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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
新霉素（Neomycin）系由费氏链霉菌（Strepto-
myces fradiae）［1］产生的氨基糖苷类抗生素［2，3］，是
一种理想的干扰蛋白质合成的杀菌剂［4］，临床上主
要用于治疗胃肠道和呼吸道感染，同时新霉素能提
高饲料的利用率，促进禽畜生长，因此被广泛地应
用于畜牧业，生产绿色食品［5，6］，近年来市场对新
霉素的需求急剧增长。一些研究发现，新霉素能通
过阻遏成纤维生长因子和内皮生长因子来干扰血管
的形成，可能发展成为抗癌药物［7］，此外，还有研
收稿日期 ： 2014-05-28
基金项目 ：福建省自然科学基金项目（2012J01094）
作者简介 ：周璟明，女，硕士，助理研究员，研究方向 ：微生物药物 ；E-mail ：15752437@qq.com
通讯作者 ：张祝兰，研究员，研究方向 ：微生物药物 ；E-mail ：jessylan9963@sina.com
费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38 胞外产
新霉素的发酵条件优化
周璟明  陈宏  张祝兰  孙菲  张引  周剑  方东升
（福建省微生物研究所，福州 350007）
摘 要 ： 旨在对 Streptomyces fradiae FIM-S38 胞外产生的次级代谢产物新霉素进行发酵条件优化。采用单因素筛选结合正交
试验优化发酵培养基，探讨摇瓶发酵的主要影响因子初始 pH 值、装液量、转速等发酵参数的影响，确定了适宜发酵培养基组成和
较佳发酵参数 ：葡萄糖 6.0%，可溶性淀粉 3.5%，黄豆粉 2.0%，硫酸镁 0.1%，碳酸钙 0.3%，初始 pH7.0，装液量 50 mL/500 mL，
摇床转速 250 r/min，发酵温度 35℃，发酵时间 6 d，优化后的发酵水平较原生产工艺提高了 50% 以上。
关键词 ： 费氏链霉菌 新霉素 正交设计法 发酵 优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.015
Optimization of Fermentation Conditions for Neomycin-producing
Strain Streptomyces fradiae FIM-S38
Zhou Jingming Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jian Fang Dongsheng
（Fujian Institute of Microbiology，Fuzhou 350007）
Abstract: It was to optimize the fermentation conditions of neomycin producing by Streptomyces fradiae FIM-S38. The single factor
experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation medium and conditions of FIM-S38 in shake flasks. The
constituents of medium, the filling volume of shaking flask, the rotation speed and the temperature were the major factors that affected the yield
of neomycin. The composition of glucose 6.0%, soluble starch 3.5%, soybean meal 2.0%, MgSO4 0.1% and CaCO3 0.3% was selected to be the
medium formula, and the optimal fermentation parameters were as follows ：the filling volume 50 mL for a 500 mL shake flask, initial pH at 7.0,
shaker’s rotating speed 250 r/min, temperature 35℃, fermentation time 6 d, and the titer of neomycin was 50% higher than that in control.
Key words: Streptomyces fradiae Neomycin Orthogonal experiment Fermentation Optimization
究发现新霉素具有巨大的抗 HIV 潜力［8］。目前国内
新霉素生产中普遍存在发酵过程复杂、周期长，发
酵水平波动性大，低产率高单耗等严重缺陷，优良
新霉素菌种的发酵工艺优化已成为提高新霉素产量
和质量的关键途径。本课题组前期对新霉素生产菌
种 Streptomyces fradiae SF1109 进行抗性筛选获得一
株新霉素的抗性基因突变高产菌 Streptomyces fradiae
FIM-S38，本研究拟对 FIM-S38 的发酵培养基组成及
发酵参数进行优化，旨在为解决生产实际需要和提
2014年第12期 93周璟明等：费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38 胞外产新霉素的发酵条件优化
高新霉素市场竞争力奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 种 弗 氏 链 霉 菌 Streptomyces fradiae
FIM-S38， 指 示 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus
aureus CPCC160020，由福建省微生物研究所提供。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 斜面培养基 参照马林等［9］报道的斜面培
养基。
1.1.2.2 对照发酵培养基 参照滕慧等［10］报道的发
酵培养基。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 根据试验方案改变培养基组成及
培养条件，采用划线法将培养好的菌种接入装有 50
mL 发酵培养基的 500 mL 三角瓶中，34℃、220 r/min
培养 168 h，测定发酵效价和菌体生长量。
1.2.2 分析方法
1.2.2.1 效价检测 参照《中国药典》2010 版抗生
素微生物检定法（附录 XI A），效价为 3 次平均值，
以相对值标示。
1.2.2.2 菌体生长量测定 取 10 mL 发酵液于离心
管中，3 500 r/min 离心 10 min，测得沉淀物在发酵
液中的比例（Packed Mycelial Volume，PMV）即为
菌丝浓度。
1.2.3 统计学分析 采用 SPSS11.5 软件进行统计分
析，数据以均数 ± 标准差（x
-
± s）表示，组间比
较采用 t 检验。
2 结果
2.1 碳源的影响
以无碳源的对照发酵培养基，按 3.0% 的浓度
分别添加糊精、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、麦芽
糖等各种碳源发酵 FIM-S38，以 3.0% 糊精为碳源
的发酵培养基产新霉素的相对效价（Relative Titer，
RT，%）为 100，结果（表 1）表明，碳源种类对新
霉素产量的影响比对菌体生长大，FIM-S38 菌浓度
在 13.5%-16.3% 之间，可溶性淀粉和葡萄糖作为碳
源时，产新霉素水平较高。因此选择可溶性淀粉和
葡萄糖作为复合碳源。
表 1 碳源对 Streptomyces fradiae FIM-S38 生长及合成新
霉素的影响
碳源 RT（%） PMV（%）
糊精 100.0 14.7
可溶性淀粉 548.1 14.1
葡萄糖 526.8 16.3
甘油 80.1 15.8
麦芽糖 103.0 13.5
2.2 氮源的影响
用无氮源的对照培养基，按 3.0% 的浓度分别
添加蛋白胨、麸质粉、酵母粉、黄豆粉及玉米桨粉
等各种氮源发酵 FIM-S38，以 3.0% 蛋白胨为氮源的
发酵培养基产新霉素的相对效价为 100。结果（表 2）
表明，氮源种类对新霉素产量和菌体生长均影响明
显，添加蛋白胨 FIM-S38 菌体 PMV 在 13.5%，添加
麸质粉、酵母粉、黄豆粉及玉米桨粉，FIM-S38 菌
体 PMV 在 21.6%-30.8% 之间，其中黄豆粉作为氮
源时，产新霉素水平最高。因此选用 3.0% 黄豆粉作
为氮源。
表 2 氮源对 Streptomyces fradiae FIM-S38 生长及合成新
霉素的影响
氮源 RT（%） PMV（%）
蛋白胨 100.0 13.5
麸质粉 295.8 30.8
酵母粉 238.4 25.6
黄豆粉 376.9 21.6
玉米桨粉 115.9 30.3
2.3 无机盐的影响
在以 3.0% 黄豆粉为氮源的对照培养基中分别
加入少量的无机盐进行单因子试验，以不加无机盐
发酵产新霉素的 RT 为 100，结果（表 3）显示，培
养基中添加微量金属离子对 FIM-S38 菌体生长影响
较小，其 PMV 在 20.0%-23.5% 之间，铁、镁、钠、锌、
钙盐对 FIM-S38 合成新霉素均具有促进作用，新霉
素产量最高可达 146.2。因此选择硫酸镁、碳酸钙为
培养基中的无机盐。
2.4 培养基正交试验
根据上述试验结果，选择葡萄糖、可溶性淀粉、
黄豆粉、硫酸镁和碳酸钙作为发酵培养基组成。正
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期94
交设计考察培养基各成分对产新霉素的影响，按表 4
所列因素和水平选用 L16（4
5）表安排试验。结果（表
5）显示，以对照发酵产新霉素的相对效价为 100，
通过正交设计助手软件分析，对产新霉素的影响主
次顺序为葡萄糖 > 可溶性淀粉 > 黄豆粉 > 碳酸钙 >
硫酸镁，确定最佳组合为葡萄糖 6.0%，可溶性淀粉
3.5%，黄豆粉 2.0%，硫酸镁 0.1%，碳酸钙 0.3%。
表 3 无机盐对 FIM-S38 生长及合成新霉素的影响
无机盐（%） RT（%） PMV（%）
对照 100.0 20.5
FeSO4（0.01） 109.8 20.0
ZnSO4（0.006） 110.9 23.5
MgSO4（0.02） 136.6 22.6
NaCl（0.05） 122.3 23.2
CaCO3（0.5） 146.2 22.1
表 4 正交设计因素水平表
水平 葡萄糖（A）（%） 可溶性淀粉（B）（%） 黄豆粉（C）（%） 硫酸镁（D）（%） 碳酸钙（E）（%）
1 2.0 2.0 2.0 0.05 0.30
2 4.0 2.5 2.5 0.1 0.35
3 6.0 3.0 3.0 0.2 0.40
4 8.0 3.5 3.5 0.3 0.45
表 5 正交试验结果
序号 A B C D E RT（%）
1 1 1 1 1 1 46.7
2 1 2 2 2 2 36.2
3 1 3 3 3 3 43.0
4 1 4 4 4 4 60.4
5 2 1 2 3 4 45.3
6 2 2 1 4 3 61.9
7 2 3 4 2 2 108.9
8 2 4 3 1 1 128.3
9 3 1 3 4 2 104.9
10 3 2 4 3 1 130.7
11 3 3 1 2 4 186.7
12 3 4 2 1 3 112.3
13 4 1 4 2 3 21.2
14 4 2 3 1 4 16.4
15 4 3 2 4 1 68.2
16 4 4 1 3 2 110.2
k1 46.6 54.5 101.4 71.1 93.5 影响主次顺序 ：
A>B> C > E > D
最佳组合 ：
A3B4C1D2E1
k2 86.1 61.3 65.5 93.1 90.1
k3 133.7 101.7 73.2 82.3 59.6
k4 54.0 102.8 80.3 73.9 77.2
R 87.1 48.3 35.9 22.0 33.9
2.5 培养基初始pH值的影响
将优化发酵培养基调整至不同 pH 值进行发酵。
以初始 pH7.0 的培养基发酵产新霉素的效价为 100，
结果（图 1）表明，FIM-S38 对酸碱性环境均有较强
的适应能力，在初始 pH3.0-11.0 范围内菌体生长良
好，酸性条件更利于菌体的繁殖，而在初始 pH6.0-
8.0 范围内的发酵培养基最宜产新霉素，初始 pH 为
7.0 时新霉素产量最高。因此选择培养基的初始 pH
为 7.0。
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10ࡍ࿻pH٬ 1201020
30
40
50
60
RT
PMV
PM
V
%
RT
%
图 1 初始 pH 值对 FIM-S38 生长及合成新霉素的影响
2.6 摇床转速的影响
在优化培养基中考察 FIM-S38 在不同转速下的
发酵情况，以转速 250 r/min 发酵产新霉素的效价为
100。结果（表 6）表明，摇床转速在 125-280 r/min
之间时，随着转速的增加，其新霉素产量亦提高，
因此考虑摇床实际情况 250 r/min 的转速较合适。
表 6 摇床转速对 FIM-S38 合成新霉素的影响
转速（r/min） RT（%）
125 68.5
180 91.1
220 95.8
250 100
280 105.3
2014年第12期 95周璟明等：费氏链霉菌（Streptomyces fradiae）FIM-S38 胞外产新霉素的发酵条件优化
2.7 培养基装液量的影响
对 FIM-S38 进行优化培养基的不同装液量发酵
试验，以 500 mL 三角瓶装液量 50 mL 发酵产新霉素
的效价为 100。结果（表 7）表明，发酵水平随装量
的增多而降低，在一定的装量范围内通气量与发酵
水平呈正相关，说明该菌株对氧的需求较高，而发
酵液装量太少，蒸发量较大，发酵容积小，因此选
择 50 mL/500 mL 三角瓶为适宜装液量。
表 7 装液量对 FIM-S38 合成新霉素的影响
装液量（mL） RT（%）
40 119.6
50 100
60 88.4
80 59.6
100 56.9
2.8 发酵温度的影响
在发酵培养过程中，菌体生长、代谢、产素的
酶活性受许多因素影响，其中培养温度是一个重要
影响因素。微生物有其最适和最耐受的温度范围，
同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理、生
化过程中，最适温度往往也不一样。由表 8 可知，
在上述确定的发酵条件下，以 35℃发酵产新霉素的
效价为 100，在 28-35℃时产量与温度呈正相关，温
度为 35℃ 时发酵产量最高，温度提高到 37℃时产
量反而减少。因此在摇瓶培养过程中，35℃为菌体
代谢最宜温度。
表 8 发酵温度对 FIM-S38 合成新霉素的影响
温度（℃） RT（%）
28 54.8
30 82.5
33 90.3
35 100
37 92.2
2.9 菌体生长及生物合成新霉素的时间进程
FIM-S38 在上述确定的发酵条件下的发酵时间
曲线（图 2）表明，在培养初期菌体大量生长而合
成新霉素量少，在发酵 48-72 h 之后菌丝的生长发
育即停止，但新霉素生物合成明显增加，以 120 h
发酵产新霉素的效价为 100，在 144 h 其效价达到最
高峰，其发酵效价为 136.4。
2.10 优化发酵条件的验证
在原发酵条件和优化发酵条件下进行 5 批次的
发酵验证。以对照原发酵条件发酵产新霉素的 RT
为 100，结果（表 9）表明，优化组发酵液中的发酵
水平较对照组提高了 57%、菌体生长量降低了 8%，
因此进一步验证了 Streptomyces fradiae FIM-S38 的优
化发酵参数。
表 9 验证试验的结果（n=5）
组别 RT（%） PMV（%）
优化组 157.1±2.8* 22.7±0.7*
对照组 100 31.4±1.4
* ：差异显著（P<0.05）
3 讨论
改良微生物发酵参数，创造适合菌体生长和生
物代谢的最佳条件，才能最大限度地发挥菌株的优
良性能提高产物产量，因此探索菌株高产特性充分
表达的最佳培养条件是发酵生产的基础与关键。由
于 Streptomyces fradiae FIM-S38 系胞外产新霉素，在
相同发酵水平下，发酵结束时菌体浓度越低越有利
于发酵液过滤和提取等后期处理，即菌体浓度低而
发酵效价高的发酵条件是理想的选择。因此采用正
交设计法以发酵效价和菌体生长量为指标对新霉素
的发酵培养基配方中各组分的含量进行优化，筛选
获得了适宜发酵培养基组成和较佳发酵参数，其菌
体生长良好而菌浓度明显减少，同时新霉素产量显
著提高。通过在综合最优条件下的 5 批摇瓶发酵验
证试验，证实优化发酵条件下 FIM-S38 的发酵水平
明显优于对照，其发酵液中新霉素产量显著提高。
RT
PMV
60
50
40
30
PM
V
%
20
10
0
240216192168144120ᰦ䰤h967248240020406080
100
120
140
RT
% 160
图 2 菌体生长及合成新霉素时间曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期96
新霉素原发酵培养基组成成分多，培养液中
存在大量不溶性颗粒，配制过程复杂，致使生产易
染菌，成本高。在优化发酵培养基配方中，以单一
氮源代替原生产工艺培养基中的多种氮源，配制简
便，同时添加少量的镁、钙盐提高了菌体的代谢能
力和目标产物的合成能力，通过条件优化发酵周期
由原工艺的 168 h 缩短到 144 h，提高了产素率，若
应用到几十吨乃至上百吨生产发酵罐进行工业生产，
将会大大降低生产成本，增加产量，具有较强的市
场竞争力。通过对弗氏链霉菌 Streptomyces fradiae
FIM-S38 发酵过程控制研究，发现该菌株对氧的需
求量较大，在生产工艺方面还有进一步改进提高的
潜力，如生长因子、表面活性剂及其添加时间对生
物合成目标产物的影响等，均有待深入的研究。
4 结论
通过对 Streptomyces fradiae FIM-S38 胞外产生的
次级代谢产物新霉素进行发酵条件研究，采用单因
素筛选结合正交试验优化发酵培养基组成，同时单
因素试验考察摇瓶发酵参数，如初始 pH 值、装液
量、转速等主要影响因子的影响，确定了适宜发酵
培养基组成和较佳发酵参数 ：葡萄糖 6.0%，可溶性
淀粉 3.5%，黄豆粉 2.0%，硫酸镁 0.1%，碳酸钙 0.3%，
初始 pH7.0，装液量 50 mL/500 mL，摇床转速 250
r/min，发酵温度 35℃，发酵时间 6 d，优化后的发
酵水平较原生产工艺提高了 50% 以上。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）