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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
甘丙肽是一种广泛分布外周和中枢神经系统的
神经肽，研究发现，它具有调节胰腺分泌，促进食欲，
抑制脂肪组织中抵抗素基因的表达，影响胃肠蠕动，
提高垂体生长激素，催乳素，促黄体生成激素释放
等功能，尤其在学习，记忆，痛觉和脊神经反射等
神经功能方面发挥重要作用。国外不仅利用外源甘
丙肽，甘丙肽拮抗或者激动剂深入研究甘丙肽在神
收稿日期 ：2012-08-02
作者简介 ：荣曼，女，硕士，研究方向 ：人类疾病动物模型 ；E-mail ：834182410@qq.com
通讯作者 ：刘田福，男，教授，研究方向 ：人类疾病动物模型 ；E-mail ：ykdltf@yahoo.com.cn
PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达
荣曼  张锐虎  刘田福
（山西医科大学实验动物中心，太原 030001）
摘 要 ： 旨在构建真核表达载体 pcDNA-PDGF-GAL，观察重组质粒转染 N-2a 细胞后甘丙肽基因（galanin，GAL）的表达水
平。采用 PCR 方法，以重组质粒 pUC18-PDGF-GAL 为模板，扩增 PDGF-GAL 基因序列，最终定向克隆入载体 pcDNA3.1 并替换该
载体的 CMV 启动子与增强子序列，从而构建具有神经细胞特异性的表达载体 pcDNA-PDGF-GAL。然后利用脂质体法将重组质粒
瞬时转染小鼠 N-2a 细胞，分别在转染后 24、48 和 72 h 收集细胞及细胞培养物，采用 RT-PCR 和 ELISA 方法，鉴定 GAL 基因在神
经细胞中的过表达。结果显示，经 PCR 和 DNA 序列测定证实，目的基因已插入表达载体，RT-PCR 和 ELISA 证明，脂质体法瞬时
转染 N-2a 细胞实现 GAL 基因的过表达。成功构建 pcDNA3.1-PDGF-GAL，实现 GAL 基因在 N-2a 细胞过表达，从而为制作过表达
GAL 的稳转细胞及进一步研究 GAL 在神经系统的生物学功能奠定基础。
关键词 ： GAL 表达载体 N-2a 细胞 转染
Construction of GAL’s Eukaryotic Expression Vector and Targeting
Expression of GAL in N-2a Cells
Rong Man Zhang Ruihu Liu Tianfu
（Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001）
Abstract:  The study was designed to construct eukaryotic expression vector pcDNA-PDGF-GAL, and observe the specific expression
of GAL in N-2a after transferction. Firstly, the 2.9 kb PDGF-GAL fragment was amplified by PCR, then directedly cloned into pcDNA 3.1
vector, replacing the vector’s CMV promoter and enhancer and finally forming the recombinant vector pcDNA-PDGF-GAL which is neuron-
specific expressed. Secondly, pcDNA-PDGF-GAL is transient-transfected into N-2a and the expression of GAL protein is detected by RT-PCR
and ELISA. Results showed the sequencings result of pcDNA-PDGF-GAL was blasted on NCBI with standard sequence, in which PDGF-GAL
fragment has a high nucleotide sequence identity（99%）, and these results suggested that the construction of recombinant plasmid gets success.
By RT-PCR and ELISA, it is confirmed that GAL protein is specifically over-expressed in N-2a. The neuron-specific eukaryotic expression vector
was successfully constructed, and GAL protein is successfully over-expressed in N-2a, which established a basis for the preparation of stable-
transfected cells over-expressing GAL and further exploring the biological functions of GAL on nervous system.
Key words:  GAL Expression vector N-2a cell Transfection
经组织和外周的作用，并且已成功建立了甘丙肽过
表达的转基因小鼠［1］；国内也在甘丙肽对阿尔茨
海默症，抑郁症，癫痫等的影响方面取得了很大进
展，但仍缺乏内源性过表达的甘丙肽用于进一步的
疾病模型研究。本课题将延用本实验室已有的科研
成果——重组克隆质粒 pUC18-PDGF-GAL［2］，以其
为模板，利用 PCR 技术扩增目的片段 PDGF-GAL，
2013年第2期 125荣曼等 ：PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达
然后将其定向克隆至真核表达载体 pcDNA 3.1 获得
重组表达质粒 pcDNA-PDGF-GAL，采用脂质体法将
重组质粒瞬时转染神经母细胞瘤细胞实现甘丙肽基
因的过表达，为下一步经 G418 筛选获得稳定细胞
克隆从而深入研究过表达甘丙肽的相关作用机制做
准备。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 N-2a 购自中国科学院上海生命科学研
究院。
1.1.2 菌株和质粒 pcDNA3.1，由本实验室所保存，
大肠杆菌 DH5α，pMD19-T simple vector 均购自宝生
物工程（大连）有限公司。
1.1.3 试剂和培养基 DNA A-Tailing Kit，RT-PCR
Kit，RNAiso Reagent 均购自宝生物工程（大连）有
限公司 ；Bgl II 和 Xho I 限制性内切酶购自 NEB 公
司 ；Plasmid Mini Kit 购自 Omega 公司 ；澳洲血源特
级胎牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公
司 ；LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen 公司 ；小鼠
甘丙肽 ELISA 试剂盒 48T 购自上海，属进口分装。
1.1.4 主要引物 常规 PCR 引物、RT-PCR 均参照
GenBank 中 GAL 基 因 和 cDNA 的 标 准 序 列， 使 用
Primer Premier5. 0，Oligo6.0 软件进行设计分析，PCR
正 向 引 物 F ：5-GAAGATCTGGATCCACAGTCTCCT-
GAGTA-3，反向引物 R ：5-CCGCTCGAGCAGTCCC-
AGATACTTGCTAG-3 ；RT-PCR 正向引物 F ：5-GC-
AGTAAGCGACCATCCAGC-3，反向引物 R ：5-AG-
GACACACGTGCACAGTGG-3 ；内参正向引物 F ：5-
GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3， 反 向 引 物 R ：5-
CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3，引物由 Invitrogen 公
司合成。
1.2 方法
1.2.1 目 的 片 段 PDGF-GAL 的 扩 增 以 pUC18-
PDGF-GAL 质粒为模板，PCR 获得 5 端具有 Bgl II
酶切位点，3 端具有 Xho I 酶切位点的目的片段。
1.2.2 重 组 质 粒 pMDT-PDGF-GAL 的 构 建 胶 回
收目的片段，经加 A 反应，与 T 载体经 T4 连接酶
16℃过夜连接，并以线性 T 载体自连为阴性对照，
连接摩尔比为 3∶1，经转化感受态大肠杆菌 DH5α，
氨苄抗性筛选，扩大培养等过程，对提取的质粒进
行 PCR 法，酶切鉴定后经测序终获得 pMDT-PDGF-
GAL。
1.2.3 GAL 特异性表达质粒的构建 取最终测序正
确的质粒 pMDT-PDGF-GAL 和 pcDNA3.1 分别用 Bgl
II 和 Xho I 酶双酶切后经 T4 连接酶 16℃过夜连接，
并以线性化 pcDNA3.1 和 pMDT-PDGF-GAL 自连为阴
性对照，转化感受态大肠杆菌 DH5α，氨苄抗性筛选，
扩大培养等过程，对提取的质粒进行 PCR 和酶切鉴
定后再送交测序中心，将最终鉴定正确的重构质粒
命名为 pcDNA-PDGF-GAL。
1.2.4 细胞的复苏、传代及冻存 从液氮中取出冻
存细胞立即放入 40℃水浴，震荡使其快速溶解 1
min，然后移入含有 9 mL 完全培养基的离心管中，
室温下 1 200 r/min 离心吹吸混匀后移入培养瓶中继
续培养。N-2a 细胞用全血清 DMEM 培养液（10% 胎
牛血清，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素）在
75 cm2 培养瓶中附壁生长培养，细胞达到 80% 融
合时以 1∶3 进行传代。选第 3-6 代细胞以 2×107
进行冻存，冻存前一日更换新鲜培养基，冻存液含
20% 胎牛血清，5% DMSO，冻存过程 ：4℃ 20 min，
-20℃ 30 min，-80℃过夜后投入液氮长期保存。
1.2.5 细 胞 增 殖 率 的 测 定（MTT 法 ） 细 胞 以
1×103/ 孔接种于 96 孔板后分别在培养 24、48、72、
96、120 和 144 h 后 进 行 MTT 检 测。 每 孔 加 入 5
mg/mL MTT 20 μL，在 CO2 细胞培养箱内继续孵育 4
h，终止培养，小心吸去孔内培养液（注意勿吸出孔
板内结晶），然后每孔加入 150 μL DMSO，室温下将
培养板置于微孔板振荡器振荡 10 min，置于酶联检
测仪于 570 nm 处检测各孔吸光度值，以空白孔调零，
绘制细胞生长曲线［3］。
1.2.6 细胞转染 细胞瘤细胞生长汇合率为 70% 时
收获细胞，转入两个 6 孔板，培养至 80% 以上汇合
时分成两组，阳性转染组（脂转 pcDNA3.1-PDGF-
GAL 质粒转入 N-2a 细胞）：6 孔板中随机抽取 4 孔，
分别标记为第①、②、③和④孔，每孔加完全培养
基 2 mL、含脂质体 2000 10 μL 的 DMEM 培养基 250
μL、 含 GAL 重 组 质 粒 4.0 μg 的 DMEM 培 养 基 250
μL ；阴性对照组（脂转 pcDNA3.1 质粒转入 N-2a 细
胞）：6 孔板中任选孔分别标记为第⑤，⑥，⑦和⑧
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期126
孔，每孔加完全培养基 2 mL、含脂质体 2000 10 μL
的 DMEM 培养基 250 μL、含 PcDNA3.1 质粒 4.0 μg
的 DMEM 培养基 250 μL ；空白对照组 ：6 孔板中其
余孔分别标记为 *，每孔加 DMEM 培养基 2.25 mL、
含 Lipofectamine 2000 脂质体 10 μL 的 DMEM 培养基
250 μL。6 孔板置于 37℃、5% CO2、90% 湿度条件
下脂转 4 h 后更换为完全培养基。
1.2.7 细胞转录水平的鉴定 分别在转染后 24、48
和 72 h Trizon 法提取不同组细胞总 RNA，用紫外可
见分光光度计检测定 RNA 的浓度为 0.48 μg/μL，纯
度为 2.0，然后以内参 GAPDH 为标准进行 RT-PCR，
25 μL 的 PCR 反 应 体 系 包 括 cDNA 2 μL，10×PCR
缓冲液 5 μL，10 mmol/L 各类 dNTP 3 μL，2.5 U Taq
DNA 合成酶，GAL 及 GAPDH 正、反向引物各 2 μL，
RNase Free dH2O 加至反应物总量 50 μL。轻柔吹吸
混匀并短暂离心收集附壁液体后，将样本置入 PCR
热循环仪，开始 PCR 反应，反应条件为 ：94℃预变
性 5 min ；94℃变性 30 s，64℃退火 1 min，72℃延
伸 30 s，35 个循环。最后于 72℃终延伸，10 min。
所有的标本重复测定 3 次。在扩增终点取 5 μL 的产
物，进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳并拍照。凝胶图像
分析系统进行条带光密度扫描，以 GAPDH 校正做
GAL 相对表达量分析。
1.2.8 酶联免疫吸附测定（Enzyme link immunosor-
bent assay，ELISA）检测 GAL 水平 参照 ELISA 试
剂盒的产品说明书进行操作，分别测定不同时间段
培养上清液 GAL 表达水平，ELISA 测定时同时设空白
孔、标准孔、待测样品孔，严格参照产品说明书操
作后用酶标仪在 450 nm 波长依序测量各孔的光密度
（OD 值），根据标准曲线计算出上清液 GAL 水平，
结果以 ng/mL 或 ng/mg 蛋白表示。
1.2.9 统 计 学 处 理 试 验 中 所 有 数 据 均 采 用
SPSS13.0 软件进行统计处理，P<0.05 认为差异有统
计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒pMDT-PDGF-GAL的鉴定
常规 PCR，电泳鉴定 PCR 产物与目的片段 PD-
GF-GAL 理论大小 2 896 bp 相符（图 1）。与 T 载体
连接后重组质粒的酶切鉴定，超螺旋质粒大小 4 000
bp 左右，单酶切线性化质粒在 5 500 bp 左右，与理
论值 5 588 bp 相符，双酶切结果由于目的片段和 T
载体骨架大小相似，差 100 bp 左右，双酶切鉴定结
果不易分辨（图 2）。
1000
bp
3000
5000
1 M 2 3
1000
3000
5000
bp
1 2 3 M
图 1 以重组 T 载体为模板的 PCR 电泳图
图 2 重组 T 载体经单酶切和双酶切后电泳图
2.2 重组表达质粒pcDNA-PDGF-GAL的鉴定
常规 PCR，电泳鉴定 PCR 产物与目的片段 PD-
GF-GAL 理论大小 2 896 bp 相符 ；与质粒 pcDNA3.1
骨架连接后重组质粒的酶切鉴定，其中环状质粒大
小约为 6 000 bp，重组质粒单酶切线性化后理论大
小为 7 500 bp，pcDNA3.1 经双酶切后的骨架大小为
4 600 bp，目的片段 PDGF-GAL 大小在 3 000 bp 左
右（图 3）。测序结果与理论上的重组片段进行比对，
相似性达到 99%。
2.3 N-2a细胞生长曲线的绘制
由图 4 可知接种后 48 h 后即图示第 2 天细胞数
明显比接种后 24 h 时显著减少（P<0.05），又经过一
定潜伏适应期后进入对数生长期，接种后第 6 天后
细胞渐趋于生长稳定。另外本试验也曾尝试 6 孔板
和 12 孔板等以不同密度接种，无论台盼蓝染色计数
M ：DNA 分子量标准 ；1-3 ：PCR 产物
M:DNA 分子量标准 ；1 ：重组质粒 ；2 ：单酶切线性化重组质粒 ；
3 ：重组质粒双酶切片段
2013年第2期 127荣曼等 ：PDGF-GAL 真核表达载体的构建及细胞表达
8000
3000
5000
bpbp
M 1 2 3 4
图 3 重组表达载体经单酶切和双酶切后电泳图
或者 MTT 法测定均显示接种后 48-60 h 细胞活力较
差，说明 N-2a 细胞对培养环境的改变较敏感，鉴于
N-2a 细胞的生长特点，转染试验适合于在细胞以一
定密度接种后 3-5 d 生长活力相对旺盛的时候进行
以获得最佳转染效果。
2.6 瞬时转染后过表达甘丙肽对细胞形态的影响
脂质体法转染细胞后 72 h 后倒置显微镜下观察
到有一部分明显分化趋势的细胞，个别已近似神经
元形态（图 8）。
3 讨论
甘丙肽是近几年来倍受研究者关注的一个基因，
其功能是通过 GAL 受体 GALR1、GALR2、GALR3
35
45
25
15
10
20
30
40
5
0 1 2 3 4 5 6 7
O
D
57
0
nm
值
时间d
图 4 N-2a 细胞生长曲线
2.4 脂质体法转染后不同时间段GAL转录水平的
鉴定
转染后 48 h 细胞中 GAL 瞬时表达量最多，并
且凝胶图像分析系统进行条带光密度扫描（图 5，
图 6），以 GAPDH 校正做 GAL 相对表达量统计分析
后与转染后 24 h 和 72 h GAL 的表达量以及与对照组
GAL 表达量具有显著差异（P<0.05），以空质粒转染
后 48 h 细胞中 GAL 表达量与对照组表达量没有统计
学差异（P>0.1）。
2.5 脂质体法转染后不同时间段GAL表达水平的
鉴定
瞬转后随着时间的增长细胞上清中 GAL 表达量
600
bp bp
250
750
M 1 2 3 4 M
M ：DNA 分子质量 ；1 ：转染组内参 PCR 扩增产物 ；2 ：转染组 GAL PCR 扩
增产物 ；3 ：对照组内参 PCR 扩增产物 ；4 ：对照组 GAL PCR 扩增产物
图 5 48 h 后 GAL RT-PCR 结果
1 2 3 4 5
GAPDH
GAL
图 6 不同时间 GALRT-PCR 结果
1：转染后 24 h PCR 结果；2：转染后 48 h PCR 结果；3：转染后 72 h PCR 结果；
4 ：空质粒转染后 48 h PCR 结果 ；5. 未转染组 PCR 结果
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
O
D
57
0n
m
٬
1 2 3ཙᮠd
ሩ➗ⷜ䖜㓴
图 7 ELISA 法测定瞬转后不同时间上清中 GAL 蛋白含量
M:DNA 分子量标准 ；1 ：重组表达质粒 ；2、3 ：单酶切线性化
表达质粒 ；4 ：重组表达质粒双酶切片段
明显增加，与对照未转染组上清 GAL 表达量具有显
著性差异（P<0.05），见图 7。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期128
中的一个或多个介导的，由此研究者从甘丙肽与其
不同受体及其它物质的相互作用着手，深入研究其
与各种疾病的联系。在阿尔茨海默症病人脑组织检
测到过量的甘丙肽，低于正常水平的 α 促黑色素细
胞激素，说明甘丙肽和 α 促黑色素细胞激素参与调
节记忆过程［4］，不仅仅在神经系统，研究者在皮肤
肉芽组织形成过程中检测甘丙肽和甘丙肽受体的表
达，并证实一些甘丙肽是由成纤维细胞样细胞所释
放［5］。总而言之，甘丙肽及其相关蛋白在机体生理
或病理状态下的作用是广泛而复杂的。
本试验成功构建了由神经特异性启动子 PDGF-β
驱动 GAL 靶向神经组织特异性表达的真核表达载体
pcDNA-PDGF-GAL，测序正确后脂质体法瞬时转染
小鼠神经母细胞瘤细胞 N-2a，分别于转染后不同时
间从转录水平和表达水平检测 GAL 的过表达情况。
转染试验中通过绘制细胞生长曲线获得细胞生长活
力最佳时期，严格按照转染试剂说明书步骤操作及
依照相关文献通过调节配制核酸脂质体复合物所用
的培养基 pH 等［6］措施，以携带增强型绿色荧光蛋
白的真核表达载体 pEGFP-N1 进行转染预试验从而
获得转染试验最优化参数，最终实现 GAL 在 N-2a
的过表达。
另外，细胞转染后 72 h 倒置显微镜下观察到有
一部分明显分化趋势的细胞，个别已近似神经元形
态，文献中曾报道外源性甘丙肽有促进已分化的神
经干细胞神经突生长的作用［7］。但是，至于本试验
中所观察到的现象是否说明内源性甘丙肽过表达后
会促进 N-2a 的分化，以及可能的促神经突生长作用
有待进一步通过外源甘丙肽干预 N-2a 细胞等试验来
证实。
4 结论
本试验成功构建了由 PDGF-B 启动子驱动 GAL
靶向神经细胞特异性表达的真核表达载体 pcDNA-
PDGF-GAL，并采用脂质体法瞬时转染 N-2a 最终实
现了甘丙肽的过表达，为进一步稳定转染细胞系的
获得及甘丙肽生理病理等功能的研究奠定了一定的
试验基础。

参 考 文 献
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A ：空 质 粒 pcDNA3.1 瞬 时 转 染 N-2a 细 胞 后 72 h ；B ：重 组 质 粒 pcDNA-
PDGF β-GAL 瞬时转染 N-2a 细胞后 72 h
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（责任编辑 马鑫）