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Cloning of CAV-3 in Yak and Analysis Its Expression in Yak and Cattle

牦牛CAV-3基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):194-199
小窝(caveolae),又称胞膜窖,是细胞膜上直
径为 50-100 nm 左右的囊泡凹陷结构,广泛存在
于多种类型细胞膜上。在上皮细胞、脂肪细胞和
肌肉细胞的质膜中含量较为丰富[1,2]。小窝蛋白
收稿日期 :2014-10-28
基金项目 :现代农业(肉牛牦牛)产业技术体系专项(CARS-38),甘肃甘南牧区“生产生态生活”保障技术集成与示范(2012AD13B05)
作者简介 :赵娟花,女,硕士研究生,研究方向 :动物遗传育种 ;E-mail :zjh326303202@163.com
通讯作者 :阎萍,女,研究员,博士生导师,研究方向 ;动物遗传育种 ;E-mail :pingyanlz@163.com
牦牛 CAV-3 基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的
表达分析
赵娟花  裴杰  梁春年  郭宪  吴晓云  张良斌  阎萍
(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,兰州 730050)
摘 要: 旨在对牦牛 CAV-3 基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在牦牛组织中的表达规律进行初步研究。根据 GenBank
数据库中已知的黄牛 CAV-3 基因的 mRNA 序列并设计特异性引物,应用 RT-PCR 技术克隆牦牛 CAV-3 基因的编码区。运用生物
信息学方法,分析并预测牦牛 Caveolin-3 蛋白的理化性质、疏水性、蛋白结构域以及蛋白质二级结构。通过半定量 PCR 技术检测
CAV-3 基因 mRNA 在牦牛和黄牛各组织中的表达 ;利用实时荧光定量 PCR 技术检测牦牛和黄牛肌肉组织中 CAV-3 基因 mRNA 表达
水平。牦牛 CAV-3 的编码区全长 631 bp,共编码 151 个氨基酸。CAV-3 在牦牛肺、脾脏、肾脏、肝脏、卵巢组织中均不表达,仅
在心脏和肌肉组织中表达,且在心脏组织的表达水平高于肌肉组织,CAV-3 基因在黄牛各组织中的表达结果与牦牛一致。CAV-3 基
因在牦牛肌肉中的表达低于黄牛肌肉组织,但差异不显著(P>0.05)。
关键词 : 牦牛 ;Caveolin-3 ;克隆 ;表达分析
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.030
Cloning of CAV-3 in Yak and Analysis Its Expression in
Yak and Cattle
Zhao Juanhua Pei Jie Liang Chunnian Guo Xian Wu Xiaoyun Zhang Liangbin Yan Ping
(Key Laboratory of Yak Breeding Engineering,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural
Sciences,Lanzhou 730050)
Abstract: This study aims to clone, analyze bioinformatics and determine the expression pattern of CAV-3 gene in yak. A pair of special
primers were designed according to released mRNA sequence of bovine CAV-3 in GenBank. A coding region sequence of yak CAV-3 was
amplified by RT-PCR; the general physical and chemical properties, hydrophobicity, protein domains and protein secondary structures were
systemically analyzed and predicted by bioinformatics techniques. The expression levels of CAV-3 mRNA in some organs of yak and cattle
were detected by semi-quantitative PCR. Real-time PCR was employed to examine the expression levels of CAV-3 mRNA in yak and cattle
muscles. The coding region sequence of CAV-3 gene in yak contains a complete ORF(631 bp)which encoded 151 amino acids. CAV-3 mRNA
expression in the heart and muscle was detected, but not in any other examined tissues, and its expression level in the heart was higher than in
the muscle. The result in yak was consistent with that in cattle. Expression of CAV-3 gene in the yak muscle was less than in the cattle muscle,
but not significantly(P>0.05). The cloning and analysis of CAV-3 provided scientific basis for further study the function of CAV-3 gene in
muscle development and muscle physiological process in the future.
Key words: yak; Caveolin-3; cloning; expression analysis
2015,31(5) 195赵娟花等:牦牛 CAV-3 基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析
(Caveolin),又称窖蛋白,是构成小窝基本组分的一
类标志蛋白[3,4],其分子量在 21-24 kD 之间。目
前,已知有 4 种窖蛋白 Caveolin-1(α,β 两种亚型)、
Caveolin-2 和 Caveolin-3 分 别 由 哺 乳 动 物 的 CAV-1,
CAV-2,CAV-3 基因编码组成[5]。Caveolin-1 可单独
或与 Caveolin-2 协作形成稳定的寡聚体复合物,并
广泛存在于内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和
脂肪细胞等细胞中[6,7]。据报道,Caveolin-3 是整合
在 caveola 上的肌细胞特异性蛋白,且可能与肌肉的
发生以及功能的维持有关[8]。该蛋白广泛存在于多
种肌细胞中,如心肌细胞、骨骼肌细胞等[9]。因此,
探究 CAV-3 基因的功能及在肌肉发生过程中的作用,
对更好地开展有关牦牛肌肉性状的育种工作具有一
定的参考价值。有报道称,在人类骨骼肌纤维中慢
肌的 CAV-3 表达量远远低于快肌中 CAV-3 的表达量,
这表明 CAV-3 在调控肌纤维的发育类型和生长发育
上有重要作用[10,11]。目前,对 CAV-3 基因的研究
仅限于人和小鼠上,尚无该基因在牦牛和黄牛上的
研究报道。本研究以甘南牦牛为研究对象,对牦牛
CAV-3 基因编码区序列进行克隆,对通过 CAV-3 基
因编码区推断获得的 CAV-3 蛋白序列进行蛋白特征
分析,比较该基因的 mRNA 在牦牛和黄牛肌肉组织
中的表达差异,旨在为研究该基因在肌肉发生和肌
肉生理过程中的可能作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 试验用 3 岁母牦牛选自甘南藏族
自治州,3 岁母黄牛选自临夏回族自治州。待牛屠
宰后,采集牛的背最长肌、肾脏、肝脏、心脏、卵巢、
脾脏和肺组织,保存于液氮中迅速带回实验室。
1.1.2 主要试剂 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、
荧光定量试剂盒、pMD19-T 克隆载体和 DNA Marker
购自大连宝生物(TaKaRa)公司 ;琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒、Taq 酶 Mix、质粒提取试剂盒、E.coli
DH5α、X-gal、IPTG 购自北京天根公司 ;琼脂粉、
胰蛋白胨和酵母浸出粉购自 OXOID 公司。
1.1.3 引物设计与合成 根据 GenBank中黄牛 CAV-3
基因中的 mRNA 序列(登录号 :NM_001046558)和
GAPDH mRNA 序列(登录号 :NM_001034034),利
用 Premier 5.0 分别设计牦牛 CAV-3 基因全编码区的
扩增引物、定量 PCR 引物及内参引物,并由大连宝
生物公司合成。引物序列、退火温度及 PCR 产物长
度,见表 1。
表 1 引物序列及其扩增特性
基因 引物序列(5-3) 退火温度 /℃ 产物长度 /bp
CAV-3 F :GTCTGTGCCCCAG-
GTCTTT
57.6 631
R :TACTCTGCGTCCT-
CCCATCT
CAV-3
(QRT-PCR)
F :GAGGACATAGTG-
AAGGTGGATTTTG
57 108
R :CTTGGAGACAGT-
GAAGGTGGTG
GAPDH F :CCACGAGAAGTA-
TAACAACACC
60 120
R :GTCATAAGTCCC-
TCCACGAT
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取 以采集的牦牛和黄牛的背最长
肌及其它组织为材料,根据 RNA 提取试剂盒的使用
说明提取 RNA,使用分光光度计和 1.2% 琼脂糖凝
胶电泳分别检测所获 RNA 的纯度和完整性,并置
于 -80℃保存。
1.2.2 RT-PCR 按照反转录试剂盒的说明进行反
转录反应,以所获 RNA 为模板合成所需 cDNA。在
PCR 管依次加入 5×g DNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA
Eraser 1 μL,RNase Free H2O 6 μL,总 RNA 1 μL,混
匀后在 42℃ 2 min,85℃ 5 s 条件下反应。待上述
反应结束后,在反应液中依次加入 5×PrimerSript
Buffer 4 μL,RNase Free H2O 4 μL,RT Primer Mix 1
μL,PrimerSript RT Enzyme Mix 1 μL, 混 合 后 42 ℃
25 min,85℃ 5 s 条件下继续反应,并最终以此反应
液为模板进行定量试验。
1.2.3 RT-PCR 扩增牦牛 CAV-3 基因的 CDS 区 PCR
反 应 体 系 :2×Taq PCR Master Mix 25 μL,RNase
Free H2O 19 μL,10 mmol/L 引物 F、R 各 2 μL,cDNA
2 μL。PCR 反 应 条 件 :Lid 105℃ ;95℃ 预 变 性
4 min ;95℃变性 30 s,57.6℃退火 30 s,72℃延伸
40 s,35 个循环 ;72℃延伸 10 min,4℃终止反应。
PCR 产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测。用 DNA 凝
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5196
胶回收试剂盒回收 PCR 产物。
1.2.4 牦牛 CAV-3 基因 CDS 区的克隆 将回收的
PCR 产 物 与 pMD19-T 克 隆 载 体 连 接, 在 16 ℃ 过
夜,构建重组质粒。将重组质粒转化至感受态 E.coli
DH5α 菌 中, 转 化 产 物 于 37 ℃、100 r/min 培 养 90
min,均匀涂在含有 Amp、X-gal、IPTG 的 LB 固体
培养基上,37℃培养 12 h。挑取白色阳性菌落,于
含有 Amp 的 LB 液体培养基过夜培养。PCR 扩增鉴
定后,将阳性菌落送至上海生工测序公司进行测序。
1.2.5 牦牛 CAV-3 基因与 Caveolin-3 蛋白的生物信
息学分析 使用 GenBank 数据库中的 BLAST 在线
检索工具对所获序列进行同源序列比对 ;用 ORF
Finder 在 线 程 序 预 测 开 放 阅 读 框 ;运 用 ExPASy
网 站 的 Protparam 和 ProtScale 在 线 工 具 预 测 分 析
牦 牛 Caveolin-3 的 基 本 理 化 性 质 和 疏 水 性 ;采 用
SignalP3.0、TMHMM Server v.2.0 在线分析程序预测
Caveolin-3 的信号肽位点和跨膜区域 ;采用 Interpro
在线分析软件预测的 Caveolin-3 的蛋白结构域,并
用 SABLE 在线预测网站预测蛋白质的二级结构。
1.2.6 半定量 PCR 检测牦牛和黄牛 CAV-3 基因的
表达 定量 PCR 反应体系 :2×Taq Mix 45 μL,10
mmol/L 的上、下游引物各 4.5 μL,ddH2O 27 μL,充
分混匀后分装到 8 个 PCR 管中各 9 μL,再在各管中
分别加入 1 μL 各组织 cDNA 模板,充分混匀。反应
条件 :95.5℃ 5 min ;95℃ 30 s,57.6℃ 30 s,72℃
20 s,30 个循环 ;72℃ 5 min。PCR 产物由 1.2% 琼
脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7 实时荧光定量 PCR 检测牦牛 CAV-3 基因表
达 量 荧 光 定 量 PCR 反 应 体 系 :2×SYBR® Premix
Ex TaqTM 5 μL,10 mmol/L 的上、下游引物各 0.2 μL,
ddH2O 4 μL,cDNA 模板 0.6 μL,充分混匀。反应条件:
95℃ 30 s ;95℃ 5 s,57℃ 30 s,40 个循环。试验以
GAPDH 为内参,每个样品做 3 个重复,运用 2-△△ct
的方法计算目的基因的相对表达量。
2 结果
2.1 牦牛CAV-3基因的PCR扩增
扩增产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析,可见一
条介于 500-700 bp 之间的 DNA 片段,与预期 DNA
片段(631 bp)大小一致(图 1)。
2.2 牦牛CAV-3基因的序列测定及分析
鉴定的阳性重组质粒送至上海生工测序公司测
序,通过同源序列比对证明构建的重组载体中含有
CAV-3 基因的全长编码区序列。对克隆的 CAV-3 基
因序列进行开放性阅读框分析,得知 CAV-3 基因含
有一个 456 bp 的开放性阅读框,编码 151 个氨基酸,
起始密为 ATG,终止密码子为 TGA(图 2)。
1000
bp
M 1
631
bp
700
500
400
300
200
100
M :DNA 分子质量标准 ;1 :PCR 扩增产物
图 1 CAV-3 基因 PCR 扩增产物的电泳
2.3 牦牛Caveolin-3蛋白的生物信息学分析
2.3.1 牦牛 Caveolin-3 蛋白的理化性质和疏水性 / 亲
水 性 预 测 和 分 析 通 过 Protparam 工 具 预 测 牦 牛
Caveolin-3 蛋白的基本理化性质,结果显示该蛋白
的分子量为 17.2903 kD,理论等电点(pI)为 5.75。
分子式是 C798H1230N192O214S11,总原子数 2 445 个。含
有带负电荷的残基(Asp+G1u)16 个,带正电荷的
残基(Arg + Lys)13 个。该蛋白由常见的 20 种基本
图 2 牦牛 CAV-3 基因和编码蛋白的序列
2015,31(5) 197赵娟花等:牦牛 CAV-3 基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析
氨基酸组成,其中含量最高的分别是 Ile、Leu 和 Val
(均为 9.9%),含量最低的分别是 Met 和 Gin(均为
2.0%)。运用 ProtScale 工具分析牦牛 Caveolin-3 蛋白
的亲水性和疏水性,根据氨基酸的分值与亲水性成
反比的规律可知 :牦牛 Caveolin-3 蛋白多肽链第 30
位 Lys 和第 31 位 Asn 具有最低的分值 -2.556 和最强
的亲水性 ;第 83 位 Pro 具有最高的分值 2.556 和最
强的疏水性 ;且整个多肽链表现为亲水性(图 3)。
2.3.3 牦牛 Caveolin-3 蛋白的二级结构预测 蛋白质
的生物学活性和理化性质取决于空间结构,因此预
测与分析蛋白质二级结构对了解其空间结构有重要
意义。用 SABLE 服务器预测其 Caveolin-3 蛋白的二
级结构,结果表明该蛋白由 67.55% α 螺旋、13.91%
延伸链和 17.88% 无规则卷曲组成(图 5)。可推断
无规则卷曲、α 螺旋和延伸链是牦牛 Caveolin-3 蛋白
主要的二级结构元件。
-3
20 40 60 80 100 120 140
Position
-2
-1
0
Sc
or
e
1
2
3
图 3 牦牛 Caveolin-3 蛋白疏水性分析
2.3.2 牦牛 Caveolin-3 蛋白信号肽、跨膜区分析和
结构域预测 使用 SignalP3.0 预测信号肽的分泌途
径和切割位点,发现没有信号肽。用 TMHMM2.0 分
析跨膜结构,发现此编码蛋白第 1-78 个氨基酸位于
膜外,第 79-101 个氨基酸螺旋跨膜,而第 102-151
个氨基酸位于膜外。结构域是蛋白质中能折叠成特
定三维结构的一段区域,是蛋白序列结构和进化单
元,具有一定生物学功能。用 Interpro 在线工具对牦
牛 Caveolin-3 蛋白进行结构域预测,结果(图 4)显
示该序列在第 79-101 位氨基酸之间具有一个跨膜结
构域。
0 100
图 4 牦牛 CAV-3 基因编码蛋白的结构域预测
1 50
9151
H :α 螺旋 ;C :无规则卷曲 ;E :延伸链
图 5 牦牛 Caveolin-3 蛋白的二级结构预测
2.4 牦牛、黄牛各组织器官中CAV-3基因mRNA表
达水平分析
通过半定量 PCR 检测分析,在牦牛肝脏、脾脏、
肺、肾脏、卵巢组织中均无 CAV-3 基因 mRNA 表达,
仅在心脏和肌肉组织中有表达,且心脏组织的表达
高 于 肌 肉 组 织( 图 6)。CAV-3 基 因 mRNA 在 黄 牛
各组织中的表达情况与其在牦牛组织表达结果一致
(图 7)。
GAPDHสഐ 1 2 3 4 5 6 7 8
CAV-3สഐ
1 :阴性对照 ;2 :心脏 ;3 :卵巢 ;4 :肺 ;5 :肝脏 ;6 :脾脏 ;7 :肾脏 ;8 肌肉
图 6 半定量 PCR 分析 CAV-3 基因 mRNA 在牦牛 7 个组
织器官中的表达
2.5 CAV-3基因在牦牛和黄牛肌肉中的mRNA表达
分析
通过实时荧光定量 PCR 对牦牛和黄牛肌肉组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5198
织中 CAV-3 基因表达水平进行检测。定量结果用
SPSS19.0 软件进行统计学分析,结果(图 8)发现
牦牛基因 mRNA 表达水平低于黄牛,但差异不显著
(P>0.05)。
通过分析蛋白质 N 端有无存在信号肽,初步判断该
蛋白是否为分泌蛋白。本研究表明,牦牛 Caveolin-3
蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白。
早期的研究发现,Caveolin-3 仅存在于各种肌
细胞中,如心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞
等。余方等[13]在对不同发育阶段的鸡的研究中发
现,CAV-3 mRNA 仅在横纹肌特异性表达而在其它
组织器官组织中均未见表达,同时在 1-10 周的不同
发育阶段中未表现出明显的变化,他们认为,CAV-3
基因在鸡的小窝膜结构形成、肌肉中 T-小管系统
的发生和肌肉分化等过程中可能起着非常重要的作
用。Song 等[14]对小鼠的研究发现 CAV-3 基因特异
表达于心肌、骨骼肌以及血管平滑肌细胞中。张营
等[15]对鸭 CAV-3 基因 mRNA 在不同组织中表达情
况进行的研究发现,CAV-3 mRNA 在心肌中表达量
最高,在胸肌、腿肌、肾脏中表达量相对较高,在
其他组织中痕量表达。本试验利用半定量 RCR 技术
对牦牛 CAV-3 基因 mRNA 在不同组织中表达情况进
行的研究发现,CAV-3 mRNA 在心脏中表达量最高,
肌肉组织中表达量次之,其他组织未见表达,这与
余方等的研究结果一致。但与张营等对鸭各组织中
CAV-3 基因的表达研究略有差异,这可能与牦牛的
特殊生理构造有关。
CAV-3 对哺乳动物和鸟类的肌肉生理功能的维
持都起着非常重要的作用。Galbiati 等[16]发现敲除
CAV-3 的小鼠会出现肌纤维中的胞膜窖消失现象,
同时发生骨骼肌细胞病理性改变。Galbiati 等还发
现正常骨骼肌细胞中的肌营养不良蛋白 - 糖蛋白的
复合体被定位在胞膜窖中,当 Caveolin-3 缺失后这
种定位被打乱,从而并发许多相关疾病。Caveolin-3
的缺陷使得肌营养不良蛋白 - 糖蛋白的复合体异
常定位,从而引起了人类的肢带型进行性肌肉萎缩
症[1],同时还发现 T-小管的异常排列[17,18],这些
缺失后的表型说明了 Caveolin-3 在肌肉组织发育过
程中的重要作用。杨渊等[19]通过荧光定量 PCR 技
术检测了脂肪型的荣昌猪和瘦肉型长白猪的脂肪和
肌肉组织中 CAV-3 基因在 7 月龄的表达变化,并分
析品种间、不同性别间和不同组织间基因表达的差
异。结果表明,长白母猪板油中 CAV-3 基因表达量
极显著高于荣昌母猪板油中 CAV-3 基因表达量(P<
GAPDHสഐ 1 2 3 4 5 6 7 8
CAV-3สഐ
1 :阴性对照 ;2 :心脏 ;3 :卵巢 ;4 :肺 ;5 :肝脏 ;6 :脾脏 ;
7 :肾脏 ;8 :肌肉
图 7 半定量 PCR 分析 CAV-3 基因 mRNA 在黄牛 7 个组
织器官中的表达
⢖⢋010203040⴨ሩ㺘䗮䟿 哴⢋
图 8 CAV-3 mRNA 在牦牛和黄牛肌肉组织中的表达水平
3 讨论
长久以来窖蛋白(Caveolin)被认为是组成胞膜
窖的基本蛋白结构单元,但是在近期的研究中发现
Caveolin-3 也是肌纤维横列小管的重要组成部分,特
别在发育的肌肉中 Caveolin-3 扮演着非常重要的角
色[12]。本研究首次克隆得到了牦牛 CAV-3 基因的编
码区全长 631 bp,共编码 151 个氨基酸。跨膜域一
般是由 20 个左右的疏水性氨基酸残基组成,是膜内
蛋白与膜脂结合的主要部位。通过对跨膜域的预测
与分析,对该蛋白质的功能、结构和分布具有了一
定的认识和了解。本试验通过生物信息学的方法对
Caveolin-3 蛋白进行分析,结果表明牦牛 Caveolin-3
蛋白在第 79-101 位氨基酸具有一个跨膜结构域。信
号肽一般由 15-30 个氨基酸组成,是疏水性肽片段,
位于新合成肽链的 N 末端,在蛋白质的内质网高尔
基体质膜的分泌途径中发挥重要作用[13]。一般可以
2015,31(5) 199赵娟花等:牦牛 CAV-3 基因的克隆及其在牦牛和黄牛组织的表达分析
0.01)[20]。本研究利用荧光定量 PCR 技术检测 CAV-
3 mRNA 在牦牛和黄牛背最长肌组织的表达,发现
CAV-3 基因在牦牛肌肉组织表达低于黄牛肌肉组织,
但是差异不显著,这也验证了 CAV-3 在骨骼肌中的
表达。本研究克隆了牦牛 CAV-3 基因的编码区序列
并分析了其组织表达规律,为进一步研究其功能及
在肌肉发生和肌肉生理过程中的作用提供参考。
4 结论
牦牛 CAV-3 的编码区的序列长度为 631 bp,编
码 151 个氨基酸,不含信号肽,其蛋白在第 79-101
位氨基酸之间具有一个跨膜结构域。CAV-3 mRNA
在心脏和肌肉组织中能够特异性表达,且 CAV-3 基
因 mRNA 在牦牛肌肉组织的表达水平低于黄牛肌肉
组织的表达水平。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)