全 文 ：·综述与专论· 2014年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
牦牛（Bos grunniens）是青藏高原地区不可或缺
的全能家畜，对当地缺氧、强紫外线、高寒气候环
境有极强的适应性［1］。牦牛与普通牛种间杂交可提
高后代乳肉的生产性能，但是存在杂交后代（犏牛）
雄性不育的问题，影响了杂交后代的利用［2］。当前
对犏牛雄性不育的机制已经进行了一些生理生化、
组织学和基因水平的研究［1-3］。Zhang［4］和 Pan［5， 6］
等通过犏牛睾丸组织形态学观察发现精原细胞处于
休止状态或死亡，附睾内未观测到精子，由此认为
犏牛雄性不育主要是由于精子发生过程中减数分裂
障碍所引起。还有研究发现牦牛睾丸组织 SNRPN
DMR、DMCI 等基因 mRNA 表达水平低于牦牛，推
收稿日期 ： 2013-12-18
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31240053），中央高校基本科研业务费资助课题（12NZYTH06），西南民族大学研究生创新型科研项目
（CX2013SZ54）
作者简介 ：曾琴，女，硕士，研究方向 ：动物生化与分子遗传学 ；E-mail ：zengqin886@126.com
通讯作者 ：郑玉才，博士，教授，E-mail ：yucaizheng65@hotmail.com
牦牛 Prdm9 基因保守区的原核表达及多克隆抗体制备
曾琴  黄林  林亚秋  金素钰  郑玉才
（西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041）
摘 要 ： 采用逆转录 -聚合酶链式反应（RT-PCR）方法，从牦牛睾丸组织获得 Prdm9 基因的 cDNA 的保守区序列，克隆到
pMD19-T 载体中。经测序确证后，将基因克隆到原核表达载体 PET32a（+），转化 E.coli 表达菌 BL21（DE3），以 IPTG 诱导融合蛋
白的高效表达。利用 Ni 柱亲和层析纯化蛋白，将得到的抗原免疫日本大白兔，获得了 1∶4 效价的牦牛 PRDM9 保守序列的多克隆
抗体，可用于后续试验的研究。
关键词 ： prdm9 牦牛 杂交不育 原核表达 多克隆抗体
Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of the
Conserved Region of Yak Prdm9 Gene
Zeng Qin Huang Lin Lin Yaqiu Jin Suyu Zheng Yucai
（College of Life Science and Technology，Southwest University For Nationalities，Chengdu 610041）
Abstract:  The conserved region of Prdm9 cDNA was obtained from yak testis by RT-PCR and cloned into pMD19-T vector．Following
sequence confirmation, the cDNA was ligated with pET-32a（+）vector and then transformed into E. coli BL21（DE3）to construct expression
strains．The recombinant PRDM9 protein was efficiently expressed in the form of fusion protein through induction with IPTG．After purification
by Ni-NTA, the recombinant protein was injected into Japan White rabbits, and polyclonal antibody against the conserved region of PRDM9 of
yak was obtained and the antiserum was collected after the titter reach 1∶4, the antibody can be used in the future research．
Key words:  Prdm9 Yak Male infertility hybrid Prokaryotic expression Polyclonal antibody
测这些基因可能与犏牛雄性不育有关［1，2］。
PRDM9（PR domain containing 9）是一种可催
化组蛋白 H3 的 4 位赖氨酸发生三甲基化修饰的组
蛋白甲基转移酶的锌指蛋白，参与生殖细胞分裂的
初期过程，是哺乳动物中发现的第一个控制减数分
裂重组热点的转录因子［7］。研究表明，Prdm9 基因
敲除的雌雄小鼠均不育，睾丸中组蛋白三甲基化修
饰及减数分裂相关基因表达改变，生殖细胞出现双
链断裂修复途径的缺陷，同源染色体配对遭破坏，
无法产生成熟的精子和卵子［8］。为探讨 PRDM9 与
犏牛雄性不育的关系，本研究对牦牛 Prdm9 基因的
保守区进行克隆，并进行原核表达，纯化后制备多
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期156
克隆抗体，为今后 Prdm9 基因的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用麦洼牦牛（Bos grunniens）睾丸采自成都
青白江屠宰场，屠宰牦牛后迅速采集睾丸组织，置
于含 RNA 保护液 EP 管中，冰上带回实验室，-80℃
保存。免疫用日本大白兔 2 只，雄性，体重约 2.5 kg。
1.2 方法
1.2.1 睾丸总 RNA 提取 称取约 100 mg 睾丸组织，
在液氮中充分研磨，采用 Trizol（Invitrogen）按说明
书提取总 RNA。利用紫外分光光度计检测总 RNA
的纯度（OD260/OD280=1.8-2.0），同时用 1% 琼脂糖凝
胶电泳检测总 RNA 的完整性。
1.2.2 牦牛 Prdm9 基因保守区 cDNA 的克隆 取 1 μg
总 RNA 按照 RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa，
日本）的方法反转录，获得 cDNA 的第一链。根据
牦牛 Prdm9 基因保守区 cDNA 序列（JX454531）用
Primer Premier 5 设计一对包含有酶切位点的 PCR 引
物，引物序列如下 ：P1 ：5-CCGGAATTCATGCACC
GCAGGCAGGTCATCAAA-3（ 划 线 处 为 EcoR Ⅰ 位
点 ）；P2 ：5-CCCAAGCTTTAAGCAGGAGGCACATG
GGTGGAT-3（划线处为 Hind Ⅲ位点），目的片段长
度 954 bp（77-1 032 bp）。25 μL 的 PCR 反应体系 ：
2×PCR Buffer 12.5 μL（TaKaRa，日本），上下游引
物各 1 μL，cDNA 1 μL，超纯水 9.5 μL。反应条件 ：
95℃预变性 4 min，95℃变性 10 s，54℃退火 20 s，
72℃ 延伸 10 s，共 35 个循环 ；72℃延伸 5 min。产
物经胶回收纯化后，连接到 pMD19-T 载体上，转化
感受态 DH5α，挑取阳性克隆菌落，进行菌液 PCR
测序，以确保所要表达的基因序列完全正确。
1.2.3 原核表达质粒的构建和鉴定 以 EcoR Ⅰ和
Hind Ⅲ按说明书分别双酶切 PET32a（+）和序列正
确的 Prdm9/pMD19-T 质粒 DNA（按天根质粒小提试
剂盒提取），1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的
片段，并与经同样双酶切的 PET32a（+）载体连接。
连接产物转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞，
构建 prdm9/pET32a（+）-BL21，并进行大量培养，
提取质粒并进行测序，以验证重组质粒 DNA 序列的
正确性。
1.2.4 PRDM9 蛋白的原核表达及纯化 取构建好的
阳 性 表 达 克 隆 子（prdm9/pET32a（+）-BL21）5 μL
接种于 5 mL 的含氨苄青霉素 LB 液体培养基中培养
过夜。次日，将活化的种子菌以 1∶40 的比例接种
至含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，进行小规
模诱导，37 ℃培养至对数生长期，加 IPTG 至终浓
度为 1 mmol/L，分别取培养 0、1、2、3、4、5、6、
7 h 的菌体。将含表达产物的细胞溶于含有 8 mol/L
尿 素 的 PBS（20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L NaCl，
pH7.4）中，离心 10 min，取上清，用 SDS-PAGE 检
测 PRDM9 蛋白的最佳表达时间。大规模诱导，菌
液 4℃ 12 000 g 离心后重悬于 pH 7.4 的 PBS 中，超
声破碎菌液，共 20 min（工作 5 s，间歇 9 s），4℃
12 000 g 离心 20 min，弃上清。将沉淀用 PBS 洗 3 次，
沉淀重悬于裂解液（20 mmol/L Na3PO4，500 mmol/L
NaCl，8 mol/L 尿 素 ） 中，4 ℃ 保 存 过 夜。 裂 解 液
12 000 g 于 4℃离心 30 min，取上清液。经 0.45 μm
滤膜过滤后，用镍亲和层析柱纯化蛋白，SDS-PAGE
检测。
1.2.5 多克隆抗体的制备及鉴定 纯化后的重组蛋
白（约 1 mg）的溶液与弗氏完全佐剂按 1∶1 的体
积比混匀，进行皮下多点注射。14 d 后以等量蛋白
和等体积弗氏不完全佐剂加强免疫，后每半个月加
强 1 次。抽取兔子心脏血液获得抗血清。采用琼脂
双向扩散法检测抗血清效价。
2 结果
2.1 牦牛Prdm9基因保守区的克隆测序
本试验提取的 RNA 质量符合要求，通过克隆获
得了 Prdm9 基因保守区阳性克隆 Prdm9/pMD19-T，
测序显示其长度为 954 bp，编码 318 个氨基酸，与
NCBI 登录的牦牛 Prdm9 基因保守区 cDNA 序列（登
录号 ：JX454531）吻合。
2.2 重组质粒Prdm9-PET32a（+）的构建与鉴定
用 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ 对重组质粒 prdm9/pET32a
（+）进行双酶切，获得两个片段，其中 Prdm9 基
因片段大小为 954 bp（图 1），符合预期结果。对
prdm9/PET32a（+）进行序列分析，证实 Prdm9 序
列以及插入方向和位置完全正确，可以进行诱导
表达。
2014年第3期 157曾琴等 ：牦牛 Prdm9 基因保守区的原核表达及多克隆抗体制备
2.3 重组菌的鉴定
本研究对重组质粒 Prdm9/pET32a（+）进行了
菌液 PCR 和 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ 双酶切鉴定。用克
隆引物进行菌液 PCR，扩增得到 954 bp 的目的条
带（图 2），用 EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ 双酶切重组质粒
prdm9/pET32a（+），得到 954 bp 目的片段和 5.4 kp
的载体片段，结果与图 1 相符。菌液 PCR 和双酶切
鉴定均表明表达载体中含有一条 954 bp 的插入片段，
这与预期相符，表明牦牛睾丸的 prdm9 基因已经成
功插入到原核表达载体 pET32a（+）中。进一步对
表达载体的 prdm9/pET32a（+）-BL21（DE3）进行
了测序，测序结果与前面获得的牦牛 prdm9 基因的
序列比对后完全一致。
白条带，约为 54 kD（目的蛋白分子量为 34 kD，融
合 pET32a（+）表达载体的分子量约 20 kD）。
将细胞破碎分离包涵体后，把包涵体溶解在变
性液中，通过镍柱亲和层析纯化包涵体，大部分杂
蛋白被去掉，获得分子量约为 54 kD 的纯度较高的
PRDM9 蛋白（图 3-B）。
2000
bp
M 1 2 3 4
9541000
750
500
250
100
M ：DL2000 ；1 ：酶切前的 PET32a（+）质粒 ；2 ：酶切前的 Prdm9/pMD19-T
重组质粒 ；3 ：双酶切后的 PET32a（+）；4 ：双酶切后的 Prdm9/pMD19-T 重
组质粒
图 1 质粒双酶切结果图
2000
bp
M 1 2 3 4 5
954
bp
1000
750
500
250
100
M ：DL2000，1-5 ：阳性克隆菌液 PCR 结果
图 2 牦牛 Prdm9 基因重组子鉴定的琼脂糖凝胶电泳图
2.4 牦牛Prdm9的原核表达及融合蛋白的纯化
本研究构建的 prdm9/pET32a（+）表达载体在
受体菌 BL21（DE3）中进行表达，裂解收集菌体进
行 SDS-PAGE。 结 果（ 图 3-A） 表 明， 经 1 mmol/L
IPTG 诱 导 4 h 后，PRDM9 的 表 达 量 最 高，PRDM9
融合蛋白以包涵体存在。Prdm9/pET32a（+）-BL21
（DE3）工程菌在 45 -66.2 kD 区域呈现出明显的蛋
90.0
kD
A M 1 2 3 4 5 6 7 8
54
66.2
45.0
33.2
26.0
90.0
kD
B M 1 2 3 4 5
54
66.2
45.0
33.2
26.0
2.5 抗体效价的测定
采用琼脂双向扩散法检测的抗血清效价约为
1∶4。
3 讨论
国内外已有研究表明，PRDM9 蛋白在小鼠、人
及猩猩的表达水平与染色体有丝分裂有着密切的关
系［12，13］。PRDM9 是一个转录活性因子，参与同源
染色体之间基因重组的过程，其功能主要是抑制种
间杂交后代的繁殖能力、促进新物种的产生和阻止
基因在物种间的交流［12］。因此，PRDM9 的研究在
遗传育种方面具有重要意义。
犏牛雄性不育或许与 Prdm9 基因有关，然而，
有关牦牛 Prdm9 基因的研究和抗体的制备目前尚
未见报道。本试验通过 RT-PCR 技术扩增获取牦牛
Prdm9 基因保守区该序列，总长为 954 bp，编码 318
个氨基酸，并将该目的片段将其连接入原核表达载
（A）1 ：未经 IPTG 诱导 ；2-8 ：分别是 1、2、3、4、5、6、7 h IPTG 诱导的
工程菌重组蛋白。（B）1 ：未经 IPTG 诱导 ；2 ：IPTG 诱导 4 h 的蛋白，3-5 ：
经镍柱纯化过的蛋白
图 3 SDS-PAGE 方法检测 Prdm9 基因原核表达图谱及融
合蛋白的纯化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期158
体 pET32a 中，转化至原核表达工程菌 BL21（DE3），
成功构建了 Prdm9/PET32a（+）-BL21 基因工程菌。
经过 IPTG 诱导，获得了牦牛 Prdm9 保守区蛋白，
纯化后免疫家兔，成功制备了兔抗牦牛 PRDM9 保
守区肽段的多克隆抗体。本试验为后续研究 PRDM9
在牦牛和犏牛睾丸的表达差异奠定了基础。
本研究制备的抗体用于 ELISA 检测效价还不高。
制备抗体关键是抗原的质量和免疫过程（免疫次数
和免疫间隔时间等）［14］。本试验最初选用 8 mol/L
尿素溶解包涵体，但后续复性效果较差，仍有部分
蛋白质以沉淀形式存在。随后使用镍亲和层析柱纯
化目的蛋白，200 mmol/L 咪唑洗脱目标蛋白，获得
重组蛋白，通过透析，浓缩重组蛋白［15］。以该重组
蛋白为抗原免疫日本大白兔，制备多克隆抗体。经
过基础免疫 3 次后，测定血清的效价不高，按照谭
荣荣等［14］报道的方法进行了 1 次加强免疫（7 d 后），
效价有所提高，可用于免疫组化试验和检测牦牛与
犏牛蛋白表达差异的比较研究。但抗体特异性还不
是非常强，可能是因为试验过程中部分抗原仍未完
全复性，溶解性比较差，同时重组蛋白标签较长，
此标签也可免疫产生抗体等原因造成的。因此需要
进一步优化反应条件，来提高抗体的特异性。为进
一步深入研究牦牛 Prdm9 基因结构和蛋白功能研究
奠定了基础，及探索 PRDM9 在牦牛远缘杂交后代
雄性不育机制提供新的线索。
4 结论
从牦牛睾丸组织获得 Prdm9 基因的 cDNA 的保
守 区 序 列， 成 功 构 建 了 Prdm9/pET32a（+）-BL21
（DE3）工程菌。将得到纯化的蛋白作为抗原，免
疫日本大白兔，成功的获得了兔抗牦牛 PRDM9 保
守序列的多克隆抗体血清。血清抗体能够与抗原蛋
白特异性结合，经优化条件，获得该抗体后续进行
Western blot 检测的理想的效价，为检测蛋白表达差
异奠定基础。
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（责任编辑 李楠）