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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
近年来，抗生素耐药大肠杆菌的种类和数量越
来越多，并且具有抵抗多种抗生素的能力，如红霉素、
喹诺酮类和 β-内酰胺类抗生素［1，2］。大肠杆菌的抗
生素耐药机制非常复杂，主要包括阻碍细胞壁和核
酸合成、抑制蛋白质合成、破坏细胞膜结构等［3， 4］。
大肠杆菌外膜蛋白能保护细胞免受或减少多种有害
物质的影响，如抗生素、蛋白酶和毒素等［5］。大肠
杆菌外膜蛋白主要包括 OmpA、OmpC 和 OmpF 等，
在影响抗生素等有害物质的通透性方面发挥着至关
重要的作用。其中，OmpA 是研究的最为透彻的大
肠杆菌外膜蛋白［6］。
1998 年，Pautsch 和 Schulz［7］最早通过 X-射线
衍射技术确定了大肠杆菌 OmpA 的结构，并将研究
收稿日期 ：2012-08-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31100089），四川省教育厅项目（11ZB102），四川理工学院人才引进项目（2011RC12）
作者简介 ：赵志平，博士，讲师，研究方向 ：大肠杆菌耐药机制、光合细菌的综合开发和应用 ；E-mail ：zhipingzhao@suse.edu.cn
抗生素耐药性大肠杆菌外膜蛋白 mOmpA
N端序列分析
赵志平  聂鑫  李再新  丁杰  张智  谢万如
（四川理工学院化学与制药工程学院，自贡 643000）
摘 要 ： 从抗生素耐药大肠杆菌中克隆了 mOmpA（突变 OmpA）并构建表达载体 pET32a-mOmpA。序列比对分析表明，
mOmpA N 端与 OmpA N端DNA 序列同源性为 79.93%，氨基酸同源性为 81.17%。Swiss-Model 蛋白结构预测表明，mOmpA loop 环的
方向发生了显著变化。研究结果有助于进一步了解大肠杆菌 OmpA 的结构和功能以及大肠杆菌耐药机制。
关键词 ： 抗生素耐药 外膜蛋白 OmpA 大肠杆菌 突变
Sequence Analysis of Amino Terminus of mOmpA from Antibiotic
Resistant Escherichia coli
Zhao Zhiping Nie Xin Li Zaixin Ding Jie Zhang Zhi Xie Wanru
（School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Sichuan University of Science & Engineering，Zigong 643000）
Abstract:  In the present study, we amplified the mOmpA from an isolated antibiotic resistant E. coli strain and subsequently constructed
the expression vector pET32a-mOmpA. DNA sequence alignment analysis indicated that the amino terminus of the mOmpA shared 79.93%
homology with the OmpA. The mOmpA amino terminus was 81.17% identical to that of the OmpA. Protein structure predication analysis through
Swiss-Model suggested that the loops orientation of mOmpA N-termunus was dramatically changed compared with OmpA. Our present study
promotes to better understand the structure and functions of E. coli OmpA and E. coli antibiotic resistance mechanisms.
Key words:  Antibiotic resistance Outer membrane protein OmpA E. coli Mutation
结 论 发 表 在 Nature Structural Biology 杂 志 上。2001
年，Arora 等［8］利用核磁共振 NMR 技术研究了大肠
杆菌 OmpA 的结构，相关研究成果也发表在 Nature
Structural Biology 杂 志 上。 研 究 发 现， 大 肠 杆 菌
OmpA 外膜蛋白含有 325 个氨基酸残基，包括 N端
和 C端两个区域。其中，N端区域包含 171 个氨基酸
残基，包含 8 个以 β-折叠形势存在的跨膜片段［9］。
C端包含 129 个氨基酸残基，含有较多的 α-螺旋。N
端和 C 端通过富含 Ala-Pro 铰链序列相连［10］。
OmpA 最早在大肠杆菌 K12 中被发现，随后得
到广泛、深入的研究。OmpA 属于高丰度蛋白，每
个细胞中含有约 105 个拷贝［11］。OmpA 对外膜的结
构整合和外膜蛋白的装配、结构起着决定性作用［12］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期156
OmpA 可以作为抗菌素和细菌噬菌体受体、免疫靶
点，并且和大肠杆菌的吸附和侵入密切相关［13］，在
大肠杆菌接合转移和生物膜形成过程中都发挥着
重要作用［14］。OmpA N 端区域对于 OmpA 的装配、
结构功能发挥着重要的作用。目前，尚无有关于
OmpA N 端序列突变的研究报道。
本研究从抗生素耐药大肠肝菌中克隆 mOmpA
基因并构建表达载体 pET32a-mOmpA，旨在为进一
步了解大肠杆菌 OmpA 的结构功能及大肠杆菌耐药
机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 抗生素（氨苄青霉素、链霉素、
庆大霉素）耐药大肠杆菌、DH5α 和 pET-32a 载体为
本实验室保存。
1.1.2 主要试剂和限制性内切酶 Hind III、EcoR I
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、PCR 试剂等购自大
连宝生物公司。DL2000 plus Marker 为美科美（北京）
公司产品，高保真 Pfu DNA 聚合酶购自 Promega 公司，
质粒 DNA 抽提试剂盒和 DNA 过柱快速纯化试剂盒
购自 Omega 公司。
1.2 方法
1.2.1 抗生素耐药性大肠杆菌的分离 收集经病理
学鉴定为大肠杆菌致死的兔子，无菌解剖，从肠道、
肝脏及心脏中采集疑似菌染液，做倍比稀释。将稀
释液均匀涂布在 LB 培养基平板上，37℃倒置培养，
观察细菌的形态特征。挑取生长良好的单个菌落，
依次接种于伊红美蓝培养基平板和麦康凯培养基平
板上，37℃倒置培养，观察单个菌落的颜色、形态。
最后挑取符合大肠杆菌形态特征的单个菌落接种于
LB 液体培养基中，37℃培养 14-16 h 后，涂片、染色、
镜检，确认为纯培养物。
1.2.2 引物设计 根据 GenBank 报道的大肠杆菌
OmpA 基因序列（ID ：7437746）设计 mOmpA 引物。
mOmpA-F 引物序列为 ：5-GAATTCATGAAAAAGAC-
AGCTATCGCG-3（下划线为 EcoR I 限制性酶切位
点）。mOmpA-R 引物序列为 ：5-AAGCTTAGCCTGC-
GGCTGAGTTACAAC-3（下划线为 Hind III 限制性内
切酶位点）。
1.2.3 煮沸法提取革兰氏阴性细菌基因组 DNA 将
分离的抗生素耐药大肠杆菌菌株剧烈振荡过夜培养，
取 1 mL 菌液，离心弃上清 ；用 1 mL 灭菌超纯水漂
洗 2 次，离心弃上清。用 100 μL 灭菌超纯水重悬，
沸水煮 6 min，冰上放置 5 min。离心后将上清移入
一干净的 1.5 mL EP 管中，即为总 DNA，-20℃保存
备用。
1.2.4 mOmpA 的克隆 利用引物 mOmpA-F 和 mOm-
pA-R 从提取的基因组 DNA 中扩增 mOmpA。PCR 反
应体系为 ：10×Pfu buffer 5 μL，10 μmol/L mOmpA-F
引物 2 μL，10 μmol/L mOmpA-R 引物 2 μL，dNTP（各
10 mmol/L）1 μL，基因组 DNA 10 ng-1 μg，加灭菌
超 纯 水 至 50 μL。PCR 反 应 条 件 为 ：94 ℃ 5 min ；
94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 70 s，30 个循环。mOmpA
大小为 1 100 bp。
1.2.5 表达载体 pET32a-mOmpA 的构建 EcoR I 和
Hind III 酶切 mOmpA 片段 5 h，利用过柱纯化试剂盒
回收 ；pET-32a 经 EcoR I 和 Hind III 酶切后用同样
方法纯化。取 3.5 μL 双酶切的 mOmpA 片段与 1.5 μL
双酶切的 pET-32a 于 16℃连接过夜。连接产物加入
到 100 μL DH5α 感受态细胞中，冰水放置 30 min 后
42℃热激 90 s，冰水放置 2 min。加入 600 μL LB 培
养基后于 37℃孵育 1 h，取 100 μL 培养液涂布在 LB
固体培养基（Amp 50 μg/mL）上，37℃培养 14-16 h
后进行菌落 PCR 验证，PCR 引物为 mOmpA-F 和 T7
terminator。取阳性克隆进行扩大培养，提取质粒经
EcoR I 和 Hind III 酶切验证后寄送深圳华大基因测序。
1.2.6 mOmpA N 端序列分析 利用 DNAMAN 软件
对测序序列进行比对分析，利用 Swiss-Model 网站预
测分析 OmpA N 端蛋白质结构。
5000
bp
M OmpA
3000
2000
1000
750
250
100
500
图 1 mOmpA 基因片段的 PCR 扩增
2013年第3期 157赵志平等 ：抗生素耐药性大肠杆菌外膜蛋白 mOmpA N 端序列分析
步判断 PCR 扩增正确。
2.2 表达载体pET32a-mOmpA的构建
EcoR I-Hind III 双 酶 切 的 mOmpA 片 段 和 pET-
32a 连接转化后经 PCR 验证获得阳性克隆，如图 2
所示。从图 2 可以看出，以菌落 2 和 4 为模板扩增
得到了 1 100 bp 左右的明亮条带，100 bp 处条带为
引物二聚体。为进一步验证表达载体的正确性，经
培养后提取其质粒 DNA，EcoR I 和 Hind III 酶切后
得到 1 100 bp 左右的目标片段，如图 3 所示。
2.3 mOmpA N端DNA序列比对分析
菌落 PCR 和 EcoR I-Hind III 酶切验证正确的重
组质粒 DNA 经深圳华大基因测序。将其 N 端序列
与 OmpA N 端序列进行了比对分析，结果（图 4）显
示，mOmpA 与 OmpA N 端的同源性为 79.93%，发生
了较大程度的突变。mOmpA N 端长度是 542 bp，而
OmpA N 端长度为 512 bp，并且有两处发生明显突变，
分别增加了 15 bp。
2.4 mOmpA N端氨基酸序列比对分析
mOmpA N 端 DNA 序 列 翻 译 成 氨 基 酸 序 列 后
与 OmpA N 端序列进行了比对分析，结果如图 5 所
示。mOmpA 与 OmpA N 端 长 度 分 别 为 181 和 171
个氨基酸残基，同源性为 81.17%，有较多的氨基
酸残基发生了突变。OmpA N 端含有 8 个 β-折叠区
域，mOmpA 此区域有 7 个部位的氨基酸残基发生
了突变。其中，β1-折叠区域的 Thr30 和 Ala32 分别
被 Ala30 和 Gly32 所 取 代。β3-折 叠 区 域 的 Vla70、
β4-折叠区域的 Tyr93、β5-折叠区域的 Thr127 分别
5000
bp
M 1 2 3 4
3000
2000
1000
750
250
100
500
M ：DNA Marker ；1-4 ：编号为 1 号、2 号、3 号、4 号的菌落
图 2 表达载体的菌落 PCR 验证
5000
bp
M 1 2
3000
2000
1000
750
250
500
1，2 ：分别表示从 2 号和 4 号菌中提取的质粒 DNA 进行酶切
图 3 表达载体的酶切验证
2 结果
2.1 mOmpA的克隆
利用高保真 Pfu DNA 聚合酶从提取的抗生素耐
药大肠杆菌基因组 DNA 中扩增了 mOmpA 片段，凝
胶电泳得到了 1 100 bp 左右的明亮条带（图 1），初
被 Leu70、Phe93 和 Ser127 所 取 代。β6-折 叠 区 域
的 Asn135 和 Tyr150 分 别 被 Glu135 和 Trp150 所 取
代。OmpA N 端 含 有 4 个 loop（L） 环，mOmpA 的
L1 和 L3 处发生了明显变化，分别增加 5 个氨基酸
残 基， 它 们 分 别 是 L1 处 的 Gly43、Phe44、Tyr45、
Gly46 和 Asn47 ；L3 处 的 Tyr126、Asn127、Ser128、
Thr129 和 Gly130。OmpA N 端含有 3 个转角（Turn），
T1 和 T2 没有发生突变。T3 发生 3 处突变，Ile152、
Pro154 和 Glu155 分 别 被 Val152、Arg154 和 Asp155
所取代。mOmpA N 端氨基酸序列，尤其是 β-折叠、
Loop 环和 T 转角等重要区域氨基酸的突变对其空间
结构可能产生一定的影响。
2.5 mOmpA N端空间结构预测
鉴于 mOmpA 的 Loop 环和转角等重要区域发
生突变，为预测其空间结构是否发生变化，使用了
Swiss-Model 在线工具对其进行了蛋白质空间结构预
测，结果如图 6 所示。从图 6 可以看出 mOmpA 的
L1、L2、L3 和 L4 环的方向较 OmpA 都发生了明显
的变化。这些变化可能与 Loop 环部分氨基酸残基发
生突变有着密切关系。
3 讨论
OmpA 是研究膜蛋白结构的模式蛋白，其 N 端
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期158
OmpA
mOmpA
Consensu a t g a a a a a g a c a g c t a t c g c g a t t g c a g g g c a c t g g c t g g t t c g c t a c c g t a g
c g c a g g c c g c t c c g a a a g a t a a c a c c t g g t a c g g t g t a a a c t g g g t g g t c
a c c c t a a c a c t g g g c t g g t g c t t g g t g g t t a c c a g g t t a a c c c g t
a t g g t t g a a a t g g g t t a g a c t g g t g g c g t a t g c t a a a a g g c a g
c g t t g a a a c g g t g c t c a a a g c t c a g g g c g t t c a c t g a c c g c t a a a c t g g g t
t a c c c a t c a c t g a c g a c t g g a a t c t a c a c c g t c t g g g g g c a t g g t t g g c
g g c g a c c a a a c a a c
c a c g g c g t t t c c c g t t t g c t g g c g g g t g a g t g c t a c t c t g a
a t c g c t a c c c g t c t g g a a t a c c a g t g g a c a a c a t c g g g a c g c
g t t t g t a a c a c g a
c c a g t a c a g a c a c g g t t t c c a a c a a c a a t g g c c
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
55
55
110
110
150
150
205
220
260
275
315
330
370
385
410
440
465
495
513
543
图 4 mOmpA 和 OmpA N 端核苷酸序列比对分析
OmpA
mOmpA
Consensu mkk t a i a i a a l a gf a t v a qa a pkd n t wy g k l gws
q yhd t gf nn n gp t q l g a g a f g g y qv np y
gf e mgyd wl g r m yk g s v n g a k a q gv q l t a k l gy
g vs p v f a g g v e a t i a t r l e y qw n i g d a
i t dd l d i y t r l g g mvwr a d k n v h d t
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
OmpA
mOmpA
Consensu
37
37
69
74
106
111
138
148
171
181
图 5 OmpA 和 mOmpA N 端氨基酸序列比对分析
mOmpA OmpA
图 6 mOmpA 和 OmpA N 端蛋白结构预测
2013年第3期 159赵志平等 ：抗生素耐药性大肠杆菌外膜蛋白 mOmpA N 端序列分析
区域的 8 个 β-折叠区在其组装过程中发挥着重要的
作用［7，11］。mOmpA 的 5 个 β-折叠区发生了不同程
度的突变，但蛋白质空间结构预测显示 β-折叠区的
突变并未明显改变其空间构型。mOmpA 的 T3 转角
处发生了 3 处突变，这 3 处突变可能与 mOmpA 的
Loop 环的方向发生了显著变化有关。OmpA 在大肠
杆菌抵御抗生素等有毒物质过程中发挥着重要的作
用［5］，对其抵御胁迫条件同样具有重要的作用［15］。
OmpA N 端氨基酸的突变是否会影响其功能以及其
形成的膜孔通道还有待进一步试验验证。OmpA 在
致病性大肠杆菌进化和抗生素耐药过程中发挥着重
要作用。OmpA 是普遍存在于革兰氏阴性菌表面的
蛋白，在细菌生命活动中发挥着至关重要的作用，
它可以作为细菌的黏附素和侵袭素，参与生物膜的
形成，也可作为多种噬菌体的受体，是先天免疫系
统的重要靶位。因此，外膜蛋白的易突变性加大了
致病性大肠杆菌的防治，增加了外膜蛋白疫苗的研
制难度。
4 结论
本研究克隆了 mOmpA，序列分析表明 mOmpA
N 端 DNA 和氨基酸序列均发生了显著突变。Swiss-
Model 分析显示，mOmpA 的 N 端空间结构发生了一
定的变化，尤其是 Loop 环的方向发生了显著变化。
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（责任编辑 马鑫）