全 文 ：·综述与专论· 2014年第4期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
1 致病性弧菌及其所致疾病
近年来，随着鱼类养殖规模的不断扩大，鱼类
病害频繁发生，对鱼类规模化养殖和发展造成了巨
大的威胁，海水养殖鱼类尤以弧菌病较为严重，已
成为人们研究关注的焦点。弧菌为一类革兰氏阴
性、兼性需氧的杆菌和弯曲杆菌，是水产养殖环境
中常见的条件致病菌，弧菌病的暴发可导致养殖鱼
虾贝类大量死亡［1］。弧菌属共包括 46 个种类，其
中 12 种与人类感染相关，超过 27 种与鱼类和贝类
感染有关［2］。国内外学者调查发现弧菌病的发生
收稿日期 ： 2013-08-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31001136）
作者简介 ：陆盼盼，女，硕士研究生，研究方向 ：水产动植物病害防治 ；E-mail ：993814556@qq.com
通讯作者 ：郭松林，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：水产病原微生物学与免疫学 ；E-mail ：gsl@jmu.edu.cn
致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展
陆盼盼  郭松林  关瑞章  冯建军
（集美大学水产学院，厦门 361021）
摘 要 ： 弧菌为水产养殖环境中常见的条件致病菌，其暴发可导致养殖鱼虾贝类大量死亡。由于常用的化学药物防治方法
存在耐药性、药物残留等问题使得弧菌病的防治面临新的挑战，因而如何获得安全有效的防治方法成为弧菌所致疾病研究的重点
和难点。弧菌为革兰氏阴性菌，外膜是该类型菌细胞壁特有的结构，由蛋白、糖和脂质构成。其中外膜蛋白易为宿主免疫系统识
别为异物，可以激发机体的体液免疫和细胞免疫，有可能作为弧菌疫苗的有效成分。对弧菌外膜蛋白免疫原性的研究进展作一综述，
以期为弧菌病的防治在外膜蛋白水平上提供一种有效的解决途径。
关键词 ： 弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保护作用 交叉免疫保护作用
Review on the Immunogenicity of Pathogenic Vibrio Outer
Membrane Proteins
Lu Panpan Guo Songlin Guan Ruizhang Feng Jianjun
（Fishery College，Jimei University，Xiamen 361021）
Abstract:  Vibrio is a common opportunistic pathogen in aquaculture environment, which can lead to an outbreak of mass mortality of fish
and shellfish farming. Traditional chemical control methods because of drug resistance, drug residues and other issues make Vibriosis prevention
face new challenges, and thus how to get safe and effective prevention and treatment of diseases caused by Vibrio becomes important and difficult.
Vibrio is Gram-negative bacteria, the outer membrane is unique to the cell wall of this type of bacteria, which consist of protein, sugar and lipid.
The outer membrane protein is easy to be recongnized as foreign by the host immune system then stimulate the humoral and cellular immunity,
which may be used as an active ingredient of Vibrio vaccines. A review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein is to
provide a new solution for the prevention and treatment of Vibriosis.
Key words:  Vibrio Outer membrane proteins Immunogenicity Immuno-protection Cross immuno-protection
既没有宿主种属选择性和地理差异性，亦无季节性
和时间的区分，夏秋两季较多发，流行适宜温度为
25-32℃。引发弧菌病的病原性弧菌最早从欧洲鳗
鲡中分离获得，迄今为止报道的水产养殖动物致病
性弧菌有数十种之多（表 1）。感染弧菌病的水产动
物主要有皮肤溃疡、烂尾、烂鳍及出血等症状，从
而引发动物对外界反应迟钝以及摄食率下降等。国
内外已经报道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌（V.
parahaemolyticus）、 鳗 弧 菌（V. anguillarum）、 溶 藻
弧 菌（V. alginolyticus）、 哈 维 氏 弧 菌（V. harveyi）、
2014年第4期 31陆盼盼等 ：致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展
创伤弧菌（V. vulnificus）、拟态弧菌（V. mimi cus）、
产气弧菌（V. gazogenes）和河弧菌（V. f luvialis）等［3］。
弧菌病常采用化学药物消毒预防和抗生素治疗，但
近年来长期滥用抗菌素不仅造成严重的环境污染和
药物残留问题，而且使得致病性弧菌对药物的耐药
性不断增强，产生了许多新的耐药菌株，传统药物
的治疗效果越来越差，使得弧菌病的防治面临着新
的挑战［1］。因此，如何获得安全有效的防治方法成
为该研究领域的重点和难点。
表 1 水产动物主要致病性弧菌及其宿主
致病菌 感染对象 流行区域
创伤弧菌 鳗鲡、对虾、鱼类 西班牙、亚洲
溶藻弧菌 对虾、海水鱼类、文蛤 世界范围
副溶血弧菌 对虾、海水鱼类、文蛤 世界范围
哈维氏弧菌 鲈鱼、大黄鱼 亚洲
鳗弧菌 对虾、鱼类 世界范围
河弧菌 鲤科鱼类、牙鲆 中国
鱼肠道弧菌 牙鲆 日本
2 外膜蛋白的基本特征和弧菌主要外膜蛋白
革兰氏阴性细菌的外膜是细胞壁的主要结构，
在细菌与宿主的相互关系中发挥着重要作用，外膜
具有典型的非对称性磷脂双层结构，位于菌体胞浆
膜和肽聚糖的外侧，将整个细菌包围，膜厚度约 8-10
nm，由蛋白、糖和脂质构成［4］。外膜蛋白（Outer
membrane proteins，OMPs）位于细胞壁表层，是革
兰氏阴性菌特有的外膜主要结构成分，在维持细菌
细胞结构稳定、细胞的物质交换及细菌的致病过程
中起着十分重要的作用，并且易为宿主免疫系统识
别为异物，不仅可以激发机体的体液免疫应答，而
且还可引起细胞免疫且副作用较小，有可能作为疫
苗的有效成分［5-8］。Chart 等［9］从鳗弧菌中分离出的
2 个小分子量的外膜蛋白，能够有效地刺激机体的
免疫反应。
OMPs 是重要的黏附因子，宿主的免疫防御系
统能很容易识别这些外来物质［10］。OMPs 具有高度
疏水结构可维持结合反应，在宿主感染和致病性中
起重要作用，同时 OMPs 可粘附于黏膜上，与肝脏
相关的淋巴组织抗原递呈细胞可很容易地将其作为
抗原递呈给免疫细胞［11］。通过 NCBI 对弧菌外膜蛋
白基因搜索可发现弧菌的外膜蛋白主要有 OmpK、
OmpU、OmpW 及 TolC，比对分析表明这些外膜蛋
白在不同弧菌间的保守性均较高。
氨基酸序列比对结果表明，外膜蛋白 OmpU、
OmpW 和 OmpK 在 副 溶 血 弧 菌、 溶 藻 弧 菌、 霍 乱
弧菌及创伤弧菌中有高度相似性，表明这些蛋白有
相似的生物功能［12］。OmpU 是重要的膜孔蛋白之
一，也是疫苗开发的重要保护性抗原，由 OmpU 基
因编码，分子量为 38 kD，是一种孔通道蛋白，可
作为亲水性和低分子量物质输入输出的通道 ；OmpU
占外膜蛋白总量的 30% 左右，研究证明，外膜蛋
白 OmpU 是霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的重要保护
性抗原之一［13-16］。富含 β-转角结构的外膜蛋白 W
（OmpW），成熟蛋白分子量为 21 kD，该蛋白的表
达依赖体外环境，可能与压力条件下的适应机制有
关［17，18］。外膜蛋白 K（OmpK）为弧菌属的广泛受
体，属于 TSX 孔蛋白家族，富含 β 折叠结构，形成
狭长的疏水离子通道，该蛋白与调节细胞渗透压功
能有关［2］。
3 弧菌外膜蛋白免疫原性研究
外膜蛋白位于病原菌表面，多数外膜蛋白具有
良好的免疫原性，容易被宿主免疫防御系统识别为
异物，从而通过一系列连锁反应引发机体的体液免
疫与细胞免疫。目前已有大量关于弧菌外膜蛋白免
疫原性研究的报道，获得外膜蛋白主要有分离纯化
和重组表达两种方法。
3.1 弧菌外膜蛋白的分离纯化及其免疫原性
目前用于分离获得外膜蛋白的方法主要有十二
烷基磺酸钠 SDS、Sarkosy Ⅰ和苯甲基磺酰氟 PMSF
法。其中 PMSF 分离获得的蛋白条带多且密集，难
以区分主要外膜蛋白 ；Sarkosy Ⅰ操作方法简便且能
达到与 SDS 法相似的效果［19］。研究表明，无论是粗
提的外膜蛋白混合物 OMPs 还是进一步分离获得的
单一外膜蛋白成分均具有良好的免疫原性［20］，并且
某些弧菌外膜蛋白能对相应弧菌病原菌的感染提供
65%-100% 的免疫保护率（表 2）。这些研究为开发
以弧菌外膜蛋白作为主要抗原的弧菌疫苗奠定了良
好的基础，但分离纯化法一次获得的外膜蛋白量少
并且操作过程复杂，因而广泛应用于生产实践还有
一定的困难。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期32
表 2 分离纯化的弧菌 OMPs 免疫原性分析
免疫原性
分离纯化的弧菌
创伤弧菌
OMP 免疫刺激复合物［21］
哈维氏弧菌
OmpC［22］
溶藻弧菌
OMP 混合物［23］
鱼肠道弧菌
OMP 混合物［24］
溶藻弧菌
OmpU［25］
种类 欧洲鳗鲡 卵形鲳 凡纳滨对虾 牙鲆 红鳍笛鲷
规格 17g/ 尾 42-50 g 8-10 cm 15-18 cm 50 g
免疫途径 腹腔注射 腹腔注射 肌肉注射 肌肉注射 肌肉注射
剂量 40 μg/ 尾 25 μg/ 尾 50-150 μg/ 尾 40 μg/ 尾 0.1 mL
抗体水平 在第 21 天和 28 天检测到
特异抗体
第 7 天检测到抗体，第 21 天
达到最高
24 h 时达到最高 — 1-10 周
攻毒 2.0×105 CFU/mL 3.8×105 CFU/mL 1.24×107 CFU/mL 2.0×109 CFU/mL 1×107 CFU/mL
保护率 70%-100% 75% 65%-71% 84.6% 96.43%
其它 OmP 免疫刺激复合物免疫
保护率高于单独 OmP
OmpC-LPS 偶联物的免疫保护
率高于单独溶藻弧菌 OmpC
— 鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对
鱼肠道弧菌，鳗弧菌溶藻弧
菌均有免疫保护作用
—
3.2 弧菌外膜蛋白的重组表达及其免疫原性
随着基因组学、蛋白质组学以及生物信息学等
学科的迅速发展，越来越多的弧菌 OMPs 基因序列
测序工作得以完成。根据 NCBI 数据库获得所需外
膜蛋白基因序列设计特异性引物扩增出目标基因，
构建合适的载体进行重组表达，从而在一定程度上
提高了外膜蛋白疫苗抗原筛选的进度。这类基因工
程疫苗生产成本低，易于规模化生产。目前，已有
来源于副溶血弧菌［26，27］、哈维氏弧菌［28，29］、溶藻
弧菌［30］等弧菌的 OMPs 得以成功重组表达与纯化，
并且分别在鱼体中进行了免疫接种试验。结果显示，
这些重组 OMPs 保持了天然 OMPs 的免疫原性和免
疫保护作用，能有效刺激鱼体产生特异性抗体，并
且能对相应病原菌的感染提供 67.6%-90% 不等的免
疫保护率（表 3）。
3.3 弧菌OMPs多联疫苗的免疫原性
细菌脂多糖、外膜蛋白偶联疫苗是 20 世纪 80
年代发展起来的新型疫苗。李华等［22］制备了哈氏
弧菌外膜蛋白与溶藻弧菌脂多糖偶联疫苗，结果表
明免疫卵形鲳（Trachinotus ovatus）后，脂多糖偶联
外膜蛋白免疫原性显著增强，对哈氏弧菌的免疫保
护率为 95%，高于单独 0MPC 免疫组的 75% 保护率。
基因工程技术的迅速发展使得渔用疫苗的开发周期
和成本大幅度缩短和降低，并且利用生物技术构建
的重组 OMP 疫苗也颇具应用前景。值得一提的是，
郑磊等［31］利用副溶血弧菌外膜蛋白 K（OmpK）和
鞭毛蛋白 A 基因（flaA）构建融合表达载体，重组
表达的融合蛋白（r-FlaA-OmpK）免疫美洲黑石斑鱼，
与单一的重组蛋白（r-OmpK）相比，能够刺激机体
产生更高水平的抗体效价和免疫保护作用。副溶血
弧菌 tdh2 基因和鳗弧菌 OmpU 基因二联疫苗免疫大
菱鲆可对副溶血弧菌和鳗弧菌感染分别提供 100%
和 35% 的免疫保护率［32］。
3.4 弧菌外膜蛋白共同抗原的免疫原性
弧菌病的暴发给水产养殖业造成了严重损失。
水生动物尤其是鱼类弧菌病的发生常常是多种（血
清型或亚种）弧菌的混合感染，因此筛选具有潜在
的交叉保护性蛋白抗原，作为制备多价疫苗或联合
疫苗的侯选成分具有重要意义。研究发现，革兰氏
阴性菌的外膜蛋白中存在保守成分，同种细菌不同
菌株的外膜蛋白图谱很相似，仅有很小的差异，这
些差异与菌株的血清型、致病性及生长条件有关［33］。
张崇文等［34］利用双向电泳和免疫印迹相结合的方
法，借助于质谱分析技术发现，溶藻弧菌的 一种
功 能 未 知 的 孔 蛋 白（Porin，GenBank Accession No.
ZP_01260407）和副溶血弧菌的一种麦芽糖孔蛋白的
前 体 蛋 白（Maltoporin precursor，GenBank Accession
No. NP_801154）能够和哈维氏弧菌全菌多抗产生免
疫反应，表明这两种蛋白可以作为此 3 种弧菌的交
叉保护性抗原。根据 SDS-PAGE 图谱及免疫印迹发
现，来源于 8 株弧菌的 36 kD 外膜蛋白均能与兔抗
SR1 菌株的血清发生免疫反应，证明 36 kD 的外膜
2014年第4期 33陆盼盼等 ：致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展
蛋白可能是弧菌共有的特异性抗原［4］。田丁等［35］
研究发现 38 kD 为溶藻弧菌与创伤弧菌共有的外膜
蛋白，为探讨研制两者的外膜蛋白亚单位联合疫苗、
达到一种疫苗有效防治 2 种疾病的目的提供了可能
性［35］。另外，研究发现 28 kD 的 OMP 是鳗弧菌（V.
anguillarum）和副溶血弧菌的共同抗原［36］，但该
外膜蛋白对这两种弧菌的免疫防治效果尚未见研究
报道。
3.5 弧菌OMPs口服疫苗的尝试
相比于注射免疫及浸泡免疫，口服免疫具有高
效性，操作方便，避免对鱼体造成损伤，并能同时
引起黏膜免疫应答及系统免疫应答等诸多优点［37］。
自 1942 年 Duff［38］首次将杀鲑气单胞菌灭活口服疫
苗应用于硬头鳟获得成功后，国内外不少学者对鱼
类肠道黏膜免疫机制的研究不断深入，鱼类口服疫
苗的研究取得了一定的进展。
任燕等［39］采用可生物降解的合成高分子聚 DL-
乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-co-polyethylene
glycol，PELA）， 包 裹 哈 维 氏 弧 菌 重 组 外 膜 蛋 白
OmpK 后，制备成 PELA-OmpK 微球口服免疫鲫鱼
（Carassius auratus gibelio）。结果表明，加强免疫 4
周和 8 周后微球疫苗免疫组可对活菌攻击提供 70%
的免疫保护率，显著高于口服 OmpK 蛋白组和空白
对照组。
4 展望
分离纯化和重组表达获得的弧菌外膜蛋白均具
有良好的免疫原性，相对于分离纯化法，重组表达
操作过程简单，单次获得量多。不同种弧菌间的共
同外膜蛋白的筛选可有望解决针对单一致病性弧菌
研制疫苗时存在的周期长、免疫次数多的弊端，因
而极有可能成为有效的弧菌亚单位疫苗抗原成分。
随着生物技术在鱼用疫苗开发中的应用，弧菌 OMPs
多联疫苗的构建使得外膜蛋白的免疫保护性显著增
强并可实现单次免疫同时抵抗多种弧菌感染的效果。
然而，国内外将不同属病原菌外膜蛋白构建融合表
达载体制备二联疫苗的研究十分少见。本实验室课
题组成员已成功制备迟缓爱德华氏菌 OmpS2 与嗜水
气单胞菌Ⅱ型孔蛋白二联疫苗，免疫美洲鳗鲡后可
提供较高的免疫保护性［40］。在此基础上进行弧菌属
与其他种属细菌二联外膜蛋白的研究，以期能达到
单次免疫防治多种细菌感染的目标。另外值得一提
的是，以弧菌 OMPs 进行免疫保护研究时，常用的
注射方法虽然用量小、效果好但易造成伤口感染且
工作量大，免疫途径有待优化，可尝试口服免疫。
参 考 文 献
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表 3 弧菌重组 OMPs 免疫原性分析
重组弧菌 OMPs
免疫原性
副溶血弧菌铁调外膜蛋白 psuA、
pvuA 混合物［26］
哈维氏弧菌 OmpU［28］ 溶藻弧菌 OmpW［30］
副溶血弧菌 OmpK OmpU OmpW
OmpV TolC［27］
质粒 pET30a（+） pET30a（+） pET30a（+） pET30a（+）
外膜蛋白大小 77.94-80.77 kD 41 kD 23.3 kD 27-47 kD 不等
种类 大黄鱼 大黄鱼 大黄鱼 大黄鱼
鱼规格 平均 150 g/ 尾 平均 50 g/ 尾 平均 50 g/ 尾 平均 150 g/ 尾
免疫途径 腹腔注射 腹腔注射 腹腔注射 腹腔注射
免疫剂量 100 μg/ 尾 100 μg/ 尾 200 μg/ 尾 100 μg/ 尾
抗体水平
感染后存活鱼血液检测到特异性
抗体
4-8 周内特异性抗体效价持
续升高，达到 log28.0 以上
3-7 周较高抗体水平
第 28天-第56 天均能检测到相
应特异性抗体
攻毒 1.0×108 CFU/mL 注射感染 1.0×108 CFU/mL 腹腔注射
1.0×109 CFU/mL
腹腔注射
2.0×107 CFU/ 尾腹腔注射
相对免疫保护率 80% 67.6% 78% 80%-90%
其它 OMPs 混合物免疫组提供的免疫保
护率稍低于全菌苗免疫组的 90%
— — 各 OMPs 提供的免疫保护率与
灭活菌苗相比没有显著差异
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期34
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（责任编辑 狄艳红）