全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１３ꎬ２７(６):０８１１ ~ ０８１６
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期:２０１２￣１２￣２８　 接受日期:２０１３￣０５￣０３
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(２０１２０３０４０)ꎬ河南省 ２０１０ 年扶持企业自主创新招标项目
作者简介:邢广旭(１９７８￣)ꎬ男ꎬ河南舞阳人ꎬ博士研究生ꎬ助理研究员ꎬ主要研究方向为食品安全检测ꎮ Ｔｅｌ: ０３７１￣６５７３８１７９ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｘｉｎｇｇｕａｎｇｘｕ
＠ １６３. ｃｏｍ
通讯作者:张改平(１９６０￣)ꎬ男ꎬ河南内黄人ꎬ研究员ꎬ研究方向为动物免疫和快速检测技术ꎮ Ｔｅｌ:０３７１￣６５７１１３６４ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｇａｉｐｉｎｇ２００３＠ １６３.
ｃｏｍ
文章编号:１０００￣８５５１(２０１３)６￣０８１１￣０６
新霉素快速半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制与应用
邢广旭１ꎬ２ 　 王方雨１ 　 胡骁飞１ 　 邓瑞广１ 　 张改平１
( １ 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室ꎬ河南 郑州　 ４５０００２ꎻ２ 河南农业大学牧医工程学院ꎬ河南 郑州　 ４５００００)
摘　 要:本研究利用已经筛选的抗新霉素单克隆抗体ꎬ直接与辣根过氧化物酶相偶联ꎬ确定其相应的工作
浓度ꎬ建立了快速半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒ꎮ 结果表明ꎬ本研究研制的新霉素(ＮＥＯ)阻断 ＥＬＩＳＡ 试剂盒可
在 ３０ｍｉｎ内进行半定量检测ꎬ其特异性较强ꎬ与其它氨基糖苷类抗生素的交叉反应均比较低ꎻ试剂盒的
在奶样、饲料和肌肉样品的检测限均为 １μｇ􀅰Ｌ － １ꎻＮＥＯ￣Ｋｉｔ在 ４℃至少可以保存 ６ 个月以上ꎻ试剂盒与液
相色谱 －二级质谱联用方法检测新鲜奶样中 ＮＥＯ含量的结果比较之间无显著差异ꎻ对相同浓度的 ＮＥＯ
样品回收率无显著差异ꎮ ＮＥＯ快速半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒的成功研制有助于进行现场样品检测ꎬ为检测
ＮＥＯ药物的滥用提供了新的快捷检测手段ꎮ
关键词:新霉素ꎻ快速半定量ꎻＥＬＩＳＡꎻ牛奶ꎻ饲料ꎻ肌肉
　 　 新霉素(ＮｅｏｍｙｃｉｎꎬＮＥＯ)与链霉素、卡那霉素ꎬ庆
大霉素同属于氨基糖苷类抗生素ꎬ是最早被发现的 ２
－脱氧链霉胺(２ － ＤＯＳ)氨基糖苷类抗生素[１]ꎮ ＮＥＯ
对革兰氏阴性、阳性菌及结核杆菌等均有较好的抑制
作用ꎬ其抗菌谱较广ꎻ作为一种常用兽药ꎬＮＥＯ 也广泛
地应用于奶牛相关疾病的治疗ꎬ如子宫内膜炎和乳房
炎等ꎻ同时因为其抗菌谱较广的特性ꎬＮＥＯ 也用于饲
料生产ꎮ 但随着生产企业的安全用药意识淡薄及对利
益的无限追逐ꎬ药物的滥用也日益突出ꎬ一些养殖及相
关生产单位超量长期不合理用药所造成的 ＮＥＯ 残留
问题ꎬ已经引起广泛关注且严重威胁了消费者的健康ꎮ
肾毒性和耳毒性是 ＮＥＯ残留的主要特征ꎬ可能影响脑
神经而造成不可逆性耳聋[２ － ３]ꎮ 目前ꎬ农业部 ２３５ 号
公告(２００２)规定牛奶中 ＮＥＯ最高残留限量为 ５００μｇ􀅰
Ｌ － １[４ － ５]ꎬ世界上主要的其它国家也都对 ＮＥＯ 的残留
做出了限量标准ꎮ ＮＥＯ残留的检测包括微生物法、化
学法和免疫学测定ꎮ 微生物法检测 ＮＥＯ 残留是通常
检测抗生素效价的方法ꎬ具备一定的灵敏度ꎬ但是其步
骤比较麻烦ꎮ 化学检测方法主要包括旋光法、比色测
定、色谱技术等ꎬ化学检测方法操作快速方便ꎬ比较适
用于纯品的检测ꎬ是当前监管单位的主要检测手段ꎮ
化学方法的缺点是需要比较昂贵的仪器设备ꎬ而且样
品也需要比较复杂的提取处理ꎬ这制约了本方法的现
场应用ꎮ 为了解决当前检测 ＮＥＯ 现场检测手段欠缺
这一实事ꎬ基于本研究室已研制的 ＮＥＯ 单克隆抗体ꎬ
以快速简便实用为主要目的ꎬ本研究研制了快速半定
量检测 ＮＥＯ残留 ＥＬＩＳＡ试剂盒ꎬ实现 ２０ ~ ３０ｍｉｎ内初
步评估 ＮＥＯ的含量ꎬ本研究还对试剂盒的性能进行评
价ꎬ为 ＮＥＯ残留检测提供技术支撑ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 试剂、溶液及仪器
本研究在河南省动物免疫学重点实验室制备了新
霉素单克隆抗体(ＮＥＯ ｍＡｂ)和 ＮＥＯ￣ＯＶＡ 包被抗原ꎻ
ＮＥＯ、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、沙丁胺醇均购于 Ｓｉｇｍａ
公司ꎻ氨基糖苷类抗生素(包括庆大霉素、土霉素、链
霉素、二氟沙星、环丙沙星等)均购于中国兽医药品监
察所ꎻ其他所用常规试剂为市场所购ꎬ均为分析纯级ꎮ
工作洗液为含 Ｔｗｅｅｎ － ２０(０􀆰 ０５％ )的磷酸盐缓冲
液(０􀆰 ０１ｍｏＬ􀅰Ｌ － １ ｐＨ值 ７􀆰 ４)ꎻ包被液为碳酸盐缓冲液
(０􀆰 ０５ｍｏＬ􀅰Ｌ － １ ｐＨ 值 ９􀆰 ６)ꎻＥＬＩＳＡ 试验的封闭液用
１１８
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
ＰＢＳＴＳ配制的牛血清液(５％ )、工作洗液为稀释液ꎻ用
四甲基联苯胺(ＴＭＢ)的磷酸 －柠檬酸缓冲液作为显
色液ꎻ用 ２ ｍｏＬ􀅰Ｌ － １的 Ｈ２ＳＯ４作为终止液ꎮ ＮＥＯ 标准
品根据所需浓度用 ＰＢＳ配制ꎮ
主要仪器:５５０ 型酶标仪(美国 Ｂｉｏ￣Ｒａｄ 公司)ꎻ
ＡＥ２６０ 电子天平(德国梅特勒 －托利多公司)ꎻＥＬｘ －
５０ 型洗板机(美国宝特公司)ꎻＤＵ －６００ 核酸蛋白分析
仪(德国贝克曼公司)ꎮ
１􀆰 ２　 新霉素单抗 －辣根过氧化酶(ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ)
的标记
(１)将 ＨＲＰ(５ｍｇ)溶解于 １ｍＬ 双蒸水中ꎮ
(２)将 ０􀆰 ２ｍＬ现配的 ＮａＩＯ４ 溶液(０􀆰 １ｍｏｌ􀅰Ｌ － １)加
入到 (１ )溶液中ꎬ用锡纸包好于室温条件下搅拌
２０ｍｉｎꎮ
(３)将搅拌后的溶液于 ４℃条件透析 １２ｈꎮ
(４)为了调节 ｐＨ值到 ９􀆰 ０ ~ ９􀆰 ５ꎬ加入碳酸盐缓冲
液(０􀆰 ２ｍｏｌ􀅰Ｌ － １ꎬ ｐＨ９􀆰 ５)２０μＬꎬ接着加入 １０ｍｇＮＥＯ单
克隆抗体ꎬ于室温条件避光反应 ２ｈꎮ
(５)加入 ０􀆰 １ｍＬ现配硼氢化钠液(４ｍｇ􀅰ｍＬ － １)ꎬ混
合均匀ꎬ于 ４℃条件下反应 ２ｈꎮ
(６)用 ＰＢＳ 将上述溶液透析ꎬ于 ４℃条件反应
１２ｈꎮ
(７)在上述溶液中逐滴加入相同体积的饱和硫酸
铵并不断搅拌ꎬ于 ４℃条件下放置 １ｈꎮ
(８)于离心机上离心 ３０ｍｉｎ(３０００ｒ􀅰ｍｉｎ － １)ꎮ 用半
饱和硫酸铵冲洗沉淀物 ２ ~ ３ 次ꎬ然后用 ＰＢＳ 将沉淀
物溶解ꎮ
(９)将上述溶液透析ꎬ去除铵离子后ꎬ离心 ３００ｍｉｎ
(１００００ｒ􀅰ｍｉｎ － １)以去除沉淀ꎬ用 ５０％甘油将上清液分
装置于 － ２０℃条件下保存ꎮ
１􀆰 ３　 ＮＥＯ半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒建立
１􀆰 ３􀆰 １　 确定 ＮＥＯ 包被物和酶标记 ＮＥＯ 单克隆抗体
的工作浓度　 分别用不同倍比稀释的 ＮＥＯ￣ＯＶＡ 包被
ＥＬＩＳＡ板ꎬ然后确定相应的 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ 工作浓度ꎬ
加入显色液后ꎬ酶标仪读取各孔 ＯＤ４５０值ꎬ选择孔 ＯＤ４５０
值在 １􀆰 ０ 左右时的 ＮＥＯ￣ＯＶＡ 和 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ 为最
佳工作浓度ꎬ其具体测定步骤参照 Ｔｉｊｓｓｅｎ[１４]ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ２　 ＮＥＯ 试剂盒标准点的选择　 依据阻断 ＥＬＩＳＡ
对不同浓度 ＮＥＯ标准品的抑制率ꎬ分别设定抑制率为
１００％ 、５０％和小于 １０％时的 ＮＥＯ浓度为标准点ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 ＮＥＯ 试剂盒的主要配置　 主要包括有缓冲浓
缩液ꎬ包被好的酶标板ꎬ浓缩的 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ 溶液ꎬ６
个 ＮＥＯ标准品ꎬ显色液及终止液等ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ４　 ＮＥＯ试剂盒的检测步骤和结果判定
(１)主要步骤:第一步ꎬ将 ２５０μＬ 的缓冲工作液注
入酶标板内ꎬ于室温条件下放置 ５ｍｉｎ后甩干ꎻ第二步ꎬ
将 ６ 份标准品或相应的待检样品 ５０μＬ 加入相应的酶
标板内ꎬ再加入 Ｃ１ 号液 ５０μＬꎬ室温条件下放置
１０ｍｉｎꎬ用缓冲工作液冲洗 ６ 次ꎬ并甩干ꎻ第三步ꎬ每孔
加入 ３、４ 号液各 ５０μＬꎬ室温反应 １０ｍｉｎꎻ第四步ꎬ每孔
加入 ５ 号液 ５０μＬꎬ可直接目测结果ꎬ或用酶标仪
(４５０ｎｍ)读值ꎮ
(２)结果判定:直接目测样品测定孔的颜色ꎬ若测
定样品的颜色较标准 １ 的颜色深ꎬ则说明样品中不含
ＮＥＯꎻ若测定样品的颜色较标准 ２ 的颜色深ꎬ较标准 １
的颜色浅ꎬ则说明测定样品中 ＮＥＯ 的含量大于 ０μｇ􀅰
Ｌ － １ꎬ而小于 ５０μｇ􀅰Ｌ － １ꎻ若测定样品的颜色较标准 ３ 的
颜色深ꎬ较标准 ２ 的颜色浅ꎬ则说明测定样品中 ＮＥＯ
的含量大于 ５０μｇ􀅰Ｌ － １ꎬ而小于 １００μｇ􀅰Ｌ － １ꎻ若测定样
品的颜色较标准 ３ 的颜色浅ꎬ则说明测定样品中 ＮＥＯ
的含量大于 １００μｇ􀅰Ｌ － １ꎮ 直接目测结果均有 ３ 人同时
判定ꎬ以至少 ２ 人判定相同结果为准ꎮ
用酶标仪读取各孔在 ４５０纳米处的吸光值ꎬ则直接
依据所读数值的范围进行判定ꎮ 测定样品的读值大于
标准 １的读值ꎬ则说明样品中不含 ＮＥＯꎻ若测定样品的
读值大于标准 ２ 的读值ꎬ小于标准 １ 的读值ꎬ则说明测
定样品中 ＮＥＯ的含量大于 ０μｇ􀅰Ｌ －１ꎬ而小于 ５０μｇ􀅰Ｌ －１ꎻ
若测定样品的读值大于标准 ３ 的读值ꎬ小于标准 ２ 的读
值ꎬ则说明测定样品中ＮＥＯ的含量大于５０μｇ􀅰Ｌ －１ꎬ而小
于 １００μｇ􀅰Ｌ －１ꎻ若测定样品的读值小于标准 ３ 的读值ꎬ
则说明测定样品中 ＮＥＯ的含量大于 １００μｇ􀅰Ｌ －１ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ５　 检测样品的前处理　 奶样的前处理:新鲜牛奶
样品需离心 １０ｍｉｎ[１９０００ × ｇ (ＲＣＦ)]以去除脂肪和
沉淀ꎬ用 ＰＢＳ将中间清液稀释至 １０ 倍后用于检测ꎮ
饲料的前样品:将饲料样品研碎ꎬ称取 ３􀆰 ０ｇꎬ加入
３０ ｍＬ ＰＢＳ溶液ꎬ温度条件下充分搅拌 ３０ｍｉｎꎬ于 ４℃
条件下离心 １０ｍｉｎ(４０００ｒ􀅰ｍｉｎ － １)ꎬ除去上清后即可用
于测定ꎮ
肌肉样:将肌肉匀浆ꎬ准确称取 ５ｇꎬ加入 ５ｍＬ ５％
的三氯乙酸(ＴＣＡ)涡旋 １ ｍｉｎꎬ震荡 １５ｍｉｎꎬ３７℃放置
３０ｍｉｎꎬ于 ４℃条件下离心 １０ｍｉｎ(６０００ｒ􀅰ｍｉｎ － １)ꎬ将上
清稀释 １０ 倍(用 ＰＢＳ稀释)混匀后进行测定[１５]ꎮ
１􀆰 ４　 ＮＥＯ试剂盒性能测定
１􀆰 ４􀆰 １　 检测限　 用本单位制作的 ３ 个不同批次试剂
盒分别测定 ０􀆰 ５、１、１􀆰 ５ 和 ２μｇ􀅰Ｌ － １的奶样、饲料和肌
肉样品各 ２０ 份ꎬ通过颜色反应并对其结果进行判定ꎬ
以对试剂盒的检测限进行判定ꎮ
２１８
　 ６ 期 新霉素快速半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制与应用
１􀆰 ４􀆰 ２　 特异性　 ＮＥＯ 及其他氨基糖苷类抗生素及相
关药物(主要包括庆大霉素、链霉素、土霉素ꎻ沙丁胺
醇、环丙沙星、二氟沙星、磺胺嘧啶及磺胺甲噁唑)作
为竞争物ꎬ测定 ＮＥＯ 单克隆抗体对各竞争物的半数抑
制浓度ꎬ按照公式计算不同竞争物的交叉反应率[１７]ꎮ
１􀆰 ４􀆰 ３　 假阳性率实验　 用研制的 ３ 个批次试剂盒测
定奶样、饲料和肌肉阴性样品各 ２０ 份ꎬ观察颜色反应
并对其结果进行判定ꎬ统计假阳性数ꎬ按照下列公式计
算假阳性率:
假阳性率 ＝假阳性数 / ６０ × １００％
１􀆰 ４􀆰 ４　 假阴性率　 用研制的 ３ 个批次试剂盒测定添
加终浓度分别为 ２􀆰 ０、４􀆰 ０、８􀆰 ０、１６􀆰 ０μｇ􀅰Ｌ － １奶样、饲料
和肌肉阴性样品各 １０ 份ꎬ观察颜色反应并对其结果进
行判定ꎬ统计假阳性数ꎬ按照下列公式计算假阴性率:
假阴性率 ＝假阴性数 / １２０ × １００％
１􀆰 ４􀆰 ５　 保存期验证 　 用 ３ 个不同批次的 ＮＥＯ 试剂
盒ꎬ于 ４℃条件下分别放置 １、３０、６０、９０、１２０、１５０ 和
１８０ ｄꎬ并检测结果ꎬ计算其相应的曲线相关系数ꎬ确定
试剂盒的保存期ꎮ
１􀆰 ４􀆰 ６　 与仪器方法(ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ)结果的比较 　 将
阴性牛奶样品配制设定的 ＮＥＯ 含量(含 ＮＥＯ 为 ２０、
４０、８０ 和 １６０μｇ􀅰Ｌ － １)各 １０ 份ꎮ 分别运用本单位研制
的试剂盒和仪器方法(ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ)ꎬ进行平行测定
并比较二者的结果[９]ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 新霉素半定量检测方法的建立
由表 １ 可以看出ꎬ在 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ 稀释倍数为
３２０００ 倍ꎬＯＤ４５０值为 ０􀆰 ９９５ꎬ确定 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ 与
ＮＥＯ￣ＯＶＡ的最佳工作浓度为 １∶ ３２０００ 和 １∶ ２０００ꎮ 通
过 ＮＥＯ 标准的抑制实验ꎬ结果显示 ５０％抑制率时的
ＮＥＯ浓度为 ５μｇ􀅰Ｌ － １ꎮ
２􀆰 ２　 ＮＥＯ半定量试剂盒的配置
由表 ２ 可以看出ꎬ本剂盒主要包括:ＮＥＯ￣ＯＶＡ 最
佳工作浓度包被的酶标板一块ꎻ１ 号液(最佳工作浓度
ＮＥＯ ＭＡＢ￣ＨＲＰ)ꎬ２ 号液(显色液 Ａ)、３ 号液(显色液
Ｂ)ꎬ４ 号终止液(２Ｍ Ｈ２ＳＯ４)及浓缩缓冲液(２０ × )各 １
瓶ꎻ ＮＥＯ 标准品 １、 ２、 ３ ( ０、 ５􀆰 ０、 １０􀆰 ０μｇ􀅰Ｌ － １ ) 各
０􀆰 ５ｍＬꎮ 其它试验所需物品由使用都自行配备ꎮ
２􀆰 ３　 新霉素半定量检测试剂盒的性能
２􀆰 ３􀆰 １　 试剂盒检测限 　 用研制试剂盒测定 ０􀆰 ５、１、
１􀆰 ５ 和 ２μｇ􀅰Ｌ － １的奶样、饲料和肌肉样品各 ２０ 份ꎬ通过
颜色反应并对其结果进行判定ꎬ判定试剂盒的检测限ꎮ
测定结果列于表 ３ꎬ从结果中可以看出ꎬ１μｇ􀅰Ｌ － １的各
测定样品测定 ＯＤ值均显著低于标准品 １ꎬ因此试剂盒
的在奶样、饲料和肌肉样品的检测限均为 １μｇ􀅰Ｌ － １ꎮ
表 １　 ＮＥＯ￣ＯＶＡ与 ＮＥＯ ｍＡＢ￣ＨＲＰ
工作浓度的测定
Ｔａｂｌｅ １　 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＯ￣ＯＶＡ ａｎｄ
ＮＥＯ ｍＡＢ￣ＨＲＰ ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ＮＥＯｍＡｂ￣ＨＲＰ稀释倍数
Ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＯｍＡｂ￣ＨＲＰ
ＮＥＯ￣ＯＶＡ稀释倍数
Ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＯ￣ＯＶＡ
１０００ ２０００ ４０００ ８０００
１０００ ( ＋ ) ( ＋ ) ( ＋ ) ２􀆰 ２４４
２０００ ( ＋ ) ( ＋ ) ( ＋ ) ２􀆰 １６２
４０００ ( ＋ ) ( ＋ ) ２􀆰 ８１９ １􀆰 ３６６
８０００ ( ＋ ) ( ＋ ) １􀆰 ７０９ ０􀆰 ８２５
１６０００ ３􀆰 ２１７ ２􀆰 ０９５ ０􀆰 ７８２ ０􀆰 ４７３
３２０００ １􀆰 ５７ ０􀆰 ９９５ ０􀆰 ４５５ ０􀆰 ２３６
　 　 注:( ＋ )代表读值过高ꎬ超过酶标仪读值范围ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｐｌｕｓ ｓｉｇｎ ( ＋ ) ｍｅａｎｓ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｔｏｏ ｈｉｇｈꎬ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ｍｏｒｅ
ｔｈａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｅｒ ｒｅａｄｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｖａｌｕｅｓ.
表 ２　 ＮＥＯ半定量检测试剂盒的标准配置
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＯ ＥＬＩＳＡ￣ｋｉｔ
序号
Ｎｕｍｂｅｒ
名称
Ｎａｍｅ
数量
Ｃｏｕｎｔ
单位
Ｕｎｉｔ
规格
Ｑｕａｎｔｉｔｙ
备注
Ｒｅｍａｒｋｓ
１ ＥＬＩＳＡ酶标板 １ 块 ８ × １２ 孔 或 １２ × ８ 孔
２ ２０ ×浓缩缓冲液 １ 瓶 ３０ｍＬ 稀释后使用
３ １ 号液 １ 管 ７ｍＬ － ２０℃保存
４ ２ 号液 １ 管 ７ｍＬ ４℃保存
５ ３ 号液 １ 瓶 ７ｍＬ ４℃保存
６ ４ 号液 １ 瓶 ７ｍＬ 常温保存
７ 标准品 １ １ 管 ０􀆰 ５ｍＬ ０μｇ􀅰Ｌ － １
８ 标准品 ２ １ 管 ０􀆰 ５ｍＬ ５μｇ􀅰Ｌ － １
９ 标准品 ３ １ 管 ０􀆰 ５ｍＬ １０μｇ􀅰Ｌ － １
２􀆰 ３􀆰 ２　 试剂盒特异性　 分析表 ４ 的试验结果可知ꎬ本
单位研制的 ＮＥＯ半定量检测试剂盒特异性较好ꎬ和其
他相关药物的交叉反应率(ＣＲ％ )均较低ꎮ
２􀆰 ３􀆰 ３　 试剂盒假阳性率　 表 ５ 结果表明ꎬ新霉素试剂
盒对鲜奶样、饲料样和肉样阴性样品进行测定ꎬ计算其
假阳性率为 ０％ ꎮ
２􀆰 ３􀆰 ４　 试剂盒假阴性率　 由表 ６ 可知ꎬ用研制试剂盒
测定添加终浓度分别为 ２􀆰 ０、４􀆰 ０、８􀆰 ０、１６􀆰 ０μｇ􀅰Ｌ － １奶
样、饲料和肌肉阴性样品各 １０ 份ꎬ通过颜色反应并对
３１８
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
　 　 　 　 　 表 ３　 ＮＥＯ￣ｋｉｔ的检测限
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＥＯ￣ｋｉｔ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
批次
Ｂａｔｃｈ
不同添加浓度 / (μｇ􀅰Ｌ － １)
Ａｄｄｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
０􀆰 ５ １􀆰 ０ １􀆰 ５ ２􀆰 ０
标准 １ 的测
定 ＯＤ
ＯＤ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ １
鲜奶样 ２０１１１０２０ １. ０００ ０. ８５１ ０. ８０５ ０. ７４６ ０. ９９６
２０１１１１０２ １. ０８０ ０. ８４２ ０. ８０９ ０. ７５０ １. ０００
２０１１１２１３ ０. ９９６ ０. ８５０ ０. ７９９ ０. ７３９ １. ０４０
饲料　 ２０１１１０２０ １. １０８ ０. ９０３ ０. ８６５ ０. ７２３ １. ０１５
２０１１１１０２ １. ００５ ０. ８９８ ０. ８１１ ０. ７３９ ０. ９８６
２０１１１２１３ １. １２２ ０. ９０８ ０. ８０８ ０. ７４２ ０. ９９３
肌肉　 ２０１１１０２０ １. １０４ ０. ８３１ ０. ７９５ ０. ７０１ ０. ９８３
２０１１１１０２ １. ０３１ ０. ８８９ ０. ８１０ ０. ７１５ ０. ９９３
２０１１１２１３ １. ０５６ ０. ８９７ ０. ８１５ ０. ７３２ ０. ９８５
表 ４　 ＮＥＯ￣ｋｉｔ与其他相关药物的交叉反应率
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＮＥＯ￣ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ
药物
半数抑制浓度
ＩＣ５０ / (μｇ􀅰Ｌ － １)
交叉反应率
新霉素 Ｎｅｏｍｙｃｉｎ ５􀆰 ０ １００
庆大霉素 Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ > １０４ < ０􀆰 １
链霉素 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ > １０４ < ０􀆰 １
土霉素 Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ > １０４ < ０􀆰 １
环丙沙星 Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ > １０４ < ０􀆰 １
二氟沙星 Ｄｉｆｌｏｘａｃｉｎ > １０４ < ０􀆰 １
沙丁胺醇 Ｓａｌｂｕｔａｍｏｌ > １０４ < ０􀆰 １
磺胺嘧啶 Ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ > １０４ < ０􀆰 １
磺胺甲噁唑 Ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ > １０４ < ０􀆰 １
表 ５　 ＮＥＯ￣Ｋｉｔ试剂盒假阳性率
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＮＥＯ
样品
Ｓａｍｐｌｅ
阳性结果 /测定总数
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔ / Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ
假阳性率
Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ / ％
鲜奶样 ０ / ２０ ０
饲料样 ０ / ２０ ０
肉样　 ０ / ２０ ０
其结果进行判定ꎬ其假阳性数假阳性率为 ０％ ꎮ
２􀆰 ３􀆰 ５　 试剂盒的保存期　 由试验的结果得出ꎬ随着试
剂盒保存时间的延长ꎬ其测定标准品的吸光值有下降
的趋势ꎬ半数抑制有升高的趋势ꎬ但均在合理的变化范
围内ꎬ曲线的相关系统均良好ꎬ说明该试剂盒在 ４℃条
件下可以保存 １８０ｄ以上ꎮ
表 ６　 ＮＥＯ￣Ｋｉｔ试剂盒假阴性率
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ ＮＥＯ (ｎ ＝１２０)
样品
Ｓａｍｐｌｅ
ＮＥＯ添加量
Ａｄｄｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｉｏｎ
ｏｆ ＮＥＯ
测定值(Ｘ)
Ｍｅａｓｕｒｅｄ ｖａｌｕｅ
假阴性数 /测定总数
Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ / Ｔｏｔａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
鲜奶样 ２ ０ < Ｘ < ５ ０ / ４０
Ｆｒｅｓｈ ｍｉｌｋ ４ ０ < Ｘ < ５
８ ５ < Ｘ < １０
１６ １０ < Ｘ
饲料样 ２ ０ < Ｘ < ５ ０ / ４０
Ｆｅｅｄ ４ ０ < Ｘ < ５
８ ５ < Ｘ < １０
１６ １０ < Ｘ
肉样 ２ ０ < Ｘ < ５ ０ / ４０
Ｍｅａｔ ４ ０ < Ｘ < ５
８ ５ < Ｘ < １０
１６ １０ < Ｘ
２􀆰 ３􀆰 ６　 ＮＥＯ半定量检测试剂盒与仪器法测定的结果
比较　 试验结果(表 ７)表明ꎬＮＥＯ 半定量检测试剂盒
的测定值和 ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ 法检测结果间无显著差异ꎻ
且两者的添加回收率也无显著差异ꎮ
表 ７　 ＮＥＯ半定量试剂盒与仪器方法
(ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ)回收率比较
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ＮＥＯ￣Ｋｉｔ
ａｎｄ ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ
ＮＥＯ添加量
ＮＥＯ Ａｍｏｕｎｔ / (μｇ􀅰Ｌ － １)
测定值 Ｔｅｓｔｅｄ ｖａｌｕｅ / (μｇ􀅰Ｌ － １)
ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ ＮＥＯ￣Ｋｉｔ
２０ １８􀆰 ９ ± ０􀆰 １８ａ ０ < Ｘ < ５０
４０ ３７􀆰 ８７ ± ０􀆰 １８ａ ０ < Ｘ < ５０
８０ ７８􀆰 ９ ± ０􀆰 ６２ａ ５０ < Ｘ < １００
１６０ １５８􀆰 ５３ ± １􀆰 ７５ａ １００ < Ｘ
　 　 注:肩标不同代表差异显著 Ｐ < ０􀆰 ０５ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｖａｌｕｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｍｅ ｌｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ (Ｐ < ０􀆰 ０５) .
３　 讨论
由于 ＮＥＯ是一种高产广谱的抗生素ꎬ因此在畜牧
生产过种中广泛应用ꎬ但在残留的强毒性对人类的健
康存在潜在危害[２ － ３]ꎬ所以构建能于现场或于简单实
验室条件下进行快速检测 ＮＥＯ的方法具有重要意义ꎮ
目前兽药残留的常用分析方法中ꎬ免疫学分析方法ꎬ特
别是酶联免疫吸附测定实验(ＥＬＩＳＡ)是最为常用的分
４１８
　 ６ 期 新霉素快速半定量 ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制与应用
析方法ꎬ其应用也比较普遍[１８ － １９]ꎮ 在实际操作中ꎬ
ＥＬＳＡ的操作仍然相对麻烦ꎬ不能应用于现场检测ꎮ
利用本实验室已有的抗新霉素单克隆抗体ꎬ本研究制
备了快速半定量新霉素检测试剂盒ꎮ 因此本试验采用
ＨＲＰ标记 ＮＥＯ ｍＡｂꎬ既减少了操作步骤ꎬ缩短了反应
时间ꎬ也可不用酶标仪读值ꎬ直接用肉眼判定样品的大
概含量ꎬ具有一定的现场检测优势ꎮ
３􀆰 １　 半定量检测试剂盒方法的建立
本研究将偶联好的包被原(ＮＥＯ￣ＯＶＡ)包被于酶
标板中ꎬ让待检样品或标准样品中的 ＮＥＯ 与 ＮＥＯ
ｍＡｂ￣ＨＲＰ竞争结合ꎬ当反应完全后ꎬ洗去多余的样品
和 ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰꎬ最后利用 ＴＭＢ显色系统进行显色ꎬ
用硫酸终止反应ꎮ 依据颜色的深浅来判断 ＮＥＯ 与
ＮＥＯ ｍＡｂ￣ＨＲＰ结合多少ꎬ参照标准浓度的显色情况ꎬ
最终判定待检样品中 ＮＥＯ的含量ꎮ
３􀆰 ２　 ＮＥＯ￣Ｋｉｔ的性能
半定量试剂盒的性能主要包括检测限ꎬ假阳性率ꎬ
假阴性率ꎬ保质期等几个方面ꎮ
一般认为亲和常数为 １０７ ~ １０１２Ｌ􀅰ｍｏｌ － １抗体为高
亲和力抗体[２０]ꎬ本研究中的抗新霉素单克隆抗体亲和
常数为 ３􀆰 ７５ × １０１０Ｌ􀅰ｍｏｌ － １ꎬ这为试剂盒的敏感性打下
了坚实的基础ꎮ 本研究所设计组装的 ＮＥＯ￣Ｋｉｔ检测限
为 １􀆰 ０μｇ􀅰Ｌ － １ꎮ 本研究制备的 ＮＥＯ 半定量检测试剂
盒ꎬ与其他相关药物的交叉反应率均很低ꎬ说明其特异
性良好ꎮ
试验表明试剂盒的假阳性率和假阴性率均为
０％ ꎬ其原因有两个方面ꎬ一是 ＮＥＯ ｍＡｂ 的特异性比
较高ꎬ二是样品均经过相应的稀释液 １０ 倍稀释ꎬ这也
降低了其它杂质的干扰ꎮ 本试验还进行了不同批次在
不同保存时间的比较研究ꎬ结果显示试剂盒的批间差
和批内差异均在限定范围ꎬ而且保存半年也不影响其
测定结果ꎮ 本试验同时测定了奶样、饲料样和肉中的
添加对比ꎬ结果显示按照正确的样品处理程序ꎬ试剂盒
在 ２ 种基质中均能良好反应ꎮ
新霉素半定量试剂盒对不同浓度的 ＮＥＯ 样品测
定结果分析ꎬ并与仪器方法(ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ)测定结果
无明显差异ꎬ说明本试剂盒的测定结果可靠性高ꎬ完全
可以在实际生产中运用ꎮ
４　 结论
综上所述ꎬ本研究在高灵敏高特性抗新霉素单克
隆抗体的基础上制备了能快速半定量检测的新霉素阻
断 ＥＬＩＳＡ 试剂盒ꎬ可以不需配备额外的仪器和设备ꎬ
完全能够实现现场实时检测ꎮ 因此新霉素快速半定量
ＥＬＩＳＡ试剂盒的研制ꎬ为新霉素的滥用提供了一种新
的现场半定量检测手段ꎬ将有助于对新霉素药物的违
规滥用加强监督ꎬ为保障广大群众的身体安全提供有
力的技术支撑ꎮ
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Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｎｅｏｍｙｃｉｎ
ＸＩＮＧ Ｇｕａｎｇ￣ｘｕ１ꎬ２ 　 ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ￣ｙｕ１ 　 ＨＵ Ｘｉａｏ￣ｆｅｉ１ 　 ＤＥＮＧ Ｒｕｉ￣ｇｕａｎｇ１ 　 ＺＨＡＮＧ Ｇａｉ￣ｐｉｎｇ１
( １Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ Ｈｅｎａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕꎬ Ｈｅｎａｎꎬ ４５０００２ꎻ２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕꎬ Ｈｅｎａｎ　 ４５００００)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｂａｓｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｎｅｏｍｙｃｉｎꎬ ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ( ＨＰＲ) ｗａｓ ｃｏｕｐｌｅｄ. Ｅｎｚｙｍｅ
Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ (ＥＬＩＳＡ) ｋｉｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＮＥＯ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＳａｎｄｗｉｃｈＢｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｄｅ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ａｎａｌｏｇｕｅ ｏｆ ＮＥＯꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ (ＬＯＤ) ｉｎ ｍｉｌｋꎬ ｆｅｅｄ ａｎｄ
ｍｕｓｃｌｅ ｗｅｒｅ １ ｍｉｃｒｏｇｒａｍｍｅ ｐｅｒ ｌｉｔｒｅꎬ ａｎｄ ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ ｄａｔｅ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ６ ｍｏｎｔｈ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＰＬＣ￣ＭＳ￣ＭＳ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｉｔ. Ｔｈｉｓ ｋｉｔ ｈｅｌｐｓ ｔｏ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎ ｔｈｅ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｄｒｕｇ ｉｌｌｅｇａｌ ａｂｕｓｅꎬ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔ
ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ ａｎｉｍａｌ ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:Ｎｅｏｍｙｃｉｎꎻ Ｓｅｍｉ￣ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ＥＬＩＳＡꎻ Ｍｉｌｋꎻ Ｆｅｅｄꎻ Ｍｕｓｃｌｅ
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