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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):213-217
Neurexophilin（NXPH）是一种从大鼠和牛的脑
部分离纯化的神经糖蛋白，其成熟肽 29 kD，因其与
神经元表面蛋白 Iα（neurexin Iα）紧密结合而命名［1］。
哺乳动物至少含 4 个与 NXPH 相关的基因，分别是
nxph1、nxph2、nxph3 和 nxph4，这 4 种基因在不同
动物不同组织中的表达不一致，如人类可表达 4 种
基因，而鼠类则只表达 nxph1、nxph3 和 nxph4 基因，
且只有 NXPH1 和 NXPH3 可以与 neurexin Iα 结合［2］。
朱金金等［3］发现 nxph1 是鸡子宫阴道结合部的差异
表达基因，且该基因在高受精率组母鸡子宫阴道交
接部的表达高于低受精率组，推测其可能与精子贮
存相关。刘桂琼等［4］也发现在人工授精后，母鸡贮
精腺表达神经系统内特异表达的 Neurexophilin1 基
因，而高受精力母鸡贮精腺 Neurexophilin1 表达量高
于低受精力母鸡，因此神经调控可能参与贮精腺内
的精子贮存。本研究根据酵母基因表达的密码子偏
收稿日期 ： 2014-07-07
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31071088）
作者简介 ：陈美玲，女，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：chenmeiling064@126.com
通讯作者 ：刘桂琼，副教授，E-mail ：liuguiqiong@mail.hzau.edu.cn
鸡 neurexophilin 1 基因在毕赤酵母中的表达
陈美玲  聂彬  姜勋平  刘桂琼
（华中农业大学动物科技学院，武汉 430070）
摘 要 ： Neurexophilin 1 是母鸡子宫阴道结合部位的差异表达基因。根据鸡 nxph1 的序列，结合毕赤酵母密码子的偏好
性，合成 nxph1 基因，设计引物以合成基因为模板，扩增其去除信号肽的 DNA 序列△ nxph1，将合成的 nxph1 基因及去除信号肽
的 nxph1 基因片段△ nxph1 分别插入 pPICZαA 真核表达载体，构建重组表达质粒 pPICZαA/nxph1 和去除信号肽的重组表达质粒
pPICZαA/ △ nxph1，电转入毕赤酵母 GS115，阳性菌用终浓度为 1％的甲醇诱导表达，SDS-PAGE 电泳和 Western blot 检测表达产物，
结果表明重组菌成功分泌鸡 NXPH1 蛋白和去除信号的△ NXPH1 蛋白，大小约 29 kD，为探索 NXPH1 在母鸡生殖道内的功能奠定
基础。
关键词 ： nxph 1 ；毕赤酵母 ；基因表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.030
Expression of Chicken Neurexophilin 1 Gene in Pichia pastoris
Chen Meiling Nie Bin Jiang Xunping Liu Guiqiong
（College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070）
Abstract: Neurexophilin 1 is the differentially expressed gene at the chicken utero-vaginal junction. According to the mRNA sequence
of chicken nxph1 and codon bias of Pichia pastoris, the modified DNA sequence for chicken nxph1 which encodes the same amino acid
sequence as that of chicken nxph1were synthesized. Specific primers were designed to amplify part of the synthesized DNA sequence whose
expression product has no signal peptide. The two sequences were inserted into pPICZαA vector to construct the recombinant pPICZαA/
nxph1 and pPICZαA/ △ nxph1（without signal peptide）, and then the recombinant plasmids were transfected into Pichia pastoris GS115
by electroporation. The positive recombinant strains were inducted to express protein by addition of 1 % methanol. The expression protein
was displayed on the Tricine-SDS- PAGE electrophoresis and Western blot. The result showed that chicken NXPH1 protein and △NXPH1
protein were successfully expressed, and the molecular weight of the protein was approximately 29 kD, which provided foundations for analyzing
functions of NXPH1 in chicken reproductive tract.
Key words: nxph 1 ；Pichia pastoris ；gene expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3214
好改造鸡 nxph1 基因，在毕赤酵母 GS115 中表达该
基因，以期为后续研究 NXPH 1 蛋白的生物学功能
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
真核表达载体 pPICZαA、毕赤酵母 GS115 菌株
为华中农业大学国家微生物重点实验室郭爱珍教授
课题组惠赠 ；克隆载体 PMD-18T 购自大连宝生物公
司（TaKaRa）公司 ；大肠杆菌 DH5α 菌株购自北京
全式金生物技术有限公司 ；
ZeocinTM 购自 Invitrogen 公司 ；质粒提取试剂盒
购自 Omega 公司 ；T4 DNA 连接酶、TEMED、限制
性内切酶 EcoR Ⅰ、Not Ⅰ、Sac Ⅰ均购于 TOYOBO
公司 ；neurexophilin 1 抗体购自美国 R&D 公司。
1.2 方法
1.2.1 Nxph1 基因合成和引物设计 根据 GenBank
公 布 的 鸡 nxph1 基 因（XM-418683）mRNA 编 码 序
列，结合毕赤酵母密码子的偏好性优化序列，在基
因的两端添加 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ限制性内切酶位点，
序列长为 833 bp，序列依次为保护性碱基、EcoR Ⅰ
酶切位点、氨基酸的编码序列 813 bp、Not Ⅰ酶切位
点和保护性碱基。依据优化后的碱基序列设计一对
可扩增去除 NXPH1 蛋白信号肽的特异性引物 P1 和
P2，并在引物序列的两端分别添加 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ
两个限制性内切酶位点，其扩增产物为 770 bp，其
中氨基酸的编码序列长 750 bp，将该序列命名为
△ nxph1。优化基因序列和引物由北京金唯智公司
合成。
1.2.2 Nxph1 基因的序列鉴定 以合成的 nxph1 基因
为模板，分别以 P1/P2 为上下游引物进行 PCR 扩增。
PCR 反应条件 ：94℃ 预变性 4 min，94℃变性 30 s，
55℃退火 1 min，72℃延伸 30 s，40 个循环，72℃延
伸 10 min。2％的琼脂糖凝胶检测 PCR 产物。DNA
凝胶回收试剂盒（北京庄萌生物公司）回收 PCR 产
物，与 pMD18-T 载体连接，转化 DH5α，提取质粒
后用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切鉴定，阳性克隆菌液送
上海生工测序。
1.2.3 酵母表达载体的构建 将△ nxph1 质粒、合
成的基因 nxph1 和酵母表达载体 pPICZαA 用 EcoR Ⅰ
和 Not Ⅰ在 37℃条件下双酶切 3 h，2％的琼脂糖
凝胶电泳，回收酶切产物，T4 DNA 连接酶 16℃连
接过夜，构建成重组表达质粒 pPICZαA/ nxph1 和
pPICZαA/ △ nxph1。连接产物转化 DH5α 感受态细
胞，挑选菌落培养提质粒，用通用引物 5 AOX 和 3
AOX 进行 PCR 鉴定，用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ进行双酶
切鉴定，阳性克隆菌液送上海生工测序。
1.2.4 构建重组 nxph1 的酵母菌株 用 Sac Ⅰ线性
化重组质粒 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1，
取制备好的 GS115 感受态 50 μL 与 10 μL 线性化的
pPICZαA/nxph1、pPICZαA/ △ nxph1 质粒充分混匀后
转移到预冷的 0.2 cm 电击杯中，放入 Bio-Rad 电转
仪中 1 500 V、50 μF 和 500 μs 电击，立即加入 1 mL
冰冻的山梨醇液，冰浴静止 10 min，菌液 30℃孵育
1.5 h，离心后弃上清液，取 100 μL 混合沉淀涂布在
含 有 Zeocin（100 μg/mL） 的 YPD 平 板 上，30℃ 培
养至出现白色单菌落。挑选白色单菌落培养，采用
“煮 - 冻 - 煮”的方法提取酵母基因组，用通用引物
扩增，1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.5 NXPH1 在酵母中的表达 阳性酵母重组质粒
菌液接种 BMGY 培养基，30℃、220 r/min 培养 20-
24 h。室温 6 000 r/min 离心 5 min，弃上清，沉淀用
100 mL 的 BMMY 培养基悬浮，30℃、220 r/min 振荡
培养，甲醇诱导表达，每隔 24 h 添加 100 % 甲醇使
终浓度为 1.0 %，持续诱导 96 h，每次添加甲醇时取
2 mL 的菌液，12 000 r/min 离心 5 min，取上清至新
的离心管中 -20℃保存。按照 BCA 蛋白浓度定量试
剂盒（北京索莱宝生物）测定表达蛋白的浓度，选
择诱导 72 h 的上清液进行真空冷冻干燥，冻干后的
蛋白于 -20℃长期保存备用。
1.2.6 表 达 产 物 的 SDS-PAGE 和 Western blot 检
测 将 100 μL 的三氯乙酸加入到 1 mL 的表达上清，
4℃过夜。12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，加
入 1 mL 预冷的丙酮，-20℃静止 30 min，离心弃上清，
室温晾干获得浓缩蛋白。向离心管中加入 100 μL 的
2×SDS-PAGE Loading Buffer，将离心管在沸水中煮
10 min，取 10 μL 做 Tricine-SDS-PAGE，考马斯亮蓝
染色，同时转印到硝酸纤维素膜上进行 Western blot
分析。
2015,31(3) 215陈美玲等 ：鸡 neurexophilin 1 基因在毕赤酵母中的表达
2 结果
2.1 △nxph1的PCR扩增
PCR 扩增的产物经 2 % 的琼脂糖凝胶进行电
泳，可以看出在 750 bp 附近有一特异性的 DNA 条带，
与预期目的产物（770 bp）相符（图 1）。将 PCR 产
物连接 T 载体，阳性克隆再用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶
切鉴定，在 2 000 bp 和 750 bp 有特异性条带（图 2），
分别是 T 载体片段和△ nxph1 目的基因片段，将此
阳性克隆的菌液进行测序检测，确定为目的基因
片段。
pPICZαA/nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1 为 模 板 进 行
PCR 反应，检测到扩增出的目的片段大小在 1 000-
1 500 bp 之间（图 4）。目的基因序列大小为分别为
813 bp 和 750 bp，载体自身序列为 588 bp，故扩增
产物的片段大小约 1 300 bp，扩增产物片段与预测
片段一致，可以进一步进行测序检测。
2000
bp
1 M
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：PCR 产物
图 1 △ nxph1 PCR 产物
2.2 重组表达质粒的鉴定
用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切重组质粒 pPICZαA/
nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1， 酶 切 的 重 组 质 粒
pPICZαA/ nxph1 应在约 3 500 bp 处和 813 bp 处有特
异性的条带，酶切的重组质粒 pPICZαA/ △ nxph1 应
在约 3 500 bp 处和 750 bp 处有特异性的条带，图 3
显示在 3 500 bp 处和 700-1 000 bp 处分别有两条带，
与预期结果相符。
以 5AOX 和 3AOX 为引物，以重组表达质粒
2000
1 M
1000
750
500
250
100
bp
M ：DNA Marker ；1 ：△ nxph1 阳性克隆的 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ酶切产物
图 2 △ nxph1 阳性克隆的双酶切
2000
1 2M
1500
700
500
400
200
bp
M ：DNA Marker ；1 ：EcoR Ⅰ 和 Not Ⅰ 酶 切 重 组 质 粒 pPICZαA/ nxph1 ；2 ：
EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ酶切重组质粒 pPICZαA/ △ nxph1
图 3 重组表达质粒 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/nxph1
的酶切图
2000
1 2M
1500
1000
700
400
200
bp
M ：DNA Marker ；1 ：pPICZαA/ nxph1 的 PC R 结 果 ；2 ：pPICZαA/ △ nxph1
的 PCR 结果
图 4 重组质粒 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1
的 PCR 检测
将 PCR 鉴 定 和 双 酶 切 鉴 定 正 确 的 重 组 质 粒
pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1 送上海生工进
行序列测定，测序结果证明目的基因片段已正确插
入到载体 pPICZαA 中。
2.3 重组酵母菌的鉴定
重组表达质粒 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ n-
xph1 转入到毕赤酵母 GS115 后，以 5AOX 和 3AOX
为引物进行 PCR 检测，在 1 000-1 500 bp 处有一条
特异性条带（图 5），扩增产物的片段大小约 1 300
bp，扩增产物片段与预测片段一致，说明目的基因
片段已整合入酵母基因组。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3216
2.4 Tricine-SDS-PAGE和Western blot检测结果
阳性重组菌用甲醇诱导表达，将表达产物浓缩
变 性 后 进 行 Tricine-SDS-PAGE 电 泳， 用 pPICZαA
空酵母载体作对照，电泳完毕后考马斯亮蓝 R-250
进行染色，发现在约 29 kD 处有一条清晰的细条带，
对照组没有条带。选择诱导 72 h 的蛋白做 Western
blot，结果（图 6）显示在相应位置有特异的免疫性
条带。
可以进行修饰，另外有利于表达蛋白的分离纯化［5］。
pPICZαA 载 体 是 含 有 强 启 动 子 AOX1 和 α-交 配 因
子信号肽序列，能够引导外源蛋白的分泌，可以用
ZeocinTM 抗性基因对重组子直接进行筛选，同时载
体上 His 标签可以进行亲和纯化［6-8］。本试验选用
pPICZαA 作为表达载体，携带外源基因 nxph 1 进入
酵母表达系统并整合入酵母 GS115 的染色体，利用
pPICZαA 表达载体上的信号肽序列引导 NXPH1 蛋白
的分泌，使 NXPH1 高效表达，也证实外源基因在毕
赤酵母中能得到高表达。
1987 年，Hoekema 等报道了酵母所偏爱的 25
个密码子，所以在合成外源基因时可以根据毕赤酵
母的密码子偏爱性，在保持翻译时氨基酸不变的
情况下对密码子进行突变以获得高效表达的蛋白。
2002 年，Sinclair 和 Choy 在毕赤酵母中表达人源葡
糖脑苷酯酶时，通过对 C+G 含量的调整和密码子的
优化证明其蛋白产量比天然基因提高很多倍［9］。张
朝春和梁伟锋［10］根据人神经营养素（hNT-3）的
基因序列，根据毕赤酵母密码子的偏爱性把编码氨
基酸的密码子进行了替换，发现蛋白表达量提高 11
倍。Delroisse 等［11］研究发现没有改造的赤拟盗羧
酯酶基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中并不表达，
但是当按照酵母密码子的偏好性改造之后，可以检
测到改基因的表达。Shumiao 等［12］研究也发现通过
优化密码子之后，可以大幅度提高瑞氏木霉纤维素
内切酶基因的表达量。本研究根据 GenBank 上公布
的鸡 nxph1 基因 mRNA 编码序列，结合毕赤酵母密
码子的偏好性优化序列，将优化后的鸡 nxph1 全长
基因序列和去除信号肽的鸡△ nxph1 基因序列分别
定向插入酵母载体，电转化入 GS115，转化后阳性
菌用抗性进行筛选，甲醇诱导表达，表达的产物为
NXPH1，表明我们已经通过毕赤酵母表达系统成功
2000
1 2M
1500
1000
700
400
200
bp
M ：DNA Marker ；1 ：pPICZαA/ nxph1 PCR 结果 ；2 ：pPICZαA/ △ nxph1 PCR
结果
图 5 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1 在 GS115
中的 PCR 鉴定
130
kD 1 2 3
4 5
M
100
70
55
40
35
25
1.5
A B
M ：蛋白质 Marker ；1 ：载体 ；2 ：重组蛋白 pPICZαA/ nxph1 表达上清 ；
3 ：pPICZαA/ △ nxph1 表达上清 ；4 ：pPICZαA/ nxph1 Western blot 结果 ；
5 ：pPICZαA/ △ nxph1 Western blot 结果
图 6 重组蛋白的 Tricine-SDS-PAGE 和 Western blot 检测
2.5 蛋白浓度检测结果
蛋白标准品绘制完成蛋白标准曲线，R2=0.992，
说明标准曲线较为理想，可以用于测定蛋白样品浓
度。表 1 是分别对诱导 48 h、72 h、96 h 的重组蛋
白 pPICZαA/ nxph1 和 pPICZαA/ △ nxph1 的浓度检测
结果，从表中可以看出去除信号肽的 NXPH1 表达量
相对更高一些，且在 72 h 蛋白的浓度达到最高。
3 讨论
巴斯毕赤酵母作为真核机体对产生蛋白的翻译
表 1 蛋白浓度测定结果
样品 诱导时间 /h A595OD 值 浓度 /（mg·mL
-1）
重组蛋白
pPICZαA/ nxph1
48 0.0396 0.420
72 0.0419 0.480
96 0.0314 0.208
重组蛋白
pPICZαA/ △ nxph1
48 0.0404 0.440
72 0.0451 0.563
96 0.0396 0.420
2015,31(3) 217陈美玲等 ：鸡 neurexophilin 1 基因在毕赤酵母中的表达
表达鸡 NXPH1 蛋白。Thill 等［13］研究发现，如果在
外源基因的自身信号肽引导下表达蛋白，则酵母细
胞自身信号肽的表达量不高，而且分泌效率也低，
因此在构建质粒时通常将外源基因的信号肽去除。
龚婷等［14］对鸡白介素 -2 基因进行去除信号肽和全
基因的诱导表达研究发现，在相同条件下去除信号
肽的重组质粒的表达量高。马亮等［15］也在弓形虫
表面抗原 SAG3 基因的原核表达发现，不含信号肽
的 SAG3 基因，所构建的原核表达质粒在大肠杆菌
中具有高效表达。另有研究表明，利用外源基因的
信号肽引导表达的蛋白较易降解，利用酵母细胞对
外源蛋白的信号肽识别后对蛋白进行传送，则表达
的外源蛋白更稳定［16］。所以本试验中同时选取了去
除信号肽的△ nxph1 基因和 nxph1 全基因，转化到
酵母中，蛋白的表达量分别为 0.563 mg/mL 和 0.480
mg/mL，结果也证实去除信号肽的 NXPH1 表达量相
对更高一些。
4 结论
本研究根据 GenBank 上公布的鸡 nxph1 的序列，
结合毕赤酵母码子的偏好性，成功构建了重组表达
质粒 pPICZαA/ nxph1 和去除信号肽的重组表达质
粒 pPICZαA/ △ nxph1，并成功获得大小约 29 kD 鸡
NXPH1 蛋白和去除信号的△ NXPH1 蛋白，且去除
信号肽的 NXPH1 表达量相对更高。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）