全 文 ：基因组学与应用生物学，2012年，第 31卷，第 4期，第 333-340页
Genomics and Applied Biology, 2012, Vol.31, No.4, 333-340
研究论文
Research Article
十字花科黑腐病菌中转录调控因子HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达
薛番艳 1 苏辉昭 1 刘兴艳 1 梁伟 1 李磊 1 李瑞芳 1 陆光涛 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, lugt@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xcc8004)中的一个转录调控因子 XC_2736 (HpaR1)在致病过程中具有重要的作
用。前期研究发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的合成。为了解 HpaR1对纤维素酶的转录调控机
理，本研究对 HpaR1进行原核表达纯化，并与 488 bp的包含 XC_0639的启动子区 DNA片段进行凝胶电泳
迁移率试验，发现 HpaR1与 XC_0639启动子可以发生结合。将 488 bp的 XC_0639的启动子 DNA片段与报
告基因 gus融合，构建 XC_0639的报告质粒 pGUS0639r，分别导入野生型 8004菌株和缺失突变体 DM2736
中，分析发现在突变体背景下 GUS的表达水平比野生型背景明显降低。表明 HpaR1正调控 XC_0639的表
达。构建 XC_0639的极性整合突变体 PK0639，检测发现 PK0639几乎丧失胞外纤维素酶的活力；通过功能反
式互补构建的互补菌株 CPK0639可以恢复纤维素酶活性。研究结果表明 HpaR1通过调控纤维素酶基因
XC_0639的表达来调控细胞的纤维素酶活性。本研究为更深入地了解 HpaR1如何调控细菌生理生化功能奠
定了基础。
关键词 十字花科黑腐病菌,转录调控因子, HpaR1,纤维素酶
The Transcriptional Regulator HpaR1 of Xanthomonas campestris pv. campe-
stris (Xcc) 8004 Regulates the Expression of a Extracellular Cellulase Gene
Xue Fanyan 1 Su Huizhao 1 Liu Xingyan 1 Liang Wei 1 Li Lei 1 Li Ruifang 1 Lu Guangtao 1,2*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory of Conservation and Utilization of
Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530005
* Corresponding author, lugt@gxu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.031.000333
Abstract The transcriptional regulator XC_2736 (HpaR1) of X. campestris pv. campestris (Xcc) 8004 plays
important roles in regulating bacterial diverse biological processes. Previous work showed that this transcriptional
regulator might play role on extracellular cellulase. To illustrate the regulatory mechanism, HpaR1 was over
expressed , and electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were performed using HpaR1 protein and the
promoter fragment end XCA-p of XC_0639. Results showed that HpaR1 could specifically bind to the promoter
fragment of XC_0639. The reporter plasmid pGUS0639r was constructed by fusing the promoter of XC_0639 with
gus gene, and them been introduced into wild type strain 8004 and the HpaR1 mutant DM2736, respectively. The
expression level of GUS decreased significantly in the mutant, compared to the wild type background, suggesting
HpaR1 positively regulates the expression of XC_0639. Mutation in XC_0639 reduces the cellulose activity greatly
in Xcc. The results revealed HpaR1 regulates the cellulase activity by regulating the expression of the cellulase
gene XC_0639. This work expends our horizons on the underlying regulatory mechanism and the physiological and
biochemical function of HpaR1.
Keywords X. campestris pv. campestris, Transcriptional regulator, HpaR1, Extracellular cellulose
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31171206)项目资助
植物细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素、多糖、 果胶及糖蛋白组成，是病原菌侵染过程中的主要障
碍。根据细胞壁降解酶作用的底物不同可分为纤维
素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和蛋白酶等。植物
病原菌分泌的细胞壁降解酶对其侵染寄主起着重要
的作用。在水稻稻瘟病菌的研究中发现纤维素酶和果
胶酶与水稻稻瘟病菌的致病性有关(李杨等, 2010)。在
灰葡萄孢中纤维素酶和果胶酶对其致病力也有重要
作用(吴洁云等, 2010)。
黄单胞菌属能够侵染多种植物，包括 124种单
子叶植物和 268种双子叶植物。十字花科黑腐病菌
(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)能分泌
多种致病因子，包括多种胞外酶(胞外淀粉酶, 胞外
蛋白酶和胞外纤维素酶等)、EPS、LPS 和Ⅲ型效应
物蛋白等。
在前期的研究中，我们发现 Xcc 8004菌株中一
个转录调控因子 XC_2736 (HpaR1)影响其致病性和
过敏反应(HR)，并调控Ⅲ型分泌系统的表达(An et al.,
2011)。另外，HpaR1可能调控细胞的纤维素酶活性。
本研究通过构建一个纤维素酶报告质粒，以及凝胶
电泳迁移率实验等证实了 HpaR1直接调控一个编码
纤维素酶基因 XC_0639的表达。
1结果与分析
1.1 HpaR1能够特异性结合 XC_0639的启动子区
前期的工作发现，HpaR1属于 GntR类转录调控
因子家族，在其蛋白 N末端有一个 HTH-DNA结合
结构域，可以与多类靶基因序列特异性结合。前期研
究还发现该转录调控因子可能调控胞外纤维素酶的
合成。对 Xcc8004菌株的基因组序列进行搜索，发
现，根据 kegg的注释有 9个基因与多组分酶系的纤
维素酶相关。其中 XC_0026、XC_0027、XC_0028、
XC_1727和 XC_0639编码产物一样，注释为纤维素
内切酶。我们选择 XC_0639 来分析其表达是否受
HpaR1的调控。
将完整的 hpaR1 基因克隆到表达载体 pQE30
上，再将测序正确的表达质粒导入 M15菌株中得到
HpaR1表达菌株 M15/O2736 (An et al., 2011)。将表
达菌株在适宜条件下诱导培养后纯化蛋白。经
SDS-PAGE分析，在 14.4 kD处出现单一的蛋白条
带，与预期的大小 14.47 kD一致(图 1)。获得的 HpaR1
蛋白用于后续的凝胶电泳迁移率实验分析。
以 8004总 DNA为模板，PCR扩增 XC_0639基
因上游包括起始密码子 ATG在内的 DNA序列，得到
一条大小为 488 bp的片段(图 2)。将纯化的 DNA片
段，用生物素标记试剂盒进行标记得到生物素标记的
DNA片段 engXCA-p用于凝胶电泳迁移率实验。
将经过纯化的 HpaR1 蛋白与生物素标记过的
engXCA-p片段进行凝胶电泳迁移率实验。结果显
示，随着 HpaR1蛋白浓度的增加，engXCA-p条带发
生明显的滞后；而在相同的 HpaR1蛋白浓度条件下，
对照片段并没有发生滞后(图 3)。表明 HpaR1能与
engXCA-p片段特异性结合作用。
1.2 HpaR 1 通过结合 XC_0639 启动子正调控
XC_0639
以上工作初步证明了 HpaR1直接调控 XC_0639
的表达，为了进一步确定 HpaR1与 XC_0639之间的
调控关系，构建了表达报告质粒。将 XC_0639启动子
图 1带 6×His-tag的 HpaR1蛋白的表达与纯化
注: M:蛋白质分子量标准; 1,2:纯化的 HpaR1蛋白
Figure 1 Expression and prifucation of 6×His-tag HpaR1 protein
Note: M: Protein Molecular Weight Marker; 1,2: Purified HpaR1
protein
图 2 PCR扩增 XC_0639启动子区
注: M: 100 bp DNA分子量标准; 1: XC_0639的启动子区
Figure 2 PCR amplification of XC_0639 promoter
Note: M:100 bp DNA Molecular Weight Marker; 1: Promoter re-
gion of XC_0639
十字花科黑腐病菌中转录调控因子 HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达
The Transcriptional Regulator HpaR1 of Xcc8004 Regulates the Expression of a Extracellular Cellulase Gene 334
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 3 HpaR1特异性结合 XC_0639启动子序列
注: 生物素标记的 engXCA-p 分别加入 20 ng, 40 ng, 60 ng,
100 ng的 His6-HpaR1蛋白; P:生物素标记的 engXCA-p; C1:
生物素标记的对照片段; C2:生物素标记的对照片段加入 100 ng
His6-HpaR1蛋白
Figure 3 Determenation of HpaR1-binding to XC_0639 promoter
sequences by EMSA
Note: Biotin-labeled fragment added His6-HpaR1 protein fol-
lowing 20 ng, 40 ng, 60 ng, 100 ng; P: Biotin-labeled XC_0639
promoter DNA probe engXCA-P; C1: Control probe; C2: Control
probe with 100 ng His6-HpaR1 protein
DNA片段经 EcoRⅠ/BamHⅠ处理，克隆到 pLAFR6-
gus 质粒上，获得重组质粒 pGUS0639r，重组子的
质粒 DNA 为模板，用 0639PF/0639PR 为引物 PCR
(图 4A)和酶切验证(图 4B)正确的重组质粒进行测
序，将测序正确的重组质粒分别导入野生型菌株
8004 和 HpaR1 的突变体 DM2736，获得报告菌株
8004/pGUS0639r 和 DM2736/pGUS0639r。分别在
NYG和 MMX培养基中定量测定报告菌株的 GUS
活性。结果显示在两种培养基中 DM2736/pGUS06-
39r的 GUS活性都明显低于 8004/pGUS0639r (图 5)。
这表明 HpaR1正调控 XC_0639的表达。
图 4报告质粒的 PCR (A)和酶切(B)验证
注: M: 100 bp DNA分子标记; A: 1,2 重组子的质粒 DNA为
模板,用 0639PF/0639PR引物 PCR扩增产物; B: 1:重组子的
质粒 DNA,用 EcoRⅠ/BamHⅠ处理
Figure 4 Confirmation of pGUS0639r by PCR (A) and endonu-
clease (B)
Note: M: 100 bp DNA Molecular Weight Marker; A: 1,2: PCR
reaction were performed with the recombinant plasmid as tem-
plate, 0639PF/0639PR as primers; B: 1: The recombinant plas-
mids were digested with EcoRⅠ/BamHⅠ
1.3 XC_0639突变影响胞外纤维素酶
为确定Xcc中 XC_0639对细胞纤维素酶活性的
影响，采用自杀质粒 pK18mob对其进行插入突变，
构建了极性整合突变体 PK0639。由于 XC_0639在基
因组中以一个独立的转录单元存在，因此对其进行
极性突变不会影响其上下游基因的表达。
以 8004总 DNA为模板，扩增 XC_0639 ORF内
部长度为 492 bp 的同源片段，克隆到自杀质粒
pK18mob 质粒上，将测序正确的重组质粒导入
XCC8004中，筛选结合子 PK0639。随机挑取 6个接
合子，分别提总 DNA做模板，以 pk18mobcon/C0639F
为引物进行 PCR验证，得到 700 bp左右的 DNA产
物(图 6)。平板定性检测胞外纤维素酶活性，发现突
变体几乎无纤维素酶活性(图 7A)。为准确衡量胞外
纤维素酶的产量，采用 DNS法(图 7B)测定胞外纤维
素酶的活性，结果表明，XC_0639突变后，胞外纤维
素酶活性下降 98.5%。
为了进一步验证 XC_0639是否与细胞的纤维素
酶活力有关，PCR扩增一段扩增 1 739 bp包含完整
的 XC_0639 基因，经 BamHⅠ/HindⅢ 处理，克隆到
pLAFR3质粒上，获得的重组质粒 pL3_ C0639经测
序验证正确后导入突变体 PK0639，得到反式互补菌
图 5在 NYG和 MMX培养基中, HpaR1 正调控 XC_0639 的
表达
注: A: NYG培养基, HpaR1正调控 XC_0639的表达; B: MMX
培养基, HpaR1正调控 XC_0639的表达
Figure 5 HpaR1 positively affect the expression of XC_0639 in
NYG and MMX medium
Note: A: In NYG medium, HpaR1 positively affect the expres-
sion of XC_0639; B: In MMX medium, HpaR1 positively affect
the expression of XC_0639
335
十字花科黑腐病菌中转录调控因子 HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达
The Transcriptional Regulator HpaR1 of Xcc8004 Regulates the Expression of a Extracellular Cellulase Gene
株 CPK0639。
平板法(图 7A)和 DNS法检测(图 7B)发现互补
菌株的胞外纤维素酶活性基本恢复到野生型水平。
综合这些实验结果，表明 XCC中的纤维素酶活性主
要由 XC_0639基因编码产物所决定。
2讨论
植物病原菌在侵染植物的过程中会分泌细胞壁
图 6突变体的构建(A)及互补(B)示意图
注: M: 100 bp DNA分子标记; A : 1: 8004总 DNA为模板,用
pK18mobcon/pK0639F为引物 PCR的产物; 2:突变体总 DNA
为模板, 用 pK18mobcon/pK0639F为引物 PCR 的产物; B: 1:
pL3_C0639 质粒 DNA 为模板 , 用 C0639F/C0639R 为引物
PCR的产物
Figure 6 Illustration of the mutant construction (A) and comple-
mentation (B)
Note: M: 100 bp DNA Molecular Weight Marker; A: 1: PCR re-
actions were performed with wild type 8004 as template,
pK18mobcon/pK0639F as primers; 2: PCR reactions were per-
formed with PK0639 as template, pK18mobcon/pK0639F as
primers; B: 1: PCR reactions were performed with the plasmid
pL3_C0639 as template, C0639F/C0639R as primers
图 7胞外纤维素酶检测
注: 1: 8004; 2: DM2736; 3: PK0639; 4: CPK0639
Figure 7 Detection of extracellular cellulase
Note: 1: 8004; 2: DM2736; 3: PK0639; 4: CPK0639
降解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、蛋白酶
和淀粉酶等。不同的植物病原菌分泌的细胞壁降解
酶不同，在致病过程中的作用也不尽相同。
Xcc侵染植物过程中可以分泌多种降解植物细
胞壁的酶，例如果胶酶和蛋白酶，纤维素酶等，它们
在致病过程中起着重要的作用(Dow et al., 1987)。其
中纤维素酶的主要功能是降解植物细胞的细胞壁中
纤维素和半纤维素。
前期研究发现，在 Xcc中，全局调控蛋白 Clp
(cyclic AMP receptor protein-like protei) (Hsiao et al.,
2005)和 RpfG/RpfF双组分调控系统均可以调控纤维
素酶基因的转录。其中，clp是直接正调控纤维素酶
基因。此外，另一个全局调控因子 RsmA也影响胞外
纤维素酶的产生(Chao et al., 2008)。
前期工作(未公开资料)发现，HpaR1可能调控纤
维素酶活性，而在其它物种中 engXCA类基因是主
要的纤维素基因之一。本研究采用平板检测和 DNS
法定量测定纤维素酶活性。结果发现，突变 XC_0639
后，Xcc胞外纤维素酶活性下降 95.5%。推测 XC_0639
可能作为 Xcc中一个相对主要的胞外纤维素酶基因
来影响其纤维素酶的产量，这一结果有待于通过失
活其它 4个基因来进一步确定。
此外，我们通过 EMSA实验发现 HpaR1可以特
异性结合在 XC_0639启动子区，结合报告质粒检测
结果也发现 HpaR1正调控 XC_0639的表达。因此我
们认为 HpaR1通过调控纤维素酶基因 XC_0639 的
表达来正调控细胞的纤维素酶活性。但 HpaR1 与
XC_0639启动子区具体结合的碱基序列还需进一步
的实验分析。
结合报告质粒检测系统我们推测 HpaR1突变体
中纤维素酶活性比较低，但纤维素酶活性定量测定结
果发现该突变体中纤维素酶活性比野生型 XCC8004
只降低 18%。推测可能是在 HpaR1 突变体中
XC_0026、XC_0027、XC_0028和 XC_1727，基因高表
达的结果。此外，其它已知或者未知调控因子对纤维
素的调控也在起作用。再者，由于在检测报告质粒
GUS酶活性时发现在菌落生长前期几乎检测不到
GUS酶活性。故也可能是 HpaR1突变体中低水平表
达的纤维素酶在菌体内累积，随着菌落处于对数期尤
其衰退期，死亡细胞释放纤维素酶到培养基，导致我们
测定到 HpaR1突变体中纤维素酶活和野生型 8004纤
维素酶活几乎相同。总之这一现象有待进一步探讨。
本研究的结果为今后研究和了解 hpaR1的表达
336
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
调控打下了基础，同时也为我们研究其它重要调控
基因的表达调控提供了方法和思路。
3材料与方法
3.1实验菌株和质粒
本研究所用菌株和质粒见表 1。
3.2本实验所用引物
本实验所用引物(表 2)由华大基因公司合成。
3.3试剂
Ex Taq酶、Taq聚合酶、限制性内切酶和 T4连
接酶购自 Promega公司。DNA纯化及胶回收试剂盒
表 1本实验所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids in this study
菌株和质粒
Strains and plasmids
Xcc
Xcc8004
DM2736
PK0639
CPK0639
E. coli
E. coli DH5α
DH5α/pk0639M
ED8767
DH5α/C0639
Plasmids
pk18mob
pk0639M
pL3_C0639
pGUS0639r
特征
Characteristics
十字花科黑腐病菌野生型菌株 Rifr
Xanthomonas campestris pv. campestris
Xcc8004中缺失 XC_2736, Rifr, Kmr, Gmr
As 8004, but XC_2736 was deleted, Rifr, Kmr, Gmr
Xcc8004中 eng::pk18mob, Rifr, Kmr
As 8004, but eng (XC_0639)::pk18mob, Rifr, Kmr
PK0639中含有 pL3_C0639, Rifr, Kmr, Tcr
PK0639 harbouring pL3_C0639, Rifr, Kmr, Tcr
fhuA2, Δ(argF-lacZ) U169, phoA, glnV44, Φ80, Δ(lacZ) M15,
gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1, hsdR17
DH5α中含有 pk0639, Kmr
DH5α harbouring pk0639, Kmr
RecA56, metB, hsdS, supE supF,含有 pRK2073, Spcr
Helper strains harbouring pRK2073, Spcr
DH5α/中含有互补质粒 pL3_C0639, Tcr
DH5α harbouring pL3_C0639, Tcr
黄单胞菌中的自杀质粒, Kmr
Suicide plasmid in Xanthomonas campestris pv. Campestris, Kmr
pk18mob中连有一段 XC_0639内部片段, Kmr
pk18mob containing a internal fragment of XC_0639, Kmr
pL3中连有 XC_0639的互补片段, Tcr
pLAFR3 containing a internal fragment including the XC_0639 gene, Tcr
pLAFR6gus中连有 XC_0639的启动子区片段, Tcr
pLAFR6gus containing operon promoter fragment of XC_0639, Tcr
来源
Sources
实验室
Laboratory collection
实验室
Laboratory collection
本研究构建
This work
本研究构建
This work
Gibco BRL生物技术公司
Gibco biotechnology companies
本研究构建
This work
(Leong et al., 1982)
本研究构建
This work
实验室
Laboratory collection
本研究构建
This work
本研究构建
This work
本研究构建
This work
注: Rifr为利福平抗性; Kmr为卡那霉素抗性; Spcr为壮观霉素抗性; Tcr为四环素抗性
Note: Rifr is Rifampicin resistance; Kmr is Kanamycin resistance; Spcr is Spectinomycin resistance; Tcr is Tetracycline resistance
购自 Omega公司。生物素 3末端 DNA标记试剂盒
和化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒购自碧云
天生物技术研究所。其它生化试剂购自上海生工生
物工程技术服务公司。
3.4实验方法
3.4.1菌株培养
Xcc液体培养用 NYGB 培养基(每升培养基含
蛋白胨 10 g, 酵母粉 3 g, 甘油 20 g, pH 7.0)，28℃摇
床培养 14~16 h，200 r/min。固体培养基为 NYGA，每
升 NYGB添加 1.5%琼脂粉，28℃静止培养。
E. coli液体培养用 LB培养基(每升含胰蛋白胨
10 g,酵母提取粉 5 g, NaCl 10 g, pH 7.0)，37℃摇床培
337
十字花科黑腐病菌中转录调控因子 HpaR1调控一个纤维素酶基因的表达
The Transcriptional Regulator HpaR1 of Xcc8004 Regulates the Expression of a Extracellular Cellulase Gene
使用化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒进行显
影检测。
3.4.5报告质粒的构建
以 Xcc8004总 DNA为模板，用 0639PF/0639PR
引物进行 PCR扩增，得到 XC_0639基因上游包括
ATG在内的同源片段，用 EcoRⅠ/BamHⅠ处理后，
连接到 pLAFR6gus 质粒上，得到重组质粒，进行
PCR验证、酶切验证，最后测序。鉴定正确的重组质
粒命名为报告质粒 pGUS0639r。报告基因 gus编码
β-葡萄糖苷酸酶。
3.4.6 β-葡萄糖苷酸酶定量活性检测
将待测的 Xcc菌株过夜培养后，调 OD600一致
后，分别按 1%和 10%的接菌量转接到不加抗生素的
NYGA和MMX (需离心收集菌体)培养基。分装指形
瓶培养，每个时间点 3个重复。按照 Henderson等
(1985)描述的方法，以水解底物对硝基苯基-β-D-葡
萄糖醛酸苷 pNPG的量为标准衡量酶活。
3.4.7突变体及互补菌株的构建
从 KEGG中得到 XC_0639 的全基因序列全长
1 455 bp，用 Vcetoer NTI 9.0设计内部引物片段，在
引物 5端分别添加 HindⅢ和 BamHⅠ酶切位点，并
添加保护碱基 ACAGTT。用 pk0639F和 pk0639R，以
Xcc8004总 DNA为模板，PCR扩增 pk0639。经酶切，
连接到 pk18mob质粒 DNA，化学转化到 DH5α感受
态中，经蓝白筛选，PCR验证和序列测定，得到重组
质粒 pk0639M。在帮助菌株 ED8767的作用下，通过
三亲本结合将重组质粒 pk0639M导入 Xcc8004中，
养 12 h，200 r/min。固体培养用 LA培养基(每升 LB+
1.5%琼脂粉)，37℃培养箱静止培养。
抗生素用量：卡那霉素(Km) 25 μg/mL，壮观霉
素(Spc) 50 μg/mL，利福平(Rif) 50 μg/mL。
3.4.2 DNA操作
质粒 DNA的碱裂解法提取、8004总 DNA的快
速提取参考文献(Chen and Kuo, 1993)的方法，DNA
的纯化、限制性内切酶酶切、DNA的连接转化和生物
素标记均按照试剂的相关说明进行操作。基因测序
由华大基因公司完成。
3.4.3蛋白的表达纯化
参照文献 An等(2011)的实验方法，用实验室已
经构建好的 HpaR1表达菌 M15/O2736，在 1.0 mol/L
IPTG，200 r/min，37℃下培养，大量诱导表达。用 Ni-
NTA亲和层析纯化蛋白后，进行 SDS-PAGE电泳，
检测蛋白的表达量及纯化效果。
3.4.4凝胶阻滞实验
使用碧云天生物技术公司的生物素 3末端 DNA
标记试剂盒将 engXCA-p进行生物素标记。凝胶阻滞
实验方法参照 Huang等(2008)的实验方法。在 20 μL
反应混合物中，包括不同量的 HpaR1蛋白、相同量的
启动子 DNA 片段 engXCA-p、20 μL Binding Buffer
(Sheared DNA 5 μg/mL, Albumin Bovine 0.1 mg/mL,
Tris-HCl (pH 8 .0 ) 20 mmol/L, Glycerol 5% , KCl
50 mmol/L, DTT (二硫苏糖醇) 1 mmol/L)。混合物在
室温下孵育 20min，经 4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
分析。用 1×TA电泳缓冲液，电压 150 V，电泳 50min。
表 2本实验所用引物
Table 2 the primers used in this research
引物名称
Name of primers
0639PF/0639PR
O2736F/O2736R
pk0639F/pk0639R
C0639F/C0639R
pK18mobcon
Contorl-F/Control-R
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
acagttgaattcgcagatacggcaacccat
/acagttggatcccatggtgatctccctaga
ggatccatgactgacatccagtgg/
aagctttggtgttttcccctgtgg
acagttaagcttcagggcctgacctcgctgcagatcc/
acagttggatccagtacgactgcacgaacacgtccgg
acagttggatccccagggacaagaacgacagt/
acagttaagcttcaacctgctacgcagcgcct
gccgattcattaatgcagctggcac
acagttggatccgcgtgttgttcaccctggacaccga/
acagttaagcttcttggcgtccttggcttccagcgag
扩增片段长度(bp)
Length of amplified fragment (bp)
488
375
517
1 763
488
注:下划线表示另外加上的酶切位点;酶切位点前为六个保护碱基
Note: The underlined parts are restriction sites; In the front of restriction sites are six protecting nucleotides
338
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
得到三亲结合子。提取三亲结合子的总 DNA，经
PCR验证正确，得到整合突变体 PK0639。
以 C0639F/CO639R为引物扩增完整的 XC_0639
基因，经 BamHⅠ/HindⅢ处理，克隆到 pLAFR3质粒
上，根据蓝白斑筛选原理挑取白色转化子进行 PCR
验证。验证正确后导入 PK0639，筛选具有 Km、Rif、
Tc抗性的互补菌株 CPK0639。
3.4.8胞外纤维素酶的检测
平板检测胞外纤维素酶：取 2 mL待测菌株的过
夜培养物，测定 OD600，根据测定结果用 NYGB调节
菌体浓度为一致。用移液器分别吸取 2 μL浓度一致
的待测菌株，小心点在含 0.5% (w/v)的羧甲基纤维素
的 NYGA平板上，28℃静止培养 24 h后，用 0.1%的
刚果红染色 30 min，再用 1 mol/L的 NaCl脱色。能
产生纤维素酶的菌株，在红色背景下，其菌落生长处
及周围形成一透明圈。以野生型 8004为对照，通过
比较菌落周围透明圈的有无或大小判断产生胞外纤
维素酶的差异。
DNS法酶活测定胞外纤维素酶：将待测菌株过
夜培养，调 OD600为一致，4℃，12 000 r/min离心 5 min
去除菌体，用细菌过滤器过滤上清，去除菌体，取过
滤液液继续以下实验。按照Miller (1959)及 Chao等
(2008)的方法，先绘制葡萄糖标准曲线。各管在沸水
中反应 5 min，流水冷却，测定 OD530；取 100 μL过滤
液(原液)，加入 200 μL ddH2O，与 200 μL 1% CMC溶
液充分混合，在 28℃烘箱反应 30 min后，加入 1 mL
DNS溶液，沸水浴 5 min，立即置于冰水混合物冷却，
测定 OD530。酶活定义为：每分钟催化产生的 1 μmol
葡萄糖所需要的酶量(标准曲线制作与样品含糖量
测定应同时进行,一起显色和)。
作者贡献
本研究在陆光涛研究员提供科研经费支持和理
论及实验指导下，主要由薛番艳和苏辉昭完成实验
操作、数据分析及论文撰写；刘兴艳、梁伟、李磊和李
瑞芳参与部分实验和提出宝贵意见；陆光涛研究员
参与本论文的修改和最终定稿。
致谢
本研究是在国家自然科学基金(31171206)项目
的支持下完成的，衷心感谢参与本研究的全体老
师和所有同学。
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