全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
以各类农林废弃物为代表的木质纤维素为原料
生产燃料乙醇，具有广阔的应用前景。木质纤维素
类原料中半纤维素组分的有效利用可以使乙醇燃料
的生产成本降低 25%，这主要归功于其中的木糖。
收稿日期 ：2013-08-28
基金项目 ：北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ201310028034），国家自然科学基金项目（31100578）
作者简介 ：金怡，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物酶和发酵工程 ；E-mail ：jinyikele@163.com
通讯作者 ：田沈，博士，教授，研究方向 ：微生物与生物质能源转化 ；E-mail ：cnu_tianshen@sina.com
利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢
葡萄糖木糖重组酿酒酵母
金怡  王震  莫春玲  杨秀山  田沈
（首都师范大学 生命科学学院，北京 100048）
摘 要 ： 利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性，构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验
室专利菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为宿主菌，将树干毕赤酵母 Pichia stipitis CBS6054 的木糖还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶
基因 XYL2 置于磷酸甘油酸激酶基因启动子（PGKp）控制下，酿酒酵母 Y5 内源的木酮糖激酶基因 XKS1 分别由己糖激酶基因启动
子（HXK2p）及其内源启动子（XKS1p）控制。这 3 个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中，打通其木糖上游代谢途径。酶活测
定结果显示，HXK2p 对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌 Y5-X3-1 中木糖还原酶 / 木糖醇脱氢酶 / 木酮糖激酶（XR/XDH/
XK）的酶活比值为 1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的 5 倍，最高乙醇产量为 24.35 g/L，达到理论值的 73%。结果表明，通过调
节 XYL1、XYL2 及 XKS1 启动子的强度，调控其表达水平，进而改变 3 种酶的活性水平，对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙
醇有明显效果。
关键词 ： 重组酿酒酵母 木糖 乙醇 共发酵 启动子
Construction of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Strains Through
Expressing the Key Genes in the Xylose Metabolism Under the Control
of Different Promoters for Co-fermentation Glucose and Xylose
Jin Yi Wang Zhen Mo Chunling Yang XiuShan Tian Shen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract:  In order to obtain a recombinant yeast strain which can co-ferment both xylose and glucose, the key genes of enzymes in the
xylose metabolism were cloned and transformed into Saccharomyces. cerevisiae Y5. The XYL1 and XYL2 genes from Pichia stipitis CBS6054
were placed under the PGKp, which is a constitutive strong promoter ；endogenesis XKS1 gene from S.cerevisiae Y5 was controlled by HXK2p
and the native promoter XKS1p, respectively. We measured the activity of XR、XDH and XK and evaluated the xylose-fermenting abilities of
the engineered strains. The highest xylulokinase activity was observed in the strain Y5-X3-1 whose XKS1 was controlled by HXK2p. The activity
of enzyme ratio was 1∶5∶4 between XR, XDH and XK. Furthermore, the xylose consumption of S.cerevisiae Y5-X3-1 was 5 times as the host
strain during co-fermentation, and the highest ethanol concentration was 24.35 g/L, which correspond to 73% of the theoretical value.
Key words:  Saccharomyces cerevisiae Xylose Ethanol Co-fermentation Promoter
木糖是自然界中含量仅次于葡萄糖的糖分，木糖的
有效利用提高了植物原料生产乙醇的经济效益，因
而对木糖生物转化的研究是充分开发利用半纤维素
的基础［1］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期154
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工业上
生产乙醇的优良菌株，具有许多优秀的生产性能［2］。
但酿酒酵母不能有效地利用木质纤维素中含量次丰
富的木糖［3］。国内外广泛采用能天然代谢木糖产乙
醇的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）作为木糖还原酶
（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的基因来源，构建
出可以代谢木糖的重组酿酒酵母，但是这些重组菌
株发酵木糖能力较弱［4-6］。木酮糖激酶（Xylulokina-
se，XK）在酿酒酵母体内负责催化木酮糖转化为 5-
磷酸木酮糖，处于木糖代谢物进入 PPP 途径的关
键点，是促进木糖代谢向下游进行的关键酶。酿酒
酵母本身具有该酶，但表达量小。研究表明，表达
P.stipitis 的 XYL1、XYL2 并同时超表达自身木酮糖激
酶基因（XKS1），可以促进菌株发酵木糖［7，8］。虽
然表达 XYL1、XYL2 和 XKS1 的重组酿酒酵母可利
用木糖发酵，但大多数的木糖都被用来产生木糖醇，
乙醇发酵效果并不十分理想［9，10］，无法满足工业化
应用。
目前，国内外构建的重组酿酒酵母无法满足工
业化应用的主要原因之一是 XR 和 XDH 的辅酶特异
性不同，容易在代谢过程中由于辅酶因子不能及时
转换，导致氧化还原不平衡造成副产物的积累，从
而影响乙醇的转化效率。Eliasson［11］建立在动力学
模型基础上的数据模拟显示，当 XR/XDH/XK 值为
1∶（≧ 10）∶（≧ 4）时，木糖醇的积累最少，乙
醇产量最多。因此通过改变启动子的强度，调节木
糖代谢关键酶的表达水平，可达到增加乙醇产率，
减少木糖醇积累的目的。Matsushika［12］建立了一系
列含有由 PGKp 和 ADHp 启动子控制 XYL1、XYL2 和
XKS1 的整合质粒的重组工业酿酒酵母。将这 3 个基
因均置于 PGKp 启动子下的 MR-4 重组菌的 XR/XDH/
XK 值最接近理想比值，为 1∶9∶6，其最高乙醇浓
度达到 15.6 g/L，乙醇得率则达到 0.34 g/g，木糖醇产
率下降到 0.04 g/g。这表明通过调整启动子的表达强
度调控这 3 个基因的表达水平具有重要的实践意义。
本实验室前期已在工业菌株 S. cerevisiae Y5 中
成功表达了来自休哈塔假丝酵母的木糖还原酶（XR）
基因，来自热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶（XDH）
基因和来自 Y5 的木酮糖激酶（XK）基因，并建立
了一套适用于 Y5 的转化体系。重组酿酒酵母在以 3%
葡萄糖和 2% 木糖为底物进行厌氧发酵时可在 12 h
内将葡萄糖消耗殆尽，但木糖利用率较低，最大乙
醇产量 11.01 g/L、木糖醇产量 2.45 g/L［13］。
本研究将来自树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的
木糖还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶基因 XYL2，
置于 PGKp 强启动子下，将来自酿酒酵母 S. cerevisiae
Y5 的木酮糖激酶基因 XKS1 分别置于己糖激酶启动
子（HXK2p）和其内源的木酮糖激酶启动子（XKS1p）
下。拟将不同启动子控制下的基因 XYL1、XYL2 和
XKS1 导入到发酵性能良好的 S.cerevisiae Y5 中，以
期能够更加高效稳定发酵葡萄糖和木糖产乙醇的重
组酵母菌株的目标。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）Top-
10、毕赤酵母（Pichia stipitis CBS 6054）、酿酒酵母
S.cerevisiae Y5（实验室专利菌种，专利号 ：ZL2008-
10222897.7） 均 为 本 实 验 室 保 存。 质 粒 pDR195、
PUC18 以及 YIp5-kanR 也均由本实验室保存。克隆
载体 pEASY-T1 Simple 购自北京全式金生物技术有
限公司。
1.1.2 培养基和培养条件 大肠杆菌及转化子用 LB
培养基培养，使用时可补加 100 μg/mL 氨卞青霉素
作为选择培养基用于筛选转化子，37℃静止或摇瓶
振荡培养。酵母菌用 YPD 培养基，30℃静止或摇瓶
振荡培养。
1.1.3 酶、抗生素及试剂 试验所用限制性内切
酶购自宝生物工程（大连）有限公司。分子生物
学操作所用试剂盒、Taq DNA 聚合酶为天根生化科
技（北京）有限公司生产。氨苄抗生素与生化试剂
购自北京鼎国生物技术有限责任公司，所用化学试
剂为分析纯。引物及基因序列的测定均由上海英骏
（Invietrogen）生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 整合载体 YIp5-XRXDH 的构建 分别以表达
载体 pDR195-PGK-xyl1 和 pDR195-PGK-xyl2 为模板，
PCR 扩增 XYL1 和 XYL2 连同 PGKp 启动子和 ADH 终
止子的表达原件 X1、X2。再将 X1、X2 依次连入酵
母整合载体 YIp5-kanR，构建出重组酵母染色体整
2014年第2期 155金怡等 ：利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母
合质粒 YIp5-XRXDH。
1.2.2 酵 母 表 达 载 体 pXKS1-H 和 pXKS1-X 的 构
建 以 S. cerevisiae Y5 基 因 组 为 模 板，PCR 扩 增
HXK2p 启 动 子、XKS1p 启 动 子 和 木 酮 糖 激 酶 基 因
XKS1。YIp5-KanR 为模板扩增筛选标记 KanR。将
HXK2p 启 动 子 连 同 XKS1 基 因 和 ADH 终 止 子 的 表
达 原 件 命 名 为 X3-H ；将 XKS1p 启 动 子 连 同 XKS1
基 因 和 ADH 终 止 子 的 表 达 原 件 命 名 为 X3-X。 将
KanR、X3-H 及 X3-X 连入 PUC18 载体中，分别获得
pXKS1-H 和 pXKS1-X 表达载体。所需引物序列及酶
切位点见表 1。
1.2.3 重组菌株 S. cerevisiae Y5-X3-1 与 S. cerevisiae
Y5-X3-2 的构建 将整合质粒 YIp5-XRXDH 线性化
后分别与表达载体 pXKS1-H 和 pXKS1-X 通过 LiAc
表 1 引物序列及相应酶切位点
引物名称 引物序列（5-3）（下划线部分为相应酶切位点序列）
X1-F-Nhe I CTAGCTAGCACAGCTATGACCATGATTA
X1-R-Sph I CTAGCTAGCTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCC
X2-F-Eag I CGGCCGACAGCTATGACCATGATTA
X2-R- Sph I TAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCC
X3-H-F- EcoR I CGGCCCGGAATTCACAGCTATGACCATGATTACGCC
X3-H-R- Sal I ACGCGTCGACTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCC
X3-X-F- EcoR I CCGGAATTCTCAATTTCACCGCGTTACCCGA
X3-X-R- Sal I ACGCGTCGACTCACGACGTTGTAAA
HXK2p-F-Hind III CCCAAGCTTGCAATTTCCGTCCTCTACTCATGT
HXK2p -R-Xho I CCGCTCGAGTTAGCGTACTTATTATGTGTGGAG
XKS1p-XKS1-F-EcoR I CCGGAATTCTCAATTTCACCGCGTTACCCGA
XKS1p-XKS1-R-BamH I CGCGGATCCGTGCACGCATAATAACGGTG
ADH-F-BamH I CTCTCATCTAAGGATCCAGCTTTGG
ADH-R-Sal I ACGCGTCGACTCACGACGTTGTAAA
KanR-F-Sal ACGCGTCGACAGGCAGCTGTAATC
KanR-R-Nde I GGAATTCCATATGATTTCGAATACGGCCGCCGCAGCTGTAATCC
完整细胞转化法共转化到 S. cerevisiae Y5 中，涂布
于含 G418 的 YPD 培养基上，初步筛选转化子。采
取两步筛选验证方法，首先随机挑取转化子，提取
染色体基因组 DNA，进行 X1 及 X2 片段的 PCR 扩
增，筛选出 YIp5-XRXDH 整合成功的阳性转化子，
进入第二步筛选 ；随后提取阳性转化子中质粒，进
行 X3 片 段 的 PCR 扩 增， 进 一 步 筛 选 出 pXKS1-H
或 pXKS1-X 转 化 成 功 的 转 化 子， 分 别 命 名 为 S.
cerevisiae Y5-X3-1 和 S. cerevisiae Y5-X3-2。
1.2.4 木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）
和木酮糖激酶（XK）酶活的测定 粗酶液的制备以
及木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的酶活
测定完全参照文献［14］进行。用 Coomassie Blue
法［15］测定蛋白质含量。
1.2.5 重组菌 S. cerevisiae Y5-X3-1 与 S. cerevisiae Y5-
X3-2 代谢混合糖产乙醇发酵试验 将待发酵的宿主
菌 S. cerevisiae Y5 和重组菌 S. cerevisiae Y5-X3-1、S.
cerevisiae Y5-X3-2 分别接种于 100 mL YEPD 液体培
养基中，30℃，150 r/min 活化 24 h。然后换成新鲜
的 YEPD 液体培养基，于同样条件下增殖培养 24 h，
测定其细胞含量（OD600 值）。将培养得到的菌液离心，
收集沉淀，用 0.9% NaCL 溶液洗涤沉淀两次，作为
发酵种子液。
将 S. cerevisiae Y5、S. cerevisiae Y5-X3-1，S.
cerevisiae Y5-X3-2 的种子液分别接种到 50 mL 1.5%
葡萄糖、5% 木糖的混合糖培养基中，发酵条件为
30℃，150 r/min。发酵起初每隔 4 h 取样一次，12
h 后每隔 12 h 取样一次，取样量为 1 mL，连续取样
120 h。发酵样品分析葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇
浓度。
1.2.6 发酵试验结果分析方法 糖浓度测定 ：采用
Agilent 1260 高效液相色谱仪，色谱柱 Hi-plex H 柱，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期156
柱温 40℃，检测器为安捷伦示差检测器，流动相
0.005 mol/L 硫酸，流速 0.6 mL/min，进样量为 5 μL。
乙醇浓度测定 ：Agilent7890A 气相色谱仪，色谱柱
HJ-PEG-200M 为 60 m×0.32 mm×0.5 μm， 柱 温 为
120℃，进样量为 1 μL。
2 结果
2.1 重组酵母整合质粒YIp5-XRXDH构建
构 建 流 程 如（ 图 1） 所 示， 分 别 以 pDR195-
PGK-xyl1 和 pDR195-PGK-xyl2 为模板，利用设计的
引物进行 PCR 反应。PCR 产物经电泳检测，发现在
AMP
pDR195-PGK-xyl1
PCK premoter
XYL1
ADHt
URA3
XR
PGKp XYL1 ADHt
Ampicillin
Origin
KanR
Apal
Eagl
Nhel
PGKp XYL2 ADHt
XDH
2u ori
7322 bp
AMP
pDR195-PGK-xyl2
PCK premoter
XYL2
ADHt
URA3
2u ori
7388 bp
AMP
EcoRI Nhel BamHISgrAl
Ylp5-KanR
ILXK2 promoter XKS1 gene XKS1 promoter
Y5 chromosomal DNA
KanR
Sphl
Sall
ORF
origin
SphlBamHI
Nhel
XholSphlBamHIXholNhel
Origin
KanR
7237 bp URA3
AMP
pXKS1-H
Ndel
KanR
Origin
XKS1p
ADHt
Sall
BamHI
XKS1
HXK2p
7041 bp
AMP
pXKS1-X
KanR
Ndel
ADHt
XKS1
EcoRI
BamHI
Sall7219 bp
YIP5-XRXDH
XR
Sphl
XDH
Origin
AMP
Ylp5-KanR
ORF
URA3
KanR
7237 bp
Origin
EcoRI
URA3
10947 bp
AMP puc 18
26865 bp
MCS
LacZ
图 1 载体构建示意图
10000
bp
M 1
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
A B
10000
bp
M 1
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
A ：M，1 kb DNA 分子量标准 ；1，PCR 扩增 X1 大片段 ；
B ：M，1 kb DNA 分子量标准 ；1，PCR 扩增 X2 大片段
图 2 PCR 扩增大片段 X1（A）和 X2（B）
2 230 bp、2 250 bp 处分别有明显条带（图 2）。亚克
隆产物测序结果表明，X1 和 X2 与各自 PCR 模板的
基因序列同源性、蛋白质同源性均达 100%，克隆得
到的基因 X1 和 X2 序列正确。
分 别 用 Sph I、Nhe I 双 酶 切 或 Eag I、Sph I 双
酶切亚克隆产物，经琼脂糖凝胶电泳回收纯化获
得 X1、X2 基 因。 将 X1 连 接 在 YIp5-kanR 的 SphI
与 NheI 位 点， 将 X2 连 接 在 YIp5-kanR 的 Eag I 与
Sph I 位点，构建出重组酵母染色体整合质粒 YIp5-
XRXDH。质粒单、双酶切验证结果正确（图 3）。
2.2 酵母表达载体pXKS1-H和pXKS1-X的构建
构建流程如图 1 所示，以酿酒酵母 Y5 为模板
扩增 HXK2p、XKS1p 和 XKS1 基因。以 YIp5-kanR 为
模板扩增 kanR 筛选标记。分别用 EcoR I、BamH I
和 Sal I、Nde I 双酶切 pXKS1-H 和 pXKS1-X，分别
切 下 2 540 bp/4 501 bp、1 702 bp/5 339 bp 和 2 706
bp/4513、1 702 bp/5 517 bp，质粒构建成功（图 4）。
2014年第2期 157金怡等 ：利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母
提取 S. cerevisiae Y5-X3-2 的染色体基因组 DNA 及质
粒 pXKS1-X，PCR 验证（图 5-B）显示，S. cerevisiae
Y5-X3-2 在 2230 bp、2250 bp 和 3086 bp 处分别有一
个明显条带。两株重组菌株均扩增得到大片段 X1、
X2、X3。亚克隆产物测序结果表明，X1、X2 和 X3
与各自 PCR 模板的基因序列同源性、蛋白质同源性
均达 100%，克隆得到的基因 X1、X2 和 X3 序列正确。
表明外源目的基因成功导入到酵母中。
10000
bp
M 1
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
A B C
10000
bp
M 2
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
10000
bp
M 3
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
M ：1 kb DNA 分子量标准 ；1 ：Sph I 单酶切质粒 YIp5-XRXDH ；2 ：
Sph I/Nhe I 双酶切质粒 YIp5-XRXDH ；3 ：Eag I/Sph I 双酶切质粒
YIp5-XRXDH
图 3 质粒 YIp5-XRXDH Sph I 单酶切验证、Sph I/Nhe I
及 Eag I/Sph I 双酶切验证
bp
M1 1
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
A B
10000
bp
M2 2
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
bp
M3 3
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
C D
10000
bp
M4 4
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
M1 ：500 bp DNA 分 子 量 标 准 ；1 ：EcoR I/BamH I 双 酶 切 质 粒
pXKS1-H ；M2 ：1 kb DNA 分子量标准 ；2 ：Sal I/Nde I 双酶切质粒
pXKS1-H ；M3 ：500 bp DNA 分 子 量 标 准 ；3 ：EcoRI/BamH I 双 酶
切质粒 pXKS1-X ；M4 ：1 kb DNA 分子量标准 ；4 ：Sal I/Nde I 双酶
切质粒 pXKS1-X
图 4 质粒 pXKS1-H 和 pXKS1-X 分别用 EcoR I/BamH I
和 Sal I/Nde I 双酶切验证
bp
M 1 2 3
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
A B
bp
M 1 2 3
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
（A）M ：500 bp DNA 分子量标准 ；1 ：PCR 扩增 X1 大片段 ；
2 ：PCR 扩增 X2 大片段 ；3 ：PCR 扩增 X3 大片段 ；（B）M ：
500 bp DNA 分子量标准 ；1 ：PCR 扩增 X1 大片段 ；2 ：PCR
扩增 X2 大片段 ；3 ：PCR 扩增 X3 大片段
图 5 以 S. cerevisiae Y5-X3-1 基因组为模板 PCR 扩增大片
段 X1、X2 和 X3-H（A）以 S. cerevisiae Y5-X3-1 基
因组为模板 PCR 扩增大片段 X1、X2 和 X3-X（B）
2.4 重组酿酒酵母木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和
木酮糖激酶酶活测定
分 别 测 定 宿 主 菌 S. cerevisiae Y5 及 转 化 子 S.
cerevisie Y5-X3-1 与 S. cerevisiae Y5-X3-2 粗酶液中木
糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）和木酮糖
激酶（XK）的比活力水平，结果（表 2）显示宿主
菌株 S. cerevi-siae Y5 中基本没有木糖还原酶和木糖
醇脱氢酶酶活，木酮糖激酶的酶活水平极低。转化
子 S. cerevisiae Y5-X3-1 和 S. cerevisiae Y5-X3-2 的 木
糖还原酶和木糖醇脱氢酶的比活力分别为宿主菌株
的 160 倍和 78 倍。说明来源于 P. stipitis CBS6054 的
木糖还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶基因 XYL2 在
宿主菌株 S. cerevisiae Y5 中得到了活性表达。此外，
在 Y5-X3-1 菌株中，HXK2 启动子控制下的 XK 显示
出相应较高的酶活水平。
2.5 发酵生长曲线的测定
宿主菌和重组菌株的生长曲线（图 6）显示在
2.3 工业酿酒酵母S. cerevisiae Y5转化及转化子筛选
PCR 验证转化子染色体基因组 DNA 及其质粒，
结果显示，S. cerevisiae Y5-X3-1 在 2230 bp、2250 bp
和 2920 bp 处分别有一个明显条带（图 5-A）；同时
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期158
混合糖培养基中宿主菌 S. cerevisiae Y5 及重组菌的生
长情况。宿主菌生长缓慢，在 120 h 测得其最大生
长量。两株重组菌生长状况相似，且均明显优于宿
主菌，说明异源基因 XYL1 和 XYL2 的插入未影响重
组菌的生长。另外，S. cerevisiae Y5-X3-1 的生长状
况略优于 S. cerevisiae Y5-X3-2。
同一时间点测其葡萄糖消耗完毕，故推断宿主菌 Y5
所产乙醇应全为葡萄糖发酵生成。由图（7-A）可
以看出，宿主菌也能利用少量的木糖，并且产生约
9.02 g/L 木糖醇，一般认为在非特异性还原酶的作用
下，酿酒酵母可以消耗少量的木糖。Y5-X3-1 和 Y5-
X3-2 的木糖消耗均为宿主菌的 5 倍，乙醇产量分别
是宿主菌的 3.3 倍和 2.9 倍。由此说明，木糖代谢关
键酶基因成功导入酿酒酵母 Y5 中，并得以成功表达，
其木糖代谢上游途径已打通。
两株重组菌经 120 h 发酵，Y5-X3-1 在乙醇得
率方面较 Y5-X3-2 增加了 16.1%，前者木糖醇最高
浓 度 为 10.47 g/L， 后 者 为 11.87 g/L， 相 比 下 降 了
13.3%（表 3）。
3 讨论
国内外构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母普遍
采用将天然利用木糖真菌中的 XYL1 与 XYL2 基因转
入 S. cerevisiae，重组菌株虽能利用木糖，但中间产
物木糖醇大量积累，乙醇产量不高。分析原因主要
是重组酿酒酵母中表达的 XR 和 XDH 所需的辅因子
不平衡［16，17］。利用不同启动子对基因表达可以进行
精细调控，使目的基因适度表达，减少由于过量表
达引起的细胞内部负担。
用于大规模乙醇生产的菌株多为耐受乙醇和木
质纤维素水解液中抑制物能力较强，染色体组为多
倍体的工业酿酒酵母菌株［18-21］。二倍体絮凝菌株 S.
cerevisiae Y5 能够耐受发酵过程中产生的较高浓度的
抑制剂，具有良好的乙醇发酵性能［22，23］。本研究以 S.
cerevisiae Y5 为宿主菌，在引入木糖代谢关键酶的同
时过表达木酮糖激酶基因，并通过启动子的不同调
节 3 个酶的酶活比例。
由于己糖激酶基因启动子（HXK2p）转录水平
较 XKS1 基因自身启动子（XKS1p）较强［18］，因此
两株重组菌酶活显示 Y5-X3-1 的木酮糖激酶酶活水
表 2 木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶酶活水平测定
菌株 XR 特异性酶活（U/mg）a XDH 特异性酶活（U/mg）a XK 特异性酶活（U/mg）a
Y5 <0.001 <0.001 <0.01
Y5-X3-1 0.165±0.042 0.784±0.047 0.56±0.04
Y5-X3-2 0.156±0.039 0.776±0.029 0.24±0.02
a 平均值及误差值均由 3 组独立的试验数据计算给定
0
0.0
0.2
0.4
0.6O
D
60
0 0.8
1.0
1.2
1.4
12 24 36 48 60
时间h
72 84 96 108 120
Y5-X3-1
Y5-X3-2
Y5
图 6 S. cerevisiae Y5 及重组菌 S. cerevisiae Y5-X3-1、
S. cerevisiaeY5-X3-2 混合糖发酵生长曲线
2.6 代谢葡萄糖和木糖限氧共发酵试验
重 组 酵 母 菌 S. cerevisiae Y5-X3-1、S. cerevisiae
Y5-X3-2 阳性转化子及宿主菌 S. cerevisiae Y5 在限氧
条件下进行葡萄糖木糖共发酵摇瓶试验。HPLC 检
测分析发酵底物的消耗和产物的生成（图 7）。
重组菌在 4 h 内将葡萄糖消耗殆尽后开始利用
木糖，且均在 120 h 内基本将木糖代谢完毕。将木
酮糖激酶基因 XKS1 置于已糖激酶启动子（HXK2p）
的 重 组 菌 Y5-X3-1 在 96 h 处 测 得 最 大 乙 醇 产 量
24.37 g/L（图 7-B），而将此基因置于其内源启动子
（XKS1p）的重组菌 Y5-X3-2 在 96 h 处测得最大乙醇
产量为 21.47 g/L（图 7-C）。两株重组菌的乙醇产率
分别达到理论值的 76% 和 67%。宿主菌 Y5 在混合
糖发酵初级阶段 8 h 处测得最大乙醇产量 7.40g/L，
2014年第2期 159金怡等 ：利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母
平高于 Y5-X3-2。对比两株重组菌，木酮糖激酶酶
活较高的 Y5-X3-1 在混合糖培养基中的生长能力不
及 Y5-X3-2。Jin 等［19］认为表达过高水平的木酮糖
激酶可能会降低细胞内的 ATP 水平从而影响菌体的
生长。
重 组 菌 Y5-X3-1 和 Y5-X3-2 的 XR/XDH/XK 比
值 分 别 约 为 1∶5∶4 和 1∶5∶2。 其 他 相 关 研 究
结 果 表 明， 当 重 组 菌 的 XR/XDH/XK 比 值 为 1∶
（≧ 10）∶（≧ 4）时，木糖醇积累最少，乙醇产量
最多［11］。Y5-X3-1 的 XR/XDH/XK 比值与理论值最
相近，乙醇产量最高。
4 结论
本文将来自树干毕赤酵母（P.stipitis）的木糖
50
40
30
20
10
0
0 12 24 36 48 60ᰦ䰤h72 84 96 108 120
ᵘ㌆㪑㨴㌆҉䞷ᵘ㌆䞷
0
5
10
15
25
20
҉䞷
৺ᵘ
㌆䞷
⎃ᓖ
g/L

ᵘ㌆
৺㪑
㨴㌆
⎃ᓖ
g/L

A
50
40
30
20
10
0
0 12 24 36 48 60ᰦ䰤h72 84 96 108 120
0
5
10
15
25
20
҉䞷
৺ᵘ
㌆䞷
⎃ᓖ
g/L

ᵘ㌆
৺㪑
㨴㌆
⎃ᓖ
g/L

B
ᵘ㌆㪑㨴㌆҉䞷ᵘ㌆䞷
50
C
40
30
20
10
0
0 12 24 36 48 60ᰦ䰤h72 84 96 108 120
0
5
10
15
25
20
҉䞷
৺ᵘ
㌆䞷
⎃ᓖ
g/L

ᵘ㌆
৺㪑
㨴㌆
⎃ᓖ
g/L

ᵘ㌆㪑㨴㌆҉䞷ᵘ㌆䞷
图 7 S. cerevisiae Y5 混合糖发酵（A）；S. cerevisiae Y5-X3-1 混合糖发酵（B）；S. cerevisiae Y5-X3-2 混合糖发酵（C）
表 3 葡萄糖和木糖限氧分批共发酵的糖利用和产物生成
菌株
葡萄糖消耗量
（g/L）a
木糖消耗量
（g/L）a
木糖消耗速率
（g/（L·h））a
最大乙醇浓度
（g/L）a
乙醇得率
（g/g）a，b
乙醇生产速率
（g/（L·h））a
木糖醇得率
（g/g）a
Y5 14.59±0.032 9.18±0.043 0.076±0.041 7.40±0.035 0.12±0.040 0.061±0.037 0.13±0.043
Y5-X3-1 14.78±0.021 47.39±0.020 0.394±0.028 24.37±0.012 0.39±0.016 0.203±0.016 0.16±0.022
Y5-X3-2 14.59±0.022 48.61±0.017 0.405±0.014 21.47±0.040 0.34±0.042 0.179±0.034 0.18±0.042
a 平均值及误差值均由 3 组独立的试验数据计算给定 ；b 乙醇得率是在 120 h 发酵后，由乙醇产量比总糖消耗量得到
还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶基因 XYL2 置于
PGKp 强启动子下 , 同时将来自酿酒酵母 S. cerevisiae
Y5 的木酮糖激酶基因 XKS1 分别置于己糖激酶启动
子（HXK2p）和其内源的木酮糖激酶启动子（XKS1p）
下。通过启动子的调控，实现 XR/XDH/XK 三者比
值达到 1∶5∶4，接近 1∶（≧ 10）∶（≧ 4）的最
优比例，从而降低了副产物木糖醇的积累，提高了
乙醇的产率，初步实现了构建更为高效稳定共代谢
葡萄糖和木糖产乙醇重组酿酒菌株的目标。
参 考 文 献
［1］ 曹秀华 , 阮奇城 , 林海红 , 等 . 纤维燃料乙醇生产中木糖发酵的
研究进展［J］. 中国麻业科学 , 2010, 32（3）：166-182.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期160
［2］ 谢丽萍 , 王正祥 , 诸葛健 . 利用可再生资源生产酒精的细菌、
酵母中的代谢工程［J］. 食品与发酵工业 , 2002, 127（112）：
63-68.
［3］ Jeffries TW, Jin YS. Metabolic engineering for improved fermentation
of pentoses by yeasts［J］. Applied Microbiology and Biotechnology,
2004, 63（5）：495-509.
［4］ Guo T, Liang DF, Bao XM. Establishment and ethanol fermentation of
a xylose metabolic pathway in an industrial strain of Saccharomyces
cerevisiae［J］. Sugarcane and Canesugar, 2007, 3 ：26-29.
［5］ Johansson B. Hahn-Hägerdal B. The non-oxidative pentose
phosphate pathway controls the fermentation rate of xylulose but not
of xylose in Saccharomyces cerevisiae TMB3001［J］. FEMS Yeast
Research, 2002, 2（3）：277-282.
［6］ Wahlbom CF, Zyl WH, Jönsson LJ, et al. Generation of the improved
recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae TMB 3400
by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia
stipitis CBS 6054［J］. FEMS Yeast Res, 2003, 3（3）：319-326.
［7］ Johansson B, Christensson C, Hobley T, et al. Xylulokinase overexp-
ression in two strains of Saccharomyces cerevisiae also expressing
xylose reductase and xylitol dehydrogenase and its effect on fermen-
tation of xylose and lignocellulosic hydrolysate［J］. Appl Environ
Microbiol, 2001, 67（9）：4249-4255.
［8］ Wang Y, Shi WL, Liu XY, et al. Establishment of a xylose metabolic
pathway in an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae［J］.
Biotechnology Letters, 2004, 26（11）：885-890.
［9］ Lee SH. Kodaki T, Park YC, et al. Effects of NADH-preferring xylose
reductase expression on ethanol production from xylose in xylose-
metabolizing recombinant Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of
Biotechnology, 2012, 158（4）：184-191.
［10］ Katahira S, Mizuike A, Fukuda H, et al. Ethanol fermentation
from lignocellulosic hydrolysate by a recombinant xylose- and
cellooligosaccharide-assimilating yeast strain［J］. Applied
Microbiology and Biotechnology, 2006, 72（6）：1136-1143.
［11］ Eliasson A, Hofmeyr J-HS, Pedler S, et al. The xylose reductase/
xylitol dehydrogenase/xylulokinase ratio affects product formation
in recombinant xylose-utilising Saccharomyces cerevisiae［J］.
Enzyme Microbial Technology, 2001, 29（4/5）：288-297.
［12］ Matsushika A, Sawayama S. Comparative study on a series of reco-
mbinant flocculent Saccharomyces cerevisiae strains with different
expression levels of xylose reductase and xylulokinase［J］. Enzyme
Microbi Technol, 2011, 48 ：466-471.
［13］ 张洁宁 , 田沈 , 杨秀山 . 提高木糖代谢能力的酿酒酵母 Y5-X3
的初步构建［J］ . 可再生能源 , 2012, 30（4）：47-51.
［14］ Matsushika A, Watanabe S, Kodaki T, et al. Expression of protein
engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase increases eth-
anol production from xylose in recombinant Saccharomyces cerevis-
iae［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81（2）：243-255.
［15］ Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-
dye binding［J］. Analy Biochem, 1976, 72（1/2）：248-254.
［16］ Steinmetz EJ, Warren CL, Kuehner JN, et al. Genome-wide
distribution of yeast RNA polymerase II and its control by Sen1
helicase［J］. Molecular Cell, 2006, 24（5）：735-746.
［17］ Watanabe S, Salen AA, Pack SP, et al. Ethanol production from
xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing protein
engineered NADP+-dependent xylitol dehydrogenase［J］. Journal
of Biotechnology, 2007, 130（3）：316-319.
［18］ Peng BY, Shen Y, Li XW, et al. Improvement of xylose fermentation
in respiratory-deficien xylose-fermenting Saccharomyces
cerevisiae［J］. Metabolic Engineering, 2012, 14 （1）：9-18.
［19］ Xiong MY, Chen GH, Barford J, et al. Alteration of xylose
reductase coenzyme preference to improve ethanol production by
Saccharomyces cerevisiae from high xylose concentrations［J］.
Bioresource Technology, 2011, 102 （19）：9206-9215.
［20］ Jin YS, Ni HY, Laplaza JM, et al. Optimal growth and ethanol
production from xylose by recombinant Saccharomyces cerevisiae
require moderate D-xylulokinase activity［J］. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69（1）：495-503.
［21］ Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, et al. Purification and properties
of the NAD+-xylitol-dehydrogenase from the yeast Pichia stipitis
［J］. Joural of Fermentatin Bioengineering, 1989, 67（1）：20-24.
［22］ Tian S, Zhu JY, Yang XS. Evaluation of an adapted inhibitor-
tolerant yeast strain for ethanol production from combined
hydrolysate of softwood［J］. Applied Energy, 2011, 88（5）：
1792-1796.
［23］ Tian S, Yang XS, Zhu JY. Robust cellulosic ethanol production
from SPORL-pretreated lodgepole pine using an adapted strain
Saccharomyces cerevisiae without detoxification［J］. Bioresource
Technology, 2010, 101（22）：8678-8685.
（责任编辑 李楠）