ; 0 .5
×SSC 和 0.1 % SDS, 2 次 , 每次 20 min; 0 . 1 × SSC 和
0 .1%SDS, 每次 20 min, 1 次。最后压片放射自显影。
1 .6 定量 RT-PCR
从 4 周苗龄的野生型拟南芥获得了根、茎、叶、花
和荚果 , 用 TRIZOL 试剂盒提取总 RNA , 并进行 DNaseⅠ
消化 , 用来进行定量 RT-PCR 实验。定量 RT-PCR 的引物
为 WRKY2 (AT5G56270 ) : 5′-TTTCTTTGGGTTACGATG-3′和
5′-CACAACAACTCTTGGCTC-3′; ACT2 ( AT3G18780 ) : 5′-
TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3′和 5′-TTTCCCGCTCTGCT-
GTTGT-3′。反转录总体系为 20μl 包含 1μg总 RNA , 每个
反转录产物用水稀释 20 倍 , 然后取 2μl 用作 PCR 模板 ,
其它反转录产物 - 80℃保存。定量 PCR 的反应体 ( 10
μl) : 1μl SYBR Green I 反应混合物 , 3 mmol L - 1 MgCl2 ,
每条引物各 0 .5μmol L - 1 和 2μl cDNA。退火温度为 50℃ ,
在 RocheLightCycler real-time PCR 仪上进行了定量 PCR 实
验。整个定量 PCR 实验用不同的 RNA 样品重复 3 次。
824 云 南 植 物 研 究 31 卷
2 结果与分析
2.1 拟南芥 WRKY2 基因的蛋白结构和亚细胞定位
拟南芥 WRKY2 蛋白由 687 氨基酸组成 , 分子
量为 74.561 kD, 预测的等电点为 5 .71。WRKY2 蛋
白质含有 2 个高度保守的氨基酸序列 WRKYGQK
和 2 个 Cys2 His2 锌指型结构 (图 1)。 WRKY2 作为
一个转录调控因子 , 它的蛋白可能定位于细胞核
里。序列分析表明 WRKY2 具有一个典型的核定
位信号 ( 图 1 )。为了检测 WRKY2 蛋白的亚细胞
定位 , 我们构建了 WRKY2-EGFP 表达载体 , 农
杆菌直接注射烟草 ( Nicotiana benthamiana) , 激
光共聚焦显微镜观测显示 : EGFP 蛋白在细胞质
和细胞核里均大量存在 , 而 WRKY2-EGFP 融合
蛋白特异地定位于细胞核 ( 图 2 )。
图 1 WRKY2 蛋白的序列分析
WRKY2 的氨基酸序列。高度保守的 WRKYGQK 和 C2 H2 用红色显示 , 核定位信号用下划线标出
Fig . 1 Sequences of WRKY2
Amino acid sequenceof WRKY2 . The highly conserved WRKYGQK sequences and the residues forming the C2 H2
zinc-fingers are in red . The putative nuclear localization signals are underlined
图 2 WRKY2 的亚细胞定位
WRKY2 和 EGFP 融合产生 WRKY2-EGFP。WRKY2-EGFP 融合蛋白定位于烟草
叶表皮细胞的细胞核。而 EGFP 在细胞核和细胞质里均有分布
Fig . 2 Subcellular localization of WRKY2
WRKY2 was fused to EGFP to yield WRKY2-EGFP . The chimeric protein was localized to the nucleus of N. benthamiana
leaf epidermal cells . EGFP alone was detected in both the nucleus and the cytoplasm due to its small size
9245 期 江文波等 : 拟南芥 WRKY2 转录调控因子可能参与调控渗透胁迫反应
2 .2 ?拟南芥 WRKY2 在不同植物器官组织中的
表达分析
鉴于在正常生长的情况下 , WRKY2 的表达
水平比较低 , 我们采用定量 PCR 检测 WRKY2 在
不同器官组织中的表达。 WRKY2 在根、茎、叶、
花和荚果中都有表达 , 相对来说 , 在叶里的表达
量是最高的 , 茎和花里的表达量次之 , 根和荚果
里的表达最低 ( 图 3 )。
图 3 WRKY2 在不同器官组织中的表达分析
Fig . 3 Expression analysis of WRKY2 in different organ and tissue
2 .3 ?拟南芥 WRKY2 在各种逆境条件下的表达
分析
为了研究 WRKY2 基因的功能 , 我们分析了
WRKY2 在各种逆境下的表达。由于 WRKY2 基因
的表达在叶里是最高的 , 我们以叶为处理材料。
首先分析了 WRKY2 基因对 NaCl 的响应 , 结果显
示 : WRKY2 的表达受 NaCl 比较强的诱导 ( 图
4)。有文献报道 NaCl 主要有两方面的作用 , 一
方面是离子的胁迫作用 , 另一方面是引起渗透胁
迫 (Borsani 等 , 2001; Hasegawa等 , 2000)。因此 ,
我们用特异引起渗透胁迫的甘露醇和一些其它的
盐来处理材料 , 以明确究竟是渗透胁迫还是离子
的作用来 诱导 WRKY2 的表达的。结果显示 :
WRKY2 的表达不受 KCl、LiCl、CaCl2 和 NaH2 PO4
的诱导 , 而受甘露醇比较强的诱导 ( 图 4 )。有
研究表明 ABA 在渗透胁迫反应中起重要的调控作
用 (Leung and Giraudat, 1998; Yamaguchi-Shinozaki
and Shinozaki , 2006)。因此我们鉴定了 ABA 处理对
WRKY2 表达的影响。实验数据表明 : ABA 处理基
本上不影响 WRKY2 基因 的表 达 ( 图 4) 。另外 ,
图 4 WRKY2 在各种逆境条件下的表达分析
Fig . 4 Expression analysis of WRKY2 by different stress treatments
WRKY2 的表达也不受病原菌、冷害和高温的诱
导。综上所述 , WRKY2 受 NaCl 和甘露醇的诱
导 , WRKY2 可能在 NaCl 和甘露醇引起的渗透胁
迫中起一定的作用。
3 讨论
本研究分析了 WRKY2 蛋白的结构 , 其含有
2 个高度保守的氨基酸序列 WRKYGQK 和 2 个
Cys2 His2 锌指型结构 ; 在体外证实了 WRKY2 蛋
034 云 南 植 物 研 究 31 卷
白与 TTGACC (W盒 ) 特异地结合 ; 进一步明确
WRKY2 蛋白定位于细胞核 , 这些结果支持了
WRKY2 是转录调控因子。
采用定量 RT-PCR 检测了 WRKY2 在不同器
官组织中的表达 , 结果显示 WRKY2 在根、茎、
叶、花和荚果中均有表达 , 但在叶中的表达量最
高 , 茎和花中的表达量次之 , 根和荚果里最低。
我们以叶为处理材料 , 进行了 WRKY2 在各
种逆境 条 件下 的表 达 分析 , 实 验数 据 表明 :
WRKY2 的 表 达 受 NaCl 比 较 强 的 诱 导 ; KCl、
LiCl、CaCl2 和 NaH2 PO4 均不诱导 WRKY2 的表
达 ; 但 WRKY2 的表达受甘露醇比较强的诱导 ;
ABA 处理基本上不影响 WRKY2 基因的表达 ; 另
外 , WRKY2 的表达也不受病原菌、冷害和高温
的诱导。由于 WRKY2 的表达受 NaCl 比较强的诱
导 , 而现有文献报道表明 NaCl 主要有两方面的
作用 , 即离子的胁迫作用和引起渗透胁迫反应
( Borsani 等 , 2001; Hasegawa等 , 2000) 。那么究竟
是那方面的作用来诱导 WRKY2 的表达呢 ? 为此 ,
我们用特异引起渗透胁迫的甘露醇和一些其它的
盐来处理材料 , 以明确是渗透胁迫还是离子的作
用来诱导 WRKY2 的表达的。由于其它盐基本不
诱导 WRKY2 的表达 , 而甘露醇很明显的诱导其
表达 , 因此 , 我们认为渗透胁 迫可能在 诱导
WRKY2 表达中起重要的作用。
有文献也报道了 ABA 在调控渗透胁迫反应
中起 重 要 的 作 用 ( Leung and Giraudat, 1998;
Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki , 2006 ) , 而我们
的结果表明 ABA 处理基本上不影响 WRKY2 基因
的表达。因此 , NaCl 和甘露醇诱导的 WRKY2 的
表达可能与 ABA 信号传导途径无关。通过表达
分析表明 WRKY2 可能在 NaCl 和甘露醇引起的渗
透胁迫反应中起一定的作用 , 但 WRKY2 基因究
竟是如何在这个反应中发挥作用仍然很不清楚。
致谢 Zhixiang Chen 教授 ( Department of Botany and Plant
Pathology, Purdue University, West Lafayette, Indiana, USA)
赠送了 T-DNA 插入的 wrky2- 2 突变体 (Sail— 739— F05)。
〔参 考 文 献〕
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