全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Streptomyces
fradiae）［1］产生的氨基糖苷类抗生素［2，3］，是一种
理想的干扰蛋白质合成的杀菌剂［4］，在临床和兽医
学中有着广泛的应用，近年来市场对新霉素的需求
急剧增长。新近的研究发现，新霉素能通过阻遏成
纤维生长因子和内皮生长因子来干扰血管的形成，
可能发展成为抗癌药物［5-7］。此外，近年来的研究
还发现其具有巨大的抗 HIV 潜力，且新霉素 A、B
及其衍生物具有细胞毒性低的优点［8］。
目前，国内新霉素生产中普遍存在菌种发酵水
平波动性大，低产率高单耗等严重缺陷，优良新霉
收稿日期 ： 2014-05-13
基金项目 ：国家“十一五”“重大新药”创制项目（2010ZX09401-403），福建省自然科学基金项目（2012J01094）
作者简介 ：陈宏，高级工程师，研究方向 ：微生物菌种选育与发酵 ；E-mail ：peaceful88@163.com
通讯作者 ：张祝兰，研究员，研究方向 ：微生物药物 ；E-mail ：jessylan9963@sina.com.
链霉素抗性突变理性筛选新霉素高产菌株
陈宏  张祝兰  孙菲  张引  周璟明  郑榕
（福建省微生物研究所 福建省新药（微生物）筛选重点实验室，福州 350007）
摘 要 ： 采用化学诱变剂 NTG 结合链霉素抗性筛选法获得新霉素高产菌株。出发菌株费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）
FS1109 的孢子悬液经不同剂量的化学诱变剂 NTG 处理后，涂布在含链霉素最小抑制浓度（3 μg/mL）的培养基平板上培养，获得
大量的链霉素抗性突变株。经影印法初筛和摇瓶发酵复筛，正突变率高于负突变率，获得一株遗传性状稳定的 Streptomyces fradiae
Str 63 菌株，其新霉素生物活性单位比出发菌株提高了 50% 以上，且 C 组分较出发菌株的低。
关键词 ： 费氏链霉菌 新霉素 链霉素抗性筛选 突变
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.029
Streptomycin-resistant Rational Screening for High-yield Neomycin
Producing Strain
Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jingming Zheng Rong
（Fujian Institute of Microbiology，Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，Fuzhou 350007）
Abstract: NTG mutagenesis and streptomycin resistance screening was applied to screen neomycin high producing strain. A number of
streptomycin-resistant（str）mutants were obtained from original strain of Streptomyces fradiae FS1109 treated with three different dosage of
NTG under the selection pressure of resistance to streptomycin（the lethal concentration is 3 μg/mL）. Streptomycin-resistant mutants strain
Str63 was obtained with high neomycin yield by replica plating method and the neomycin productivity could be more than 50% higher and the
component of C was lower than that of the original strain in the rotation-flask experiments, the rate of the positive mutation was larger than that of
the negative mutation.
Key words: Streptomyces fradiae Neomycin Streptomycin resistance screening Mutation
素菌种的选育已成为提高新霉素产量和质量的首要
任务。在菌种选育过程中，面临的首要问题是巨大
的筛选工作。根据分子育种中关于抗生素产生菌抗
性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连
锁而容易发生共突变的理论［9］，采用抗生素抗性筛
选可以在较大程度上减少抗生素高产菌筛选的盲目
性和不定向性，提高对目的菌的筛选效率，极大地
减少诱变筛选的工作量。链霉素抗性筛选具有广谱
性、正突变率和增产百分率高等特点，以链霉素抗
性作为选择压力，对许多抗生素产生菌进行推理选
育所得到的突变株中都有较高的高效价突变株出现
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期174
的频率［10-14］。
本研究采用化学诱变剂亚硝基胍（NTG）诱变
处理使孢子产生 DNA 高频率突变，结合链霉素抗
性筛选法，获得链霉素抗性突变株以筛选新霉素高
产菌株，旨为工业化高效发酵生产新霉素提供优良
菌种。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 弗氏链霉菌 Streptomyces fradiae FS 1109，
指示菌金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CPCC-
160020，由福建省微生物研究所提供。
1.1.2 培养基 斜面培养基 ：高氏 1 号培养基。发
酵培养基［15］：0.5% 蛋白胨，2.8% 花生饼粉，0.5%
酵 母 粉，8.0% 米 粉，2.0% 葡 萄 糖，0.25% 玉 米
浆，0.025% 淀粉酶，0.6% 硫酸铵，0.45% 碳酸钙，
pH7.2。
1.2 方法
1.2.1 链霉素抗性突变株的制备
1.2.1.1 链霉素对 Streptomyces fradiae FS 1109 菌株
孢子最小抑制浓度的测定 将制备好出发菌株的孢
子悬液（浓度 106 个/mL）涂布在含不同浓度链霉素（1、
2、3、5、10 和 20 μg/mL）的高氏 1 号培养基平板上，
28℃培养 8 d，观察平板上菌落生长情况。记录未长
菌落平板上的链霉素最低浓度，即为链霉素对该菌
的最小抑制浓度。
1.2.1.2 亚 硝 基 胍 诱 变 亚 硝 基 胍（NTG，Fluka
Inc.）0.1 g， 加 少 量 的 丙 酮 溶 解 后 用 Tris 缓 冲 液
（pH8.0 Tris-HCl） 配 制 不 同 浓 度 的 NTG 溶 液 ；用
已灭菌的 Tris 缓冲液制备孢子悬液，取孢子悬液与
NTG 溶液按 1∶1 混合，于 28℃振荡处理 20 min，
用 Tris 缓冲液稀释终止反应。
1.2.1.3 链霉素抗性突变株的筛选 NTG 诱变处理
的孢子稀释液分别涂布在含最小抑制浓度链霉素和
空白对照培养平板上，28℃培养 10 d，分别进行不
同处理的菌落计数，凡是在含最小抑菌浓度链霉素
平板上长出来的菌落均为链霉素抗性突变株。
1.2.2 链霉素抗性突变株高产菌株的筛选
1.2.2.1 初筛单菌落 分别将诱变的突变菌落挑接
在高氏斜面上，并采用影印法将突变菌落进行生物
活性检测。
1.2.2.2 摇瓶复筛 采用划线法将初筛入选菌株接
种于装有一定量发酵培养基的三角瓶中 35℃、220
r/min 培养 135 h，进行发酵生物效价测定及采用
HPLC-EDC 法检测组分。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 生物效价检测 参照《中国药典》2010 版
抗生素微生物检定法（附录 XI A），效价为 3 次平
均值，以相对值标示。
1.2.3.2 新霉素 C 组分测定 采用 HPLC-ECD 方法。
分离条件 Agilent zorbax-SB C18（5 μm，4.6×250 mm）
色谱柱，以 25 mL/L TFA+6 mL/L NaOH（50%，W/W）
作为流动相，流速 0.7 mL/min ；柱后衍生液 0.5 mol/L
NaOH 溶液，流速 1 mL/min；电化学参数，E1=+0.1 V，
E2=+0.8 V，E3=-0.6 V。
2 结果
2.1 链霉素抗性（Str）突变株的制备
2.1.1 链霉素对 Streptomyces fradiae FS 1109 菌株孢
子的最小抑制浓度的确定 在试验中，当链霉素浓
度≥ 3 μg/mL 时，平板上无菌落生长。因此链霉素
对 FS 1109 菌株孢子的最小抑菌浓度为 3 μg/mL。
2.1.2 NTG 对 SF 1109 菌株孢子的诱变效应 通过
不同浓度的 NTG 对 SF1109 菌株孢子的诱变作用，
将各种处理浓度的孢子悬液稀释不同倍数后分别涂
布在含链霉素 3 μg/mL 和不含链霉素平板上，28℃
培养 10 d，分别作菌落计数，凡是在含链霉素 3
μg/mL 平板上长出来的菌落均为链霉素抗性（Str）
突变株，其诱变结果见表 1。
2.2 新霉素高产菌株的筛选
2.2.1 Str 突变株高产菌株的筛选结果 对 SF1109
菌株孢子进行 NTG 处理后，涂布在含 3 μg/mL 链霉
素的培养基平板培养，从中挑取 180 个抗性突变菌
落进行初筛，经生物检测，以诱变出发菌株的发酵
生物活性单位为 100，计算突变株的相对发酵生物
活性（表 2），其中 73 株为正突变菌株（相对生物
活性在 110 以上），50 株为未突变菌株（相对生物
活性在 90-110），57 株为负突变菌株（相对生物活
性在 90 以下）。将初筛获得的正突变株通过摇瓶发
酵培养进行复筛，经生物活性检测和 HPLC-EDC 定
2014年第12期 175陈宏等：链霉素抗性突变理性筛选新霉素高产菌株
量分析，最后选出 6 株良好的抗性突变株，分别为
Str07、Str19、Str63、Str75、Str136 和 Str153， 其 中
菌株 Str63（图 1）新霉素产量较出发菌株（图 2）
提高 50% 以上，且 C 组分较出发菌株低，见表 3。
表 2 链霉素抗性突变株初筛结果
相对生物效价 菌株数 分布频率（%）
90 以下 57 31.7
90-110 50 27.8
110 以上 73 40.5
2.2.2 菌 株 Str63 斜 面 保 藏 稳 定 性 试 验 将 菌 株
Str63 接种于斜面培养基上，待生长好后置于 4℃
保藏，测定保藏不同时间的菌株的发酵效价。以新
鲜 斜 面 为 对 照， 结 果 其 保 藏 10、20、30、60、90
图 1 菌株 Str 63
图 2 Streptomyces fradiae FS 1109
表 1 不同浓度 NTG 对 SF1109 菌株孢子致死率与突变率的影响
NTG 终浓度（g/L）
不含链霉素高氏平板 含链霉素（3 μg/mL）高氏平板
菌落数（个 /mL） 致死率（%） 突变菌落数（个 /mL） 突变率（%）
0 610 0 0
1.0 300 50.8 48 16.0
3.0 150 75.4 60 40.0
6.0 10 98.4 2 20.0
表 3 抗性突变菌株高产菌株的摇瓶发酵情况
菌株号 相对生物效价 C 组分（%）
SF1109 100 11.53
Str07 121.3 11.22
Str19 128.1 8.90
Str63 154.5 8.83
Str75 132.7 10.68
Str136 123.8 9.71
Str153 136.2 10.32
和 120 d 的 相 对 效 价 分 别 为 103%、111%、109%、
97.6%、99.1% 和 98.5%。表明菌种斜面在 4℃保藏
4 个月稳定。
2.2.3 菌株 Str63 传代稳定性试验 对菌株 Str63 连
续传代培养，以 4℃冰箱保存 7 d 生长良好的第一代
菌株为对照，结果其第 1、2、3、4 和 5 代的相对单
位 分 别 为 100%、103%、99.6%、98.1% 和 93.2%，
表明菌株 Str63 传四代对发酵水平无明显影响。提示
菌株 Str63 遗传稳定性较好。
3 讨论
新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Strepto-
myces fradiae）发酵产生的多组分抗生素，主要产物
新霉素 B 组分相对其他组分而言活性强、毒性低。
因此筛选新霉素发酵生物活性稳定，小组分含量低
的高产菌种有利于其工业化生产，可提高产品质量，
增强竞争力。
研究结果也显示了和相关文献［10，13］采用链霉
素抗性筛选法取得正突变机率高于负突变的一致结
果，可推测该弗氏链霉菌的链霉素抗性基因突变与
新霉素发酵生物活性突变紧密相关。链霉素抗性是
由于编码核糖体蛋白 S12 的 rpsL 基因或其它基因发
生突变导致核糖体或核糖体蛋白发生改变而产生，
虽然核糖体相关基因改变对抗生素产生菌次级代谢
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期176
产物生物合成的影响虽然已有较多研究［16，17］，但不
明机制仍然较多，核糖体相关基因的改变如何调控
菌株的次级代谢有待进一步探索与研究。
4 结论
本研究组合运用 NTG 诱变与链霉素抗性突变株
筛选新霉素高产菌株的方法，获得了 1 株高产新霉
素高产的突变菌株 Streptomyces fradiae Str63，其新霉
素生物活性单位比原出发菌株提高 50% 以上，且 C
组分较出发菌株的低，为工业化生产新霉素奠定了
基础。
参 考 文 献
［1］ Rinehart KL Jr, Stroshane RM. Biosynthesis of aminocyclitol
antibiotics［J］. Journal of Antibiotics, 1976, 29（4）：319-353.
［2］ Huang F, Spiteller D, Koorbanally NA, et al. Elaboration of
neosamine rings in the biosynthesis of neomycin and butirosin［J］.
Chembiochem, 2007, 8（3）：283-288.
［3］ Waksman SA, Lechevalier HA. Neomin, a new antibiotic
active streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis
organisms［J］. Science, 1949, 109（3）：305-307.
［4］ Mehta R, Champney WS. Neomycin and paromomycin inhibit 30S
ribosomal subunit assembly in Staphylococcus aureus［J］. Current
Microbiology, 2003, 47（3）：237-243.
［5］ Hu GF. Neomycin inhibits angiogenin-induced angiogenesis［J］.
Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95（17）：9791-9795.
［6］ Hu GF. Neomycininhibits the angiogenic activity of fibroblast and
epidermal growth factors［J］. Biochem Biophys Res Commun,
2001, 287（4）：870-874.
［7］ 魏社鹏 , 吴惺 , 周范民 . 新霉素联合苯丁酸钠对脑胶质瘤抑制
作用的机制研究［J］. 中国临床神经科学 , 2005, 13（1）：31-
35.
［8］ 顾觉奋 , 陈丽萍 . 新霉素 A、B 及其衍生物抗 HIV 作用的研究
［J］. 国外医药 ：抗生素分册 , 2008, 29（4）：154-159.
［9］ Chater KF, Bruton CJ. Resistance, regulatory and production genes
for the antibiotic methylenonycin are clustered［J］. EMBO J,
1985, 4 ：1893-1897.
［10］ 涂国全 , 钟承赞 , 黄林 , 等．通过获得链霉素抗性基因突变株
筛选小诺霉素高产菌株［J］．微生物学通报 , 2004, 31（4）：
19-22．
［11］ 陶 纯 长 , 谌 颉 , 郭 美 锦 , 等 . 链 霉 素 抗 性 突 变 理 性 筛 选
avermectin 高产菌株［J］. 中国抗生素杂志 , 2002, 27（9）：
521-523, 528
［12］ 孙玉雯 , 崔承彬 . 抗生素抗性筛选在微生物菌株选育中的作
用［J］. 国际药学研究杂志 , 2008, 35（3）：213-217.
［13］ Hosoya Y, Okamoto S, Muramatau H, et al. Acquisition of certain
streptomycin-resistant（str）mutations enhances antibiotic
production in bacteria［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1998,
42（8）：2041—2047．
［14］ 刘体颜 , 邢玉华 , 戴素琴 , 等 . 达托霉素生产菌（ATCC31568）
的紫外诱变和抗生素抗性筛选［J］. 中国抗生素杂志 , 2013,
38（9）：664-669.
［15］ 滕慧 , 张亚雄 . 复合诱变选育新霉素高产菌株的研究［J］. 中
国酿造 , 2008（13）：37-39.
［16］ 胡莎莎 , 刘春磊 , 孙秀秀 , 等 . 抗生素产生菌核糖体相关基
因改变与次级代谢产物的生物合成［J］. 中国抗生素杂志 ,
2012, 37（6）：443-442.
［17］陈代杰 , 李燕 . 细菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性与抗生素产
生菌的推理选育［J］. 中国医药工业杂志 , 2001, 32（2）：85-
89.
（责任编辑 李楠）