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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):244-250
1972 年，Gery 等从人白细胞的培养上清中提取
得到一种可溶性物质，起初被命名为淋巴细胞激活
因子或内源性热原质、破骨细胞刺激因子、黑素瘤
细胞生长抑制因子等，在 1979 年被统一命名为白细
收稿日期 ：2014-12-22
基金项目 ：国家“973”前期研究专项（2012CB722304），河南省自然科学基金项目（142300413212，132300413208），河南省重大科技攻关
项目（111100910600）
作者简介 ：李斌，女，硕士，研究方向 ：微生物药物研究与开发，E-mail ：libin8806@163.com
通讯作者 ：徐存拴，男，教授，研究方向 ：微生物药物研究与开发，E-mail ：cellkeylab@126.com
重组人白细胞介素 -1α 在毕赤酵母中的表达、纯化及
生物学活性检测
李斌  许晓亚  杨刚刚  崔晴晴  杨亚娟  徐存拴
（河南师范大学生命科学学院 河南省一科技部共建细胞分化国家重点实验室培育基地和河南省生物工程重点实验室，新乡 453007）
摘 要 ： 在毕赤酵母中分泌表达重组人白细胞介素 -1α（rhIL-1α），优化 rhIL-1α 的发酵工艺及纯化方法，以获得高表达、高
纯度具有生物学活性的 rhIL-1α。通过 PCR 扩增获得 hIL-1α 基因，构建其真核表达载体 pPICZαA/hIL-1α，电转化至毕赤酵母 X-33，
用 PCR 和 SDS-PAGE 方法筛选高效表达 rhIL-1α 的工程菌株并进行 Western blot 鉴定，DEAE 弱阴离子离子交换层析一步纯化表达
产物，并用 MTT 法初步检测其对人肝癌细胞 7402 的生物学作用。rhIL-1α 在摇瓶规模下，经甲醇诱导 4 d 后表达量约为 30 mg/L。
Western blot 检测 rhIL-1α 的特异性结合，获得纯度约 95%，收率 40% 左右的 rhIL-1α，并证明 rhIL-1α 能够抑制人肝癌细胞 7402 的
增殖。构建了重组 hIL-1α 的基因工程菌，并在毕赤酵母中实现了高效表达，为进一步研究其生物学活性和功能奠定了基础。
关键词 ： 重组人白细胞介素 -1α ；毕赤酵母 ；表达 ；纯化 ；人肝癌细胞
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.035
Expression，Purification and Bioactivity of Recombinant Human
Interleukin-1α Expressed in Pichia pastoris
Li Bin Xu Xiaoya Yang Ganggang Cui Qingqing Yang Yajuan Xu Cunshuan
（State Key Laboratory Cultivation Base for Cell Differentiation Regulation and Henan Bioengineering Key Laboratory，Henan Normal
University，College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang 453007）
Abstract: This work is to secret and express human interleukin-1α（rhIL-1α）in Pichia pastoris and optimize the fermentation and
purification process of rhIL-1α for obtaining the rhIL-1α with high-purity, high-expression and owing biological activity. The gene hIL-1α
amplified by PCR was constructed into the eukaryotic expression vector pPICZαA/hIL-1α, and then it was transformed into the P. pastoris X-33
strain via electroporation．The engineering strain with high-expression of rhIL-1α was screened and assayed by the methods of PCR and SDS-
PAGE, further indentified by Western blot. The expressed product was purified by the DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography,
and the bioactivity of it to human cancer Bel-7402 cell was initially assayed. Results showed that inducing rhIL-1α by methanol for 4 d at shaking
flask level, the expression reached 30mg/L, the test by Western blot revealed that specific binding activity of rhIL-1α was detected ；the purity of
the rhIL-1α reached about 95％ and the yield was about 40% ；rhIL-1α inhibited the proliferation of Bel-7402 cells. In conclusion, recombinant
engineering vector of rhIL-1α was successfully constructed, and it was highly expressed in P. pastoris, which lays groundwork for further study of
its function and bioactivity.
Key words: recombinant human interleukin-1α ；Pichia pastoris ；expression ；purification ；Bel-7402 cell
2015,31(9) 245李斌等：重组人白细胞介素 -1α 在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测
胞介素 -1（IL-1）［1］。IL-1 按其结构不同分为 IL-1α
和 IL-1β。IL-1α 基因定位于 2 号染色体，含 7 个外
显子，IL-1α 的前体是由 IL-1α 基因合成的、无信号
肽的 31 kD 分子。IL-1α 前体被 Ca2+ 依赖的钙蛋白
激酶降解为 17 kD 的成熟体，等电点为 5.3，IL-1β
是由 153 个氨基酸以 β- 折叠的形式组成位于 2 号
染色体，分子量约为 17.5 kD，等电点为 7.2。IL-1α
和 β 在同一种属中两者的同源性只有 20%-30%，但
在不同种属间具有较高同源性，分别为 60%-70%
和 75%-78%［2，3］。IL-1α 具 有 很 重 要 的 研 究 意 义
和应用价值，文献报道 IL-1α 在白血病、肝癌、黑
色素瘤、胃癌等在内的多种肿瘤中均有表达［4-6］，
而其表达机制尚不清楚。临床试验表明，50 ng/kg
IL-1α 可治疗骨髓或干细胞移植期间早期血小板的减
少［7，8］。头颈部临床试验 III 期发现，IL-1α 具有重
要的免疫治疗作用（Cel-Sci Corp）。
目前，IL-1α 主要通过原核表达系统［9］制备，
而真核表达系统尚未见报道。由于原核表达体系存
在产量低，操作复杂，后期复性困难等问题。为得
到表达量高、活性高的 IL-1α，更好地研究 IL-1α 的
特性和功能，本研究利用巴斯德毕赤酵母表达 hIL-
1α，在 1 L 摇瓶规模下对其进行表达条件优化和分离
纯化方法探索，同时，对 hIL-1α 的活性进行了初步
研究。
1 材料与方法
1.1 材料
E.coli DH5α 购自武汉晶赛生物工程技术有限公
司，毕赤酵母 X-33 菌株和 pPICZαA 分泌型酵母表
达载体购自 Invitrogen 公司，重组人白细胞介素 -1α
基因委托上海生工生物工程有限公司合成，兔多抗
人 IL-1α 抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的山
羊抗兔二抗购自 Invitrogen 公司，人肝癌细胞（Bel-
7402）购自中科院上海细胞库，RPIM1640 培养基购
自 Invitrogen 公司，胎牛血清购自杭州天杭生物科技
有限公司，MTT、DMSO 购自 Geneview 公司，限制
性内切酶 SacI、BamH I 和 EcoR I 等购自 MBI 公司，
Protein Ladder 购自北京康为世纪生物科技有限公司，
考马斯亮蓝 G-250（分析纯）购自中国医药公司，
牛血清白蛋白（生化试剂）购自西安沃尔森生物技
术有限公司，其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人白介素 -1α 基因（hIL-1α）的设计及载体的
构建 在 GenBank 上搜索得到 IL-1α 基因的全序列
（NM_000575），通过查阅文献确定 IL-1α 蛋白的成
熟序列，利用在线序列优化工具对 IL-1α 核苷酸序
列进行人工优化（http ：//www.evolvingcode.net），在
不改变氨基酸序列的情况下，密码子替换为高频使
用或次高频使用的密码子［10］。人工合成优化（终止
序列调整、密码子优化并提高 GC 含量）后的 IL-1α
基因序列连接至 T 载体，进行测序，用 EcoR Ⅰ /
Not Ⅰ双酶切 IL-1α/pUC-T 及质粒 pPICZαA，回收目
的基因片段和载体片段进行连接，连接产物转化至
DH5α 感受态，经蓝白斑筛选阳性克隆、提取质粒
进行 PCR 和双酶切鉴定，结果正确后进行测序。以
上操作由上海生工生物有限公司完成。
1.2.2 酵母分泌型表达载体的转化 重组表达质粒
pPICZαA/hIL-1α 以 Sac I 线性化，按毕赤酵母表达
手册中电转化方法，将重组表达质粒转至毕赤酵母
X-33 感受态细胞，将转化的 X-33 涂于含 100 μg/mL
博来霉素（Zeocin）的 YPD 平板上，28℃培养 3 d
至长出菌落，在 YPD 平板上随机挑取 8 个克隆，扩
大培养后提取酵母基因组 DNA，以之为模板，PCR
鉴定目的基因是否整合到酵母染色体。
1.2.3 rhIL-1α 摇瓶规模表达 随机挑取 1 个鉴定正
确的菌种接种到 10 mL YPG 培养基 /50 mL 三角瓶中，
于 28℃、250 r/min 摇床培养 18-24 h，当 OD 值达
到 10 时，取 1 mL 菌液，接种到 100 mL BMGY 培养
基 /1 L 三角瓶中，于 28℃、280 r/min 继续培养 24 h 后，
加入终浓度为 1%（V/V）的甲醇进行诱导表达，培
养条件调整为 28℃、200 r/min。每 12 h 补加一次甲醇，
补加量为发酵液体积的 1%（V/V）。分别取诱导 24、
48、72、96、120、144、168h 的发酵液于 12 000 r/min
离心 15 min，取 1 mL 上清进行三氯乙酸（TCA）后，
进行 15%SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白表达。
1.2.4 rhIL-1α 摇瓶发酵规模条件优化
1.2.4.1 最佳体积和转速试验 毕赤酵母是好氧微
生物，溶解氧浓度对菌体的生长和产物的表达有很
大的影响，溶氧过低会抑制菌体生长，过高则会促
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9246
进菌体的新陈代谢加快，加速菌体死亡，造成蛋白
过早降解，不利于目的蛋白积累。转速调节是改变
发酵过程中溶解氧的重要方式，较高的转速会提高
氧的体积系数，增加发酵液中氧的供给，但同时会
加剧细胞的死亡速率，降低产物的表达量［11］。因
此，我们设计了以下正交实验研究在 1 L 摇瓶条件
下 rhIL-1α 诱导表达的最佳装液量和转速，参数设置
如下 ：体积设置 ：100 mL、200 mL、300 mL ；转速
设置 ：100 r/min、200 r/min、300 r/min。以上实验每
组设定 3 次重复，在诱导最佳时间进行取样，SDS-
PAGE 电泳检测蛋白表达情况，确定诱导表达的最
佳体积和转速。
1.2.4.2 最佳 pH 试验 酵母菌生长最适 pH 范围为
3.0-7.0，pH 过低会影响膜表面电荷的性质及膜的通
透性，过高则会抑制菌体中某些酶的活性［12］，通过
调节初始 pH 值来考察 pH 对 rhIL-1α 表达的影响。
本 研 究 设 定 pH 梯 度 为 ：4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。
每组设定 3 次重复。
1.2.4.3 最佳温度试验 一般而言，毕赤酵母的最
佳生长温度为 28-30℃，当温度升高到 32℃时毕
赤酵母菌株不能正常生长，温度对毕赤酵母发酵产
物的活性、发酵液的物理性质及合成方向等有重要
的影响。研究表明，在发酵过程中，诱导表达时
的温度低于菌体生长时的温度更加有利于蛋白的
表达［13］。为此本实验对 rhIL-1α 温度优化为 20℃、
23℃、26℃、29℃。
1.2.4.4 最佳甲醇浓度试验 在毕赤酵母诱导表达
过程中，甲醇作为诱导剂和碳源双重身份影响目的
蛋白的表达，过低或者过高均影响目的蛋白的表达，
因此合适的甲醇浓度是提高外源蛋白表达量的又一
个关键因素。文献报道［14，15］，甲醇添加量一般为
0.5%-1%。为了研究在 1 L 摇瓶条件下诱导表达的
最佳甲醇浓度，本实验设置了 0.25%、0.5%、0.75%、
1% 四个梯度。
1.2.5 rhIL-1α 的分离纯化 取诱导 4 d 的发酵液于
4℃，4 000 ×g 离心 30 min，收集上清进行 10 kD
超滤浓缩。取蛋白浓缩液进行 DEAE 弱阴离子交换
层析柱进行纯化。用 buffer A（10 mmol/L Na2HPO4
pH8.0）平衡柱子，样品以 1 mL/min 的流速流穿离
子交换树脂，然后用 buffer B（buffer A 中含有 0-500
mmol/L NaCl pH8.0）进行梯度洗脱，紫外检测仪监
控，收集各洗脱峰，SDS-PAGE 进行检测。
1.2.6 rhIL-1α 蛋白免疫印迹检测 蛋白免疫印迹按
Towbin 等方法［16］进行。rhIL-1α 进行 SDS-PAGE 后，
将 rhIL-1α 转移到 PVDF 膜上，用 IL-1α 兔多抗一抗
室温孵育 1 h，TBST 洗涤 3 次，再与辣根过氧化物
酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗室温孵育 1 h，TBST
洗 涤 3 次， 超 敏 ECL 底 物 发 光 显 色， 用 Typhoon
7500 扫描仪和图像定量软件进行定量分析。
1.2.7 考马斯亮蓝法（Bradford）测定蛋白浓度 以
纯的牛血清白蛋白作为标准品，取 0、0.1、0.2、0.4、
0.6、0.8 mL 标准品于 10 mL 试管中，加水至 1 mL，
然后加入 4 mL 的 G-250 溶液，混匀，静止 10 min，
在 595 nm 处测其吸光值制定标准曲线［17］。取样品
溶液 0.2 mL，做 3 个重复，以水作空白对照，测其
吸光值，并计算蛋白浓度。
1.2.8 rhIL-1α 的生物学活性检测 人肝癌细胞 7402
（Bel-7402）于含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基，
37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，取对数生长
期的细胞，于 3 000 个 / 孔接种至 96 孔板中培养 12 h，
待细胞贴壁后弃培养基，更换含有不同浓度 rhIL-1α
（0、5、10、15、20 ng/mL）的培养基，每组设 3 个
平行孔。继续培养 72 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT
溶液 10 μL，于培养箱中培养 4 h，弃掉培养基，每
孔加入 DMSO 150 μL，摇动培养板 5 min，使细胞内
结晶全部溶解，用 Biotek reader 酶标仪在 490 nm 处
测其吸收值，检测 rhIL-1α 对 Bel-7402 细胞增殖的
影响。
2 结果
2.1 重组质粒pPICZαA/hIL-1α的构建和鉴定
用碱裂解法提取 hIL-1α 质粒，并分别进行单双
酶切和 PCR 扩增，1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果（图
1）显示，重组质粒经 Sac Ⅰ单酶切后出现一条 5 kb
左右条带。BamH I 和 EcoR Ⅰ双酶切后出现 4 kb 和
500 bp 左右的 2 条带。用载体通用引物进行 PCR 扩
增出现一条 1 kb 左右的特异性扩增条带，与预期片
段大小一致，经上海生工生物公司测序证明其序列
正确。
2015,31(9) 247李斌等：重组人白细胞介素 -1α 在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测
2.2 rhIL-1α的表达与鉴定
重组表达质粒 pPICZαA/hIL-1α 转化毕赤酵母菌
X-33 后，在 YPD 平板上随机挑取 8 个克隆扩大培养，
提取基因组后进行 PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电
泳分析（图 2-A），8 个转化子在 1 000 bp 位置均出
现预期条带，证明 hIL-1α 基因已经整合到酵母基因
组中。对鉴定正确的重组菌株进行 1L 规模摇瓶筛选，
取不同时间表达上清进行 SDS-PAGE 检测和 Western
blot 鉴定，结果（图 2-B）显示，在相对分子质量约
17 kD 处出现考马斯染色条带，与 hIL-1α 的分子量
一致，且在甲醇诱导第 4 天表达量最高。经 Western
blot 鉴定（图 2-C），目的条带均有阳性反应，说明
rhIL-1α 正确表达。
2.3 rhIL-1α摇瓶条件的优化
2.3.1 培 养 基 体 积 和 转 速 对 rhIL-1α 的 影 响 取
X-33/pPICZαA/hIL-1α 菌株进行活化培养，当 OD600
值达到 10 时，将菌种分别接种于不同体积 BMGY
（100、200、300 mL）培养基中，于 28℃，280 r/min
摇 床 振 荡 培 养 至 OD600=2-6， 分 别 取 3 瓶 含 100、
200、300 mL 培 养 基 的 三 角 瓶 放 于 100 r/min 的 摇
床培养 ；剩余 6 瓶分别放于 200 r/min 和 300 r/min
摇床培养（表 1），每隔 12 h 添加甲醇至终浓度为
1%，诱导 4 d，取 1 mL 上清进行 TCA 处理后，SDS-
PAGE 电泳检测（图 3）发现，随着体积的增大，蛋
白表达量降低，当转速为 200 r/min 时，蛋白表达量
优于 100 r/min 和 300 r/min。rhIL-1α 发酵培养最佳
体积和转速为 100 mL/L，200 r/min。
2.3.2 pH 对 rhIL-1α表达的影响 分别取 1 mL 菌液， 接种到 pH 为 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 的 BMGY 培养
10000
kD
M 1 2 3 4
8000
3000
1000
500
250
M ：10000 Marker ；1 ：IL-1α/pPICZαA 的 PCR ；2 ：IL-1α/pPICZαA 的双酶切 ；
3 ：IL-1α/pPICZαA 的单酶切 ；4 ：IL-1α/pPICZαA 的质粒
图 1 rhIL-1α 三种不同表达载体质粒鉴定结果
3000
bp
MA 1 2 3 4 5 6 7 8
1000
500
116
kD MB 1 2 3 4 5 6 7X-33
18.4
14.4
ControlC 1 2X-33
（A）PCR 鉴定，M ：3000marker，1-8 ：随机挑取 8 个克隆 ；（B）SDS-PAGE，
M ：蛋 白 marker，X-33 ：空 载，1-7 ：24、48、72、96、120、144、168 h
rhIL-1α 表达量 ；（C）Western blot 鉴定，Control ：阳性对照（大鼠肝组织），
X-33 ：空载，1，2 ：rhIL-1α
图 2 rhIL-1α 鉴定结果
表 1 培养基体积和转速对 rhIL-1α 表达的影响
培养基量 /mL
转速 /（r·min-1）
100 200 300
100 1 2 3
200 4 5 6
300 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 98X-33
X-33 ：对照 ；1 ：培养基 100 mL，100 r/min ；2 ：100 mL，200 r/min ；3 ：100
mL，300 r/min ；4 ：200 mL，100 r/min ；5 ：200 mL，200 r/min，6 ：200 mL，
300 r/min，7：300 mL，100 r/min，8：300 mL，200 r/min，9：300 mL，300 r/min
图 3 培养基体积和转速对 rhIL-1α 表达的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.9248
基进行培养，SDS-PAGE 检测（图 4）表明，当 pH <
5.5 时，随着 pH 的降低，蛋白的表达量逐渐下降，
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5X-33
图 4 不同 pH 对 rhIL-1α 的影响
当 pH > 5.5 时，随着 pH 的增大，蛋白的表达量显
著降低，在 pH5.5 时，rhIL-1α 的表达量最高。
2.3.3 温度对 rhIL-1α 表达的影响 rhIL-1α 培养进
入诱导阶段时，培养温度分别更改为 20、23、26、
29℃，诱导 96 h 后，取发酵液进行 SDS-PAGE 检测，
20ć 23ć 26ć 29ćX-33
图 5 不同温度对 rhIL-1α 的表达影响
结果（图 5）表明，当温度为 29℃时，重组蛋白的
表达量最低，当温度为 26℃时，rhIL-1α 表达量最高。
2.3.4 甲醇浓度对 rhIL-1α 表达的影响 rhIL-1α 进
入诱导期后，在 26℃，200 r/min 下培养，甲醇浓度
分别设为 0.25%、0.5%、0.75%、1.0%，结果如图 6
所示，随着甲醇浓度的增加，重组蛋白的表达量随
着提高，当添加甲醇浓度为 1% 时，rhIL-1α 的产量
达到最高。
2.4 rhIL-1α的分离纯化
取诱导 4 d 发酵液，经过离心→ 10 kD 膜包浓
缩→ DEAE 弱阴离子交换层析方法。收集各洗脱峰，
0.25% 0.5% 0.75% 1%X-33
图 6 不同甲醇浓度对 rhIL-1α的影响
1 2 3 4 5 6 7
1 ：原液，2-7 ：不同盐梯度洗脱（0-500 mmol/L）
图 7 rhIL-1α 各步分离纯化 SDS-PAGE 分析
SDS-PAGE 检测发现，在 100 mm NaCl 处可以洗脱
下单一的目的蛋白（图 7）。蛋白纯度为 95%，经
Bradford 法测定，蛋白收率为 40% 左右。
2.5 rhIL-1α抑制人肝癌细胞7402的增殖
不同浓度的 rhIL-1α 处理 Bel-7402 细胞后，MTT
法 检 测 细 胞 的 活 力， 结 果 如 图 8 所 示，10 ng/mL
rhIL-1α 处理细胞 72 h 后，与对照比有显著的差异
（P<0.05），当 rhIL-1α 的浓度为 15、20 ng/mL 时，与
对照比有极显著差异（P<0.01）（图 8），表明 rhIL-
1α 对人肝癌细胞 7402 具有一定的杀伤力，能抑制
0
0 5 10
rhIL-1α/ng·mL-1 15 200.10.20.30.40.50.6OD
0.7
0.8
0.9
1.0
图 8 不同浓度 rhIL-1α 对 Bel-7402 细胞的影响
2015,31(9) 249李斌等：重组人白细胞介素 -1α 在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性检测
癌细胞的增殖生长。
3 讨论
IL-1α 作为重要的促炎性细胞因子参与多种生
理活动，如修复、增殖、凋亡、细胞迁移、分化、
细胞坏死等，在角膜受损研究中发现，IL-1α 参与
到 NF-κB 信号通路调控受损角膜的修复［18］。在非
小细胞肺癌的胸腔积液中 IL-1α 处于一个高表达水
平，它可作为潜在诊断非小细胞肺癌的生物标志
物［19，20］。 研 究 表 明， 当 人 永 生 化 角 质 形 成 细 胞
（HaCaT）受中波紫外线（UVB）照射时，细胞分泌
大量的 IL-1α，IL-1α 下调 HaCaT 细胞水通道蛋白 3
（AQP3）的表达，这一作用可能和皮肤光老化的发
生有关［21］。李树等［22］的研究发现，在小鼠皮肤受
损修复过程中，IL-1α 在受损早期有一次表达高峰，
IL-1α 可作为损伤早期时间推断的一个指标。因此，
IL-1α 在组织受损、肿瘤、自身免疫性疾病等方面具
有重要的潜在临床研究价值。
本实验选用毕赤酵母野生型 X-33 菌株，它具
有生命力强、无回复突变、分泌能力强、能在 YPD
和最小规模培养基中生长等优点［23］。根据酵母在
密码子上使用偏爱性，在不改变氨基酸序列的情况
下，通过调整终止序列、提高 GC 含量对 hIL-1α 序
列进行优化，把 hIL-1α 的成熟肽连在 α- 交配因子信
号肽的 C 端，AOX1 启动子诱导 hIL-1α 在毕赤酵母
中分泌表达。蛋白产量与发酵条件密切相关，为此，
本实验分别从装液量、转速、温度、pH、甲醇浓度
5 个方面对 rhIL-1α 的发酵条件进行优化。研究表
明，装液量和转速直接影响培养基中溶解氧的浓度，
在发酵过程中，溶解氧浓度对外源蛋白的表达具有
十分重要的影响，过高或过低都不利于蛋白的表
达［24，25］。实验结果显示，在装液量为 100 mL/1 L，
转速 200 r/min 时，蛋白表达量最高，过多的装液
量和过高的转速均不利于蛋白的表达。也有研究表
明，适当的升高温度，有利于细胞的生长代谢和蛋
白的表达，但温度过高会使菌体提早衰老，降低蛋
白的表达量［26］。本实验从 20-29℃对 rhIL-1α 的表
达进行研究发现，随着温度的升高，蛋白产量增加，
当温度> 26℃时，蛋白产量随着下降。因此，在诱
导阶段适当的降低温度可以减少菌体的死亡，同时
也可保护蛋白不被降解［27］。pH 是影响蛋白表达的
又一关键参数，适宜的 pH 不仅有利于蛋白的表达，
同时也可防止蛋白酶降解，易于后续的纯化工作。
结果表明，pH 为 5.5 时，最有利于 rhIL-1α 的表达。
在发酵过程中，定时定量地补加甲醇对蛋白的表达
具有至关重要的影响［14，25］。过低不够蛋白的表达，
过高则会导致菌体死亡，降低蛋白产量。本研究发
现，随着甲醇浓度的升高，蛋白产量随着增加，在 1%
时产量达到最多。
本研究用毕赤酵母表达 hIL-1α，仅用一步层析
纯化，获得纯度高达 95% 以上的重组蛋白。与原核
表达体系相比，减少了破壁、复性等复杂的纯化步
骤，提高蛋白的收率，降低了生产成本。对纯化后
的 rhIL-1α 进行活性检测发现，rhIL-1α 能抑制 Bel-
7402 细胞的增殖，与文献报道一致［21，28，29］。本研
究为深入探讨 IL-1α 功能机理提供了良好的条件，
同时也为其产业化生产奠定了坚实的基础。
4 结论
成功构建了 rhIL-1α 的毕赤酵母表达体系，对
其摇瓶发酵条件进行了优化，最适的发酵条件为装
液量为 100 mL/1 L 摇瓶、初始 pH 为 5.5、诱导转速
200 r/min，诱导温度为 26℃，甲醇添加量为 1%，每
12 h 补加一次，诱导 4 d，最终获得 rhIL-1α 的最高
产量约 30 mg/L，较优化前提高了 47.9%。用 DEAE
弱阴离子交换层析一步法对其进行纯化，得到纯度
高达 95%，得率约 40%，能抑制 Bel-7402 细胞增殖
的 rhIL-1α。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）