全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(５): ４５５￣４６０(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣０７ꎻ 修回日期: ２０１５￣０５￣２６
基金项目: 国家自然科学基金(３１１７１８３２)ꎻ农业部公益性行业科研专项(２０１００３０６７)
通讯作者: 邹华松ꎬ教授ꎬ主要从事植物病原细菌学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｈｓｚｏｕ＠ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 郭 静ꎬ女ꎬ江苏扬州人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物细菌病害的防治研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｇｊｙｅａｈ２０１２＠ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０５.００２
柑橘溃疡病菌外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７在
耐受铜杀菌剂中的功能
郭 静ꎬ 宋 雪ꎬ 邹丽芳ꎬ 陈功友ꎬ 邹华松∗
(上海交通大学农业与生物学院ꎬ上海 ２００２４０)
摘要:细菌性溃疡是柑橘上的一种重要细菌病害ꎬ施用含铜化学药剂是防治该病的主要措施ꎮ 本研究报道柑橘溃疡病菌外
膜蛋白 ＸＡＣ１３４７在铜化学药剂耐药性中的功能ꎮ 在平板抑菌试验中ꎬ４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂和 ３３％王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮
剂的的最大稀释倍数分别为 ２ ０００倍和 ２ ５００倍ꎬ相对应的有效成分氢氧化铜和王铜的浓度分别为 ０. ０２３％和 ０.０１３ ２％时ꎬ
柑橘溃疡病菌的生长受到抑制ꎮ 在 ２ ０００倍稀释浓度条件下ꎬ两种杀菌剂对外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７突变体的抑菌圈分别增加
了 １０倍和 ５倍ꎮ 接种柑橘植物后ꎬ突变体 ΔＸＡＣ１３４７中耐铜基因 ｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ基因的表达水平分别下降了 ３７％和 １５％ꎻ在
铜离子胁迫条件下ꎬｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ基因的表达水平分别下降了 ３３％和 ５１％ꎮ 在突变体中组成型表达 ＸＡＣ１３４７基因ꎬ均能部
分恢复突变体的表型ꎮ 这些结果表明ꎬ外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７对柑橘溃疡病菌耐受含铜杀菌剂有重要作用ꎮ
关键词:柑橘溃疡病菌ꎻ外膜蛋白ꎻ铜离子ꎻ杀菌剂ꎻ耐药性
Ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＡＣ１３４７ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｃｏｐｐｅｒ￣ｂａｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ　 ＧＵＯ Ｊｉｎｇꎬ ＳＯＮＧ Ｘｕｅꎬ ＺＯＵ Ｌｉ￣ｆａｎｇꎬ ＣＨＥＮ Ｇｏｎｇ￣
ｙｏｕꎬ ＺＯＵ Ｈｕａ￣ｓｏｎｇ　 (Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ ２００２４０ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｎｋｅｒꎬ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉꎬ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ
ｐｌａｎｔｓ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ￣ｂａｓｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｈｅｒｅ ｗｅ
ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＡＣ１３４７ ｗａｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ.
Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ ｐｌａｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ４６％ Ｃｕ(ＯＨ)２ ａｎｄ ３３％ ＳＣ􀅰
Ｃｕ(ＯＨ)２ ｗｅｒｅ ２ ０００ ａｎｄ ２ ５００ ｆｏｌｄｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｎ ｔｈｅ ２ ０００－ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅｓ ｏｆ ａ
ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ΔＸＡＣ１３４７ ｂｙ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ １０－ｆｏｌｄ ａｎｄ ５－ｆｏｌｄꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｗｈｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ
ｗｉｔｈ ｃｉｔｒｕｓ ｐｌａｎｔｓꎬ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｏｐＡ ａｎｄ ｃｏｐＢ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ΔＸＡＣ１３４７ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ３７％
ａｎｄ １５％ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｕｎｄｅｒ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｏｐＡ ａｎｄ ｃｏｐＢ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
３３％ ａｎｄ ５１％ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＸＡＣ１３４７ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｕｔａｎｔ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏ￣
ｔｙｐｅｓ. Ｏｕｒ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈａｔ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＸＡＣ１３４７ ｏｆ Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｃｏｐｐｅｒ￣ｂａｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉꎻ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｃｏｐｐｅｒ ｉｒｏｎꎻ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅꎻ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ
中图分类号: Ｓ４３６.６７　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０５￣０４５５￣０６
　 　 柑橘溃疡病是全世界柑橘生产中的主要病害 之一ꎬ在我国的一些柑橘产区如两广、湖南、福建等
　
植物病理学报 ４５卷
省发生较为严重ꎬ并被列为检疫对象[１]ꎮ 引起柑
橘溃疡的病原物是柑橘黄单胞细菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ)ꎬ以前在分类上归为地毯草黄单胞
柑橘致病变种 (Ｘ. ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉꎬＸａｃ) [２]ꎮ
借助血清学、噬菌体敏感性、ＲＦＬＰ 及寄主范围等
多种生物学特征ꎬ可以将 Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ 划分
为 ５个菌系ꎬ其中亚洲菌系和美洲菌系的流行较为
广泛ꎬ亚洲种是蔓延最为广泛、致病力最强的菌系ꎬ
可侵染绝大多数柑橘品种[３ꎬ４]ꎮ 我国柑橘产区的
病原菌都被鉴定为亚洲种[３]ꎮ 与大多植物病原菌
一样ꎬＸ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ 主要通过雨水传播ꎬ经由
寄主植物伤口、气孔等入侵并在植物体内大量繁
殖ꎬ形成特殊的隆起或油渍状斑点ꎬ染病部位后期
木栓化ꎬ造成落叶、枯梢ꎬ较轻时在叶片和果实上形
成病斑ꎬ发病严重时可引起落果ꎬ影响柑橘的品质
和产量[４~７]ꎮ
　 　 叶面喷洒含铜杀菌剂是柑橘溃疡病的主要防
治措施[８]ꎬ但这种措施对高抗和中抗柑橘品种有
效ꎬ而对低抗和易感品种而言ꎬ还需要结合其它多
种措施进行[１ꎬ９]ꎮ 商业化的杀菌剂铜铵合剂、噻啉
酮 ＳＣ 、硫酸铜钙ＷＰ、２０％乙酸铜等对溃疡病的防
治有很好的效果ꎬ能在一定程度上控制柑橘溃疡病
的发生[９]ꎮ 铜离子是细菌生长所需的微量元素ꎬ
但过量时却会对菌体产生毒害作用[１０]ꎮ 含铜杀菌
剂对溃疡病防治效果明显应该与病原菌的耐铜机
制有关ꎮ Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ 耐铜基因在不同菌株
间存在差异ꎬＢｅｈｌａｕ 等[１１] 报道了 Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ.
ｃｉｔｒｉ Ａ４４中有完整的耐铜基因簇ꎬ但在已测序的模
式菌株 ３０６[１２]和中国菌株 ２９￣１中耐铜基因簇是不
完整的ꎬ仅含有 ｃｏｐＡ 和 ｃｏｐＢ 基因ꎬ而且没有感应
铜离子信号的双组份调控系统 ｃｏｐＲ / ｃｏｐＳ[１３]ꎮ
　 　 细胞膜的磷脂双分子层结构是细胞与外界环
境的分界线ꎬ控制着向胞内运输营养物质、向胞外
运输代谢废物ꎬ而微生物与生存环境之间的物质交
换是生命活动的基础[１４]ꎮ 磷脂是形成细胞膜的骨
架ꎬ而结合到膜上的整合蛋白和周质蛋白决定了细
胞膜所具有的功能ꎬ而外膜蛋白是革兰氏阴性细菌
外膜的主要结构ꎬ约占所有组成部分的一半[１５]ꎮ
对外膜蛋白在细菌致病性的功能了解ꎬ主要集中在
动物病原细菌的研究上ꎬ如 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ
中的 Ｏｐａ 和 ＯｐｃＡ 蛋白[１６]ꎬ 以及 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ中的 ＰａｇＣ 蛋白[１７]ꎮ 植物病原细菌中
外膜蛋白的功能了解的很少ꎮ 柑橘溃疡病菌 Ｘ.
ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７ 对病原菌在寄
主植物上的发病有一定的作用ꎬ突变体在柑橘上不
能产生溃疡症状[１８]ꎬ但在细菌生存和适应性中的
功能还不清楚ꎮ 本研究以两种含铜杀菌剂为材料ꎬ
验证了柑橘溃疡病菌外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７在对含铜
杀菌剂的敏感性中的作用ꎬ研究了突变体中耐铜相
关基因的表达水平ꎬ为进一步认识外膜蛋白
ＸＡＣ１３４７的生物学功能提供了科学依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 菌株、质粒与培养条件
　 　 本研究所用柑橘黄单胞菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ
ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ野生型 Ｘａｃ ２９￣１ 菌株采自江西甜橙病
植株[１９]ꎻΔＸＡＣ１３４７ 是在 Ｘａｃ ２９￣１ 基础上构建的
ＸＡＣ１３４７编码基因缺失突变体ꎮ Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ.
ｃｉｔｒｉ在 ＮＢ液体或 ＮＡ固体培养基中 ２８℃培养ꎬ培
养基中使用的抗生素卡那霉素和庆大霉素浓度分
别为 ５０ μｇ􀅰ｍＬ－１和 ２５ μｇ􀅰ｍＬ－１ꎮ
１.２　 杀菌剂对柑橘黄单胞菌的抑菌效果测定
　 　 野生型 Ｘａｃ ２９￣１在 ＮＡ固体培养基上活化后ꎬ
转接 ＮＢ液体培养基 ２８℃震荡培养 ２４ ｈꎬ调节培养
液的浓度至 ＯＤ６００ ＝ ０. ３ꎮ 按菌悬液:培养基 ＝
１ ∶ １００的比例ꎬ与 ＮＡ培养基混合ꎬ制作含菌平板ꎮ
待平板凝固后ꎬ将灭菌的牛津杯置于平板中央ꎮ 选
用的杀菌剂为 ４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂(上海生农生
化制品有限公司)和 ３３％王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂
(意莎雷(上海)农用化学品技术咨询有限公司)ꎮ
将杀菌剂按 １６、８０、４００ 和 ２ ０００ 倍进行浓度梯度
稀释ꎬ得到终浓度为 ０.０６２ ５、０.０１２ ５、０.００２ ５ 和
０.０００ ５ ｇ􀅰ｍＬ－１的稀释药剂ꎮ 每个浓度梯度设置
３个平行重复ꎬ吸取 １００ μＬ 药剂稀释液加到牛津
杯中ꎬ２８℃培养 ２４~ ４８ ｈ 后ꎬ观察抑菌圈形成和大
小ꎬ测量抑菌圈的半径并拍照记录ꎮ
１.３　 ＸＡＣ１３４７基因的功能互补分析
　 　 根据 Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ 的基因组信息ꎬ设计
引物对 ５′￣ＴＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴ￣
ＡＣＧ￣３′ / ５′￣ＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＣＧ
ＡＴＧＣＣ￣３′和引物对 ５′￣ＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＣＡＴ￣
ＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧ￣３′ / ５′￣ＴＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣ￣
６５４
　
　 ５期 郭 静ꎬ等:柑橘溃疡病菌外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７在耐受铜杀菌剂中的功能
ＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣ￣３扩增柑橘溃疡病菌 ｗｘａｃＯ
基因 ５００ ｂｐ 启动子区域和 ＸＡＣ１３４７ 的全长编码
序列ꎬ先后克隆到 ｐＢＢＲ１ＭＣＳ￣５[１９] 的 Ｘｈｏ Ｉ 和
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切位点和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 和 Ｘｂａ Ｉ 酶切位点ꎮ
得到的重组质粒电转进入突变体 ΔＸＡＣ１３４７ꎬ获得
互补菌株 ＣΔＸＡＣ１３４７ꎮ
１.４　 突变体 ΔＸＡＣ１３４７对铜杀菌剂的敏感性测定
　 　 用野生型菌株 Ｘａｃ ２９￣１、突变体 ΔＸＡＣ１３４７ 和
互补菌株 ＣΔＸＡＣ１３４７ 的培养液制作含菌 ＮＡ 平
板ꎬ将牛津杯置于平板中间ꎮ 将两种铜杀菌剂分别
稀释 ２ ０００倍ꎬ取 １００ μＬ 药剂稀释液加到牛津杯
中ꎮ ２８℃培养 ２４~４８ ｈ 后ꎬ观察抑菌圈形成ꎬ测量
抑菌圈的半径并拍照记录ꎮ 每次试验中两种药剂
设置 ３个平行重复ꎮ 以野生型菌株为对照ꎬ计算抑
菌圈的变化率ꎮ 抑菌圈半径变化率％ ＝[(突变菌株
抑菌圈半径－野生型菌株抑菌圈半径) /野生菌株抑
菌圈半径]×１００％[２０]ꎮ 与野生型菌株相比ꎬ菌株在
平板上抑菌圈半径越大ꎬ抑菌圈变化率也越大ꎬ说明
对铜杀菌剂的耐受能力越小ꎮ 试验重复 ３次ꎮ
１.５　 荧光定量 ＰＣＲ
　 　 野生型菌株 Ｘａｃ ２９￣１、突变体 ΔＸＡＣ１３４７ 和互
补菌株 ＣΔＸＡＣ１３４７在液体培养基中培养 ２４ ｈꎬ并
分别收集菌体ꎮ 调节细菌的浓度至 ＯＤ６００ ＝ ０.３ꎬ用
无头注射器将菌液注射到葡萄柚 Ｄｕｎｃａｎ 新展开
叶表皮细胞内ꎮ ２４ ｈ 后ꎬ摘取接种叶片样品ꎬ用
Ｔｒｉｚｏｌ 试剂盒(ＴａＫａＲａ)提取细菌的总 ＲＮＡꎮ 同样
浓度的菌液ꎬ加入 ０.３ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ＣｕＳＯ４ꎬ在 ２８℃摇
床诱导培养 ４ ｈ 后ꎬ提取总 ＲＮＡꎮ 在分光光度计
上测定 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０值ꎬ检测总 ＲＮＡ 样品的质量ꎻ
同时取 １ μＬ 样品经琼脂糖凝胶快速电泳检测
ＲＮＡ的完整性ꎮ 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ 试剂盒
(ＴａＫａＲａ)去除总 ＲＮＡ 中残留的基因组 ＤＮＡꎬ进
行反转录ꎮ 在 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ｒｅａｌ － ｔｉｍｅ
ＰＣＲ仪上用 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ试剂盒进行荧光
定量 ＰＣＲꎬ对 ｃｏｐＡ (ＡＦ:ＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＧＣＡＡＴ￣
ＡＣＧＴＧＣＡＴＣＣꎬＡＲ:ＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＧ￣
ＡＣＡＡＴＣ) 和 ｃｏｐＢ 基因 ( ＢＦ: ＣＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧ￣
ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＧＧＣꎬ ＢＲ: ＴＣＡＴＧＴＧＣＧＣＣＡＴ￣
ＣＧＧＣＣＡＴＴＴＧＣ) 的表达水平进行检测ꎮ 选用
ｇｙｒＡ基因作为内参对照 ( ｒＡＦ:ＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡ
ＧＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧꎬ ｒＡＲ:ＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＣ￣
ＴＧＴＧＣＡＣＣＧＧ)ꎮ ＰＣＲ 的运行条件为: ９５℃ꎬ
３０ ｓꎻ ９５℃ꎬ５ ｓꎬ６０℃ꎬ３４ ｓꎬ４１ 个循环ꎮ 实验重复
３次ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 铜杀菌剂对柑橘黄单胞 Ｘａｃ ２９￣１的抑菌效果
　 　 在平板上检测铜杀菌剂对柑橘溃疡病菌
Ｘａｃ ２９￣１的抑菌效果ꎬ按 １６、８０、４００ 和 ２ ０００ 倍稀
释ꎬ使得终浓度分别为 ０.０６２ ５、０.０１２ ５、０.００２ ５ 和
０.０００ ５ ｇ􀅰ｍＬ－１ꎮ ４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂在各个浓
度梯度的抑菌圈半径分别为 １. ３８、０. ８８、０. ３２ 和
０.０７ ｃｍꎬ而 ３３％王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂的抑菌圈
半径分别为 ０.７７、０.７２、０.５３和 ０.１３ ｃｍꎮ 两种药剂
对 Ｘａｃ ２９￣１的抑制效果都比较明显ꎮ 在高浓度条
件下ꎬＣｕ (ＯＨ) ２散粒剂的抑菌效果好于王铜􀅰
Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂ꎬ在稀释 １６ 倍时王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２
悬浮剂的抑菌效果仅为 Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂的 ５６％ꎮ
而在低浓度条件下ꎬＣｕ(ＯＨ) ２散粒剂的抑菌效果
不及王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂ꎬ稀释 ２ ０００ 倍浓度
时ꎬＣｕ(ＯＨ)２散粒剂抑菌圈半径为 ０.０７ ｃｍꎬ仅为王
铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ)２悬浮剂的 ５０％(图 １)ꎮ 我们还将浓度
继续稀释至 ２ ５００ 倍ꎬＣｕ(ＯＨ)２散粒剂对 Ｘａｃ ２９￣１
完全没有抑制作用ꎬ王铜􀅰Ｃｕ (ＯＨ)２悬浮剂对
Ｘａｃ ２９￣１有微弱的抑菌作用ꎬ抑菌圈半径为０.０４ ｃｍꎬ
表明 ４６％ Ｃｕ(ＯＨ)２散粒剂和 ３３％王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ)２
悬浮剂抑制 Ｘａｃ ２９￣１的最大稀释倍数分别为 ２ ０００
和 ２ ５００倍ꎮ
２.２　 突变体 ΔＸＡＣ１３４７对含铜杀菌剂的敏感性增强
　 　 根据两种含铜杀菌剂对野生型柑橘黄单胞
Ｘａｃ ２９￣１的抑菌实验结果ꎬ选用 ２ ０００ 倍的稀释液
对突变体 ΔＸＡＣ１３４７敏感性测定ꎮ 与野生型相比ꎬ
ΔＸＡＣ１３４７突变体耐受 Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂和王铜􀅰
Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂的能力都下降ꎬ在平板上产生明
显扩大的抑菌圈ꎬ分别达到 ０.６８ ｃｍ和 ０.８５ ｃｍꎬ是
野生型对应抑菌圈半径的 １０ 倍与 ５ 倍ꎮ 王铜􀅰
Ｃｕ(ＯＨ) ２所产生的抑菌圈增加倍数虽小ꎬ但半径
还是大于 Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂产生的抑菌圈ꎮ 功能互
补菌株 ＣΔＸＡＣ１３４７ 部分恢复了突变体的耐受能
力ꎬ由 Ｃｕ(ＯＨ) ２散粒剂和王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２悬浮剂
形成的抑菌圈半径分别为 ０.４１ ｃｍ和 ０.４６ ｃｍꎮ 根
据抑菌圈变化率公式计算ꎬ突变体 ΔＸＡＣ１３４７的抑
７５４
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. １　 Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ ２９￣１ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ￣ｂａｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ
Ａ: ４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎻ Ｂ: ３３％ ＳＣ􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎻ Ｃ: Ｒａｄｉｕｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ. ■:４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎻ ■:３３％ ＳＣ􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２ .
Ｆｉｇ. ２　 Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ΔＸＡＣ１３４７ ｂｙ ２ ０００￣ｆｏｌｄ ｄｉｌｕｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ
Ａ: ４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎻ Ｂ: ３３％ ＳＣ􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎻ Ｃ: Ｒａｄｉｕｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ. ■:４６％ Ｃｕ(ＯＨ) ２ꎬ■:３３％ ＳＣ􀅰Ｃｕ(ＯＨ) ２ .
菌圈变化率分别为 １ ０３９％ 和 ３６４％ꎬ 互补菌
ＣΔＸＡＣ１３４７ 的抑菌圈变化率分别为 ５９４％ 和
１５５％ꎬ明显小于 ΔＸＡＣ１３４７的抑菌圈变化率ꎬ表明
互补菌部分恢复了突变体的功能(图 ２)ꎮ
２.３　 突变体 ΔＸＡＣ１３４７中耐铜相关基因的表达水
平下降
　 　 在柑橘黄单胞菌株 Ｘａｃ ２９￣１ 的基因组中ꎬ与
耐铜机制相关的基因为 ｃｏｐＡ 和 ｃｏｐＢꎬ二者在染色
体上紧密相连ꎮ 其序列与另外两个菌株 Ｘａｃ ３０６
和 Ｘａｃ ＡＷ相应基因的完全一致ꎬ但 Ｘａｃ Ａ４４ 菌株
中报道含有完整的耐铜基因簇(图 ３￣Ａ)ꎮ 为了解
在与寄主互作过程中ꎬ外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７ 与耐铜
基因表达之间的关系ꎬ运用 Ｑ￣ＲＴ ＰＣＲ定量检测突
变体 ΔＸＡＣ１３４７中 ｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ基因的表达ꎬ结果
显示:接种柑橘寄主植物后ꎬＸＡＣ１３４７ 基因缺失突
变体中耐铜相关基因 ｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ的表达量下降ꎬ
分别为野生菌株的 ６３％和 ８５％ꎮ 组成型表达
ＸＡＣ１３４７编码基因的互补菌 ＣΔＸＡＣ１３４７ 中ꎬ两个
基因的表达量得到恢复ꎬｃｏｐＡ 的表达水平恢复到
野生型的 ８５％ꎬ而 ｃｏｐＢ 基因的表达水平为野生型
的 １５９％ (图 ３￣Ｂ)ꎮ 在 ０.３ ｍｍｏｌ􀅰ｍＬ－１铜离子胁
迫条件下ꎬΔＸＡＣ１３４７突变体中 ｃｏｐＡ 和 ｃｏｐＢ 的表
达水平分别比野生型下降了 ３３％和 ５１％ꎬ互补菌
中 ｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ 的表达水平恢复到野生型的 ７８％
和 ７３％(图 ３￣Ｃ)ꎮ
３　 讨论
　 　 柑橘黄单胞菌 Ｘａｃ ２９￣１是采自我国江西甜橙
上的柑橘溃疡病菌株ꎬ根据含有 ｔａｌ 基因的数量及
大小ꎬ划分为 ４Ｅ 类型[１９]ꎮ 目前ꎬ本实验室测定了
Ｘａｃ ２９￣１菌株的全基因组序列ꎬ明确了 ｔａｌ 基因的
序列和遗传位置ꎮ 在构建以 Ｘａｃ ２９￣１和 Ｘａｃ ３０６为
出发菌的 Ｔｎ５ 随机插入突变体库工作中ꎬ均获得
了外膜蛋白ＸＡＣ１３４７插入突变体ꎬ这些突变体
８５４
　
　 ５期 郭 静ꎬ等:柑橘溃疡病菌外膜蛋白 ＸＡＣ１３４７在耐受铜杀菌剂中的功能
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｕｔａｎｔ ΔＸＡＣ１３４７
Ａ:Ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ ２９￣１ꎻ Ｂ:Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ΔＸＡＣ１３４７ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎻ ■:Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ Ｘａｃ ２９￣１ꎻ ■:ΔＸＡＣ１３４７ꎻ ■:ＣΔＸＡＣ１３４７ꎻ
Ｃ: Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ΔＸＡＣ１３４７ ｕｎｄｅｒ ｃｏｐｐｅｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ.
都丧失了在寄主植物上的致病性[１８]ꎮ ＸＡＣ１３４７
是位于细胞膜上的外膜蛋白ꎬ对维持细胞结构和细
胞膜的选择透过性有重要作用ꎮ 本研究报道
ＸＡＣ１３４７ 突变体对铜离子的敏感性增强ꎬ推测
ＸＡＣ１３４７可能参与耐铜相关基因的调控ꎮ
　 　 用杀菌剂 Ｃｕ(ＯＨ)２散粒剂和王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ)２
悬浮剂可以有效抑制柑橘黄单胞 Ｘａｃ ２９￣１ 菌株ꎮ
平板对峙实验表明ꎬ２ ０００ 和 ２ ５００ 倍是两种铜杀
菌剂的有效稀释倍数ꎬ可以抑制柑橘黄单胞菌的生
长ꎬ这与产品推荐的田间使用浓度 １ ５００ ~ ２ ０００倍
相一致ꎮ Ｙａｏ 等[２０]对国内 ２４ 种杀菌剂做了系统
的室内毒力测定和田间试验ꎬ认为含铜离子的杀菌
剂噻霉铜的抑菌效果较好ꎬ在田间的防效可达
７７％ꎮ 在田间的试验中ꎬ２０％乙酸铜、５３.８％氢氧化
铜、２０％噻菌铜和 ２０％松脂酸铜的防治效果都可以
达到 ７０％以上[８ꎬ２０]ꎮ 这些结果表明ꎬ中国柑橘黄单
胞菌对含铜杀菌剂的敏感性具有普遍性ꎮ
　 　 本研究中用 Ｃｕ(ＯＨ)２散粒剂和王铜􀅰Ｃｕ(ＯＨ)２
悬浮剂进行平板抑菌试验ꎬ突变体 ΔＸＡＣ１３４７ 的敏
感性增强ꎬ抑菌圈半径显著增加ꎮ ＸＡＣ１３４７ 是一
个仅有 １１４个氨基酸的小蛋白ꎬ但含有 ４９ 个丙氨
酸ꎬ约占全部氨基酸的 ４３.３％ꎮ 大多数丙氨酸形成
２ 个或 ３个重复排列ꎬ总共存在 ６个－ＡＡＡ－和 ９个
－ＡＡ－重复ꎬ这些重复结构可能形成与铜离子结合
的结构域ꎬ感知外界铜离子信号ꎬ启动细菌内部的
耐铜机制ꎮ 在突变体 ΔＸＡＣ１３４７中ꎬ细胞失去了感
知外界铜离子信号的能力ꎬ耐铜相关基因 ｃｏｐＡ 和
ｃｏｐＢ表达量下降ꎬ导致细菌的耐铜能力下降ꎮ
　 　 根据 ｔａｌ基因大小和数目ꎬ可以将中国柑橘黄
单胞菌划分为 １４种类型[１９]ꎬ但还不清楚中国菌株
在耐铜基因的遗传进化上有无区别ꎮ 在测序的中
国菌株 Ｘａｃ ２９￣１中ꎬ以序列同源性分析仅得到 ２个
与耐铜有关的基因 ｃｏｐＡ 和 ｃｏｐＢ[２１]ꎬ与另外已经测
序的 Ｘａｃ ３０６和 Ｘａｃ ＡＷ菌株一致ꎬ并且都不含有感
受铜离子信号的双组分调控系统 ｃｏｐＲ / ｃｏｐＳꎮ
Ｂｅｈｌａｕ等[１１]在 Ｘ. ｃｉｔｒｉ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｉ Ａ４４中发现有完
整的耐铜基因簇ꎬ说明柑橘黄单胞的耐铜机制有遗
传变异现象ꎮ 采自江西赣洲柑橘上的柑橘黄单胞
ｃｏｐＡ和 ｃｏｐＢ基因与 Ｘａｃ ３０６ 的有 １ ~ ２ 个核苷酸
碱基差异ꎬ但所翻译的氨基酸序列没有变化[２１]ꎮ
柑橘黄单胞中国菌株是否存在完整的耐铜基因簇
还有待进一步研究ꎮ
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责任编辑:李晖
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