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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-22
作者简介 : 汤鸣强 , 男 , 硕士 , 副教授 , 研究方向 : 生化与微生物 ; E-mail: mqt-1022@163.com
米曲霉 F-81产中性蛋白酶的固定化条件及其特性
汤鸣强 薛盛果 叶鹏
（福建师范大学福清分校 生物与化学工程系，福清 350300）
摘 要： 以海藻酸钠为载体，戊二醛为交联剂固定化米曲霉 F-81产中性蛋白酶，研究了固定化条件及固定化酶的性质。结
果表明，固定化的最佳条件为：固定化时间 1 h、海澡酸钠浓度 4%、戊二醛浓度 9%、CaCl2浓度 0.7 mol/L。在此条件下固定化
的中性蛋白酶活力为游离酶活力的 68%。固定化酶的最适作用温度为 65℃，最适作用 pH值为 7.0。60℃下酶稳定性较好，80℃
下处理 60 min，粗酶中几乎检测不到酶活力；中性蛋白酶 pH稳定范围为 6.5-9.5。Km值为 24.83 mg/mL，最大反应速率 Vmax为
0.043 12 mg/min。
关键词： 米曲霉 中性蛋白酶 固定化 酶学性质
Immobilization Conditions of Neutral Protease from Strain Aspergillus
oryae F-81 and Its Characteristics
Tang Mingqiang Xue Shengguo Ye Peng
（Department of Biology and Chemistry Engineering，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300）
Abstract: Neutral protease from Aspergillus oryaze F-81 was immobilized using sodium alginate as the carrier and glutaraldehyde as
the crosslinking agent. The best conditions for immobilization and the characteristics of the immobilized neutral protease were studied. The
results showed that the best efficiency of immobilization was obtained while immobilized time was 1 h, sodium alginate concentration was 4%
and glutaraldehyde concentration was 9% with 0.7 mol/L CaCl2. Under these conditions, the relative activity for immobilized neutral protease
to the free one was 68%. The optimum temperature and pH for neutral protease catalysis were 65℃ and 7.0, respectively. The immobilized
enzy-me was more stable at 60℃ than its unimmobilized counterpart, while its activity almost could not be detected after being treated at
80℃ for 60 minutes. The stable pH range for immobilized neutral protease were 6.5-9.5. The Km and Vmax were 24.83 mg/mL and 0.043 12
mg/min, respectively.
Key words: Aspergillus oryae Neutral protease Immobilization Enzymological properties
中性蛋白酶（neutral proteinase）是 pH 中性条
件下，催化分解蛋白质或高分子肽的肽键，产生小
分子的蛋白肽、小肽以及氨基酸的一类蛋白酶。它
是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制
剂之一［1］，应用于食品、制药、化妆品以及丝纺等
行业［2］。依据酶的性质及用途，酶的固定化方法分
为吸附法、结合法、交联法和包埋法 4 种。吸附法
是指利用各种固体吸附剂将酶吸附在其表面而使
酶固定化的方法。结合法是选择适宜的载体，使
之通过共价键或离子键与酶结合在一起而制成固
定化酶的方法。交联法与共价结合法一样，都是靠
化学结合的方法使酶固定，但交联法所采用的载体
是非水溶性的，如采用戊二醛或双偶联苯胺等带有
两个以上官能团的交联剂与酶进行交联，形成生物
吸附剂。包埋法则是将酶包埋在多孔载体中使酶固
定化的方法。4 种方法中，包埋法反应条件温和，
很少改变酶的结构，应用最为广泛［3］。
米曲霉（Aspergillus oyrzae）具有丰富的蛋白酶
系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，并且能耐受
较高的温度。米曲霉也是美国食品与药物管理局和
美国饲料公司协会 1989 年公布的 40 余种安全微生
物菌种之一［5］。本课题组前期工作从酿造酱油曲精
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期160
中分离纯化到米曲霉菌种 F-81，研究了该菌固体发
酵产中性蛋白酶的酶学性质。粗酶的最适作用温度
为 60℃，最适作用 pH 为 7.0。40℃下酶稳定性较好，
60℃下处理 20 min，粗酶中几乎检测不到酶活力［5］。
为进一步提高该酶的操作稳定性，本研究以海藻酸
钠为载体，戊二醛为交联剂固定化米曲霉 F-81 产中
性蛋白酶，研究固定化条件及固定化酶的性质，旨
在为中性蛋白酶的研究应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 米曲霉（Aspergillus oyrzae）F-81 菌株：
上海迪发酿造生物制品有限公司酿造酱油曲精中分
离纯化得到。
1.1.2 药品和仪器
1.1.2.1 药品 海藻酸钠：青岛明月海藻集团有限
公司；戊二醛：武汉银河化工有限公司；干酪素：
国药集团化学试剂有限公司 ；L-酪氨酸 ：上海翔
军生物科技有限公司 ；Folin-酚试剂 ：上海分子
免疫生化实验室有限公司。其他药品均为国产分
析纯试剂。麦麸、豆粕均为福清市下梧村菜市场
购买。
1.1.2.2 仪器 SPX-150B-Z 型恒温培养箱 ：苏州江
东精密仪器有限公司 ；721 紫外分光光度计 ：尤尼
柯上海仪器有限公司 ；TGL-16M 高速台式冷冻离心
机 ：湘仪离心机仪器有限公司 ；Acculab ALC-2104
电子天平 ：德国 Sartorius 公司 ；pH-211 型酸度计 ：
意大利 HANANA ；SHZ-22 水浴恒温振荡器 ：太仓市
华美生化仪器厂。
1.1.3 培养基 斜面培养基（g/L）：葡萄糖 20，蛋
白胨 10，牛肉膏 10，酵母膏 1.5，MgSO4 1，K2HPO4 2，
pH 自然。发酵培养基 ：黄豆粉 5 g，麸皮 20 g，水
18 mL。搅拌均匀后装入 250 mL 三角瓶。
1.2 方法
1.2.1 发酵条件与粗酶的制备 接种 2 环活化菌种
于发酵培养基中，28℃恒温培养 72 h。将蒸馏水与
发酵培养物按 5 1（V/m）的比例混合并搅拌均匀，
40℃、120 r/min 水浴浸提 1 h，真空抽滤后得上清
液，即为粗酶液。向其中加入 80% 硫酸铵粉末并进
行有规则的搅拌，4℃放置 24 h，10 000 r/min 离心
30 min，取沉淀即为浓缩后粗酶，用保鲜膜封口于 4℃
冰箱中备用。
1.2.2 酪氨酸标准曲线的绘制［6］ 取 18 支试管分成
6组编号后，按表1所示，分别加入酪氨酸、蒸馏水、0.4
mol/L Na2CO3 和 Folin-酚试剂，混匀后置于 40℃水浴
保温 20 min，然后测定 OD660。以组号 1（酪氨酸浓
度 0 μg/mL）做空白对照。
1.2.3 中性蛋白酶活力测定 采用 Folin-酚法［7］测
定。酶活力定义 ：在 40℃、pH7.2 条件下，1 min
内水解 2% 酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需的酶量定
义为一个酶活力单位（U）。酶活力单位计算公式 ：
U=k×A×n×4/10 式中，U ：酶活力单位 ；A ：波长
为 660 nm 时的吸光度值 ；k ：吸光度为 1.000 时对
应的酪氨酸质量浓度（μg/mL）；n ：总稀释倍数 ；反
应体积为 4 mL，反应时间为 10 min。
表 1 酪氨酸标准曲线的绘制
组号 100 μg/mL 酪氨酸（mL） 蒸馏水（mL） 0.4 mol/L Na2CO3（mL） Folin-酚试剂（mL） 酪氨酸浓度（μg/mL）
1 0.0 1.0 5.0 1.0 0.0
2 0.2 0.8 5.0 1.0 20.0
3 0.4 0.6 5.0 1.0 40.0
4 0.6 0.4 5.0 1.0 60.0
5 0.8 0.2 5.0 1.0 80.0
6 1.0 0.0 5.0 1.0 100.0
1.2.4 中性蛋白酶的固定化［3］ 取适当稀释的粗酶
液按照 1 1（V/V）加入 3% 海藻酸钠，搅拌 10 min
后，用 10 mL 医用注射器缓慢滴入 7% CaCl2 溶液中
形成直径约为 2 mm 的球型颗粒，4℃下固定化 1 h，
取出后置于戊二醛溶液中浸泡 10 min，用蒸馏水洗
涤 3 次备用。
2012年第3期 161汤鸣强等 ：米曲霉 F-81 产中性蛋白酶的固定化条件及其特性
1.2.5 固定化酶的酶学性质
1.2.5.1 最适作用 pH 用 pH 分别为 6.0、6.5、7.0、7.5
和 8.0 的磷酸缓冲液配制酪蛋白溶液，按 Folin- 酚法
测定中性蛋白酶的活力。以 pH 值为横坐标，以相
对酶活力为纵坐标作图。
1.2.5.2 酶的 pH 稳定性 用 pH 分别为 6.0、6.5、7.0、
7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 的 0.1 mol/L 磷酸缓冲液处
理凝胶珠，在 4℃下静置 20 h，用 pH7.2、0.1 mol/L
磷酸缓冲液调节 pH 至 7.2 后测定中性蛋白酶活力。
以 pH 值为横坐标，以相对酶活力为纵坐标作图。
1.2.5.3 最适作用温度 固定化中性蛋白酶分别于
40、45、50、55、60、65、70 和 75℃下反应，测定
中性蛋白酶活力。以温度为横坐标，相对酶活力为
纵坐标作图。
1.2.5.4 酶的热稳定性 取固定化酶分别于 20、30、
40、50、60、70 和 80℃条件下保温 60 min，立即冰浴，
测定中性蛋白酶活力。以受热温度为横坐标，相对
酶活力为纵坐标作图。
1.2.5.5 米氏常数的测定 以 2% 酪素溶液为母液，
分别配制 0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和 1.0% 的标准
液各 10 mL。以 0.2%-1.0% 酪素为底物，在 40℃水
浴中，测定不同底物浓度下的酶促反应速率，以［S］/v
对［S］作 Hanes-Woolf 曲线。
1.2.6 固定化中性蛋白酶的操作稳定性 取固定化
酶 15 g 加入到酪蛋白溶液中，于 40℃，100 r/min 反
应 1 h 测定中性蛋白酶活力。过滤取出凝胶珠，用
去离子水反复浸泡冲洗凝胶珠 3 次，再将凝胶珠加
入到酪蛋白溶液中，于 40℃，100 r/min 反应 1 h，
取反应液测定酶活力。如此反复 7 次，测定酶活力
损失与反应次数的关系。
2 结果
2.1 酪氨酸标准曲线的绘制
在 λ=660 nm时，酪氨酸浓度在0-100 mg/L范围，
线性关系良好。其回归方程为 y=0.0094x+0.004，
R2=0.9998。其中，x为酪氨酸浓度（μg/mL），y为
OD660，标准曲线见图 1。
2.2 米曲霉F-81菌株产中性蛋白酶的表征
以海藻酸钠为载体，用包埋法固定游离酶，经
洗涤、干燥，可得外观晶莹透亮，表面趋于光滑的
直径为 2 mm 左右的球状的固定化酶。其形态如图 2
所示。
图 1 L-酪氨酸标准曲线 图 2 固定化酶的形态
2.3 米曲霉产中性蛋白酶固定化条件的选择
2.3.1 固定化时间对固定化酶活力的影响 按照方
法 1.2.4，设定固定化时间分别为 30、45、60、75、
90 和 105 min，测定固定化酶活力。结果（图 3）表
明，固定化时间为 60 min 时，酶活力最高。当固定
化时间少于 60 min 时，由于酶分子不能充分进入凝
胶孔隙，且无法与戊二醛充分交联，使酶活力较低。
随着固定化时间的延长，酶活力变化趋势明显。当
固定化时间超过 60 min 时，由于凝胶孔隙中的酶分
子及与戊二醛交联的酶分子都达到基本饱和，可能
使载体孔径变小，底物不容易与酶结合，而使酶促
反应速度降低，即酶活力下降。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期162
2.3.2 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响 配制
浓度为 3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5% 和 6% 的
海藻酸钠溶液，按照方法 1.2.4 制备固定化酶，测定
固定化酶活力。结果（图 4）表明，浓度为 4% 的海
藻酸钠包埋效果最好。当海藻酸钠浓度低于 4% 时，
由于包埋不紧密，酶分子容易渗出，故酶活力较低；
反之，当海藻酸钠浓度高于 4% 时，由于海藻酸钠
分子之间的空隙率减小，酶分子活动空间受到限制，
扩散较困难，妨碍了酶促反应的进行，固定化酶活
力显著下降。
图 3 固定化时间对固定化酶活力的影响 图 4 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响
2.3.3 CaCl2 浓度对固定化酶活力的影响 分别配制
0.3-0.9 mol/L 的不同梯度的 CaCl2 浓度，按照方法
1.2.4 制备固定化酶，测定固定化酶活力。结果（图
5）表明，酶活力随着 CaCl2 浓度的升高而增大，当
CaCl2 浓度达到 0.7 mol/L 时，固定化效果最好 ；当
CaCl2 浓度低于 0.7 mol/L 时，凝胶的机械强度小，
使得固定化效果不显著 ；而当浓度超过 0.7 mol/L，
并逐渐增加时，凝胶的机械强度也逐渐增强，使
酶分子不易渗出，无法与底物结合，因而酶活力
降低。
2.3.4 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响 戊二醛
具有 2 个或更多的针对特殊基团（氨基、巯基等）
的反应性末端，可以和 2 个或者更多的分子分别偶
联从而使这些分子结合在一起，作为交联剂常用于
改善酶的固定化效果。配制浓度为 6%、7%、8%、
9%、10% 和 11% 的戊二醛溶液，按照方法 1.2.4 制
备固定化酶，测定固定化酶活力。结果（图 6）表
明，当戊二醛浓度低于 9% 时，酶分子交联的不充分，
酶在载体上的固载量较小，故酶活力不高 ；当戊二
醛浓度升高时，固载量也随之提高。有报道显示［8］，
低浓度的戊二醛使得海藻酸钠分子交联及酶交联到
载体上的程度不够，所以酶的活性不高。但戊二醛
的浓度过高则使海藻酸钠载体交联度过大，形成的
网络结构太紧密而限制了底物和反应产物的扩散，
使得相对酶活性降低 ；同时，过高浓度的戊二醛会
与酶蛋白过度交联，导致活性中心的改变而使酶失
2012年第3期 163汤鸣强等 ：米曲霉 F-81 产中性蛋白酶的固定化条件及其特性
活。试验结果表明，当戊二醛的浓度为 9% 时，固
定化效果最佳。
2.4 固定化酶的酶学性质
2.4.1 最适作用 pH 由图 7 可知，固定化中性蛋白
酶的最适作用 pH 为 7.0，游离酶的最适作用 pH 也
是 7.0。
2.4.2 酶的 pH 稳定性 由图 8 可知，固定化中性
蛋白酶在 pH6.5-9.5 之间有较好的稳定性，酶活性
在 74.9% 以上。游离酶的 pH 稳定范围是 6.0-8.0。
显然，经过固定化，中性蛋白酶的 pH 稳定性得到
了改善。溶液 pH 值的改变影响了酶所带电荷以及
载体表面带电基团的电性，从而影响酶的活性。通
过固定化，酶分子活动的自由度变小，pH 值对其构
象的影响有所削弱。
图 7 固定化中性蛋白酶的最适作用 pH 图 8 固定化中性蛋白酶的 pH稳定性
2.4.3 酶的最适作用温度 由图 9 可知，固定化中
性蛋白酶的最适作用温度为 65℃，而且温度变化对
酶的活性影响较小。相比之下，游离酶活性受温度
变化的影响明显，其最适作用温度为 60℃。经固定
化后最适反应温度的提高不仅能提高反应速度，同
时可以防止外界微生物的污染，有利于酶的工业化
应用。
2.4.4 固定化酶的热稳定性 图 10 表明，在处理温
度小于 60℃时，固定化酶能保持 93.9% 以上的活力；
但在 70℃下处理 60 min，固定化酶保持 52.9% 的活
力 ；当受热温度提高到 80℃处理 60 min 时，酶活力
所剩无几。游离酶在 60℃下处理 60 min，酶活力完
全丧失。显然，与游离酶相比，固定化酶的热稳定
性有了明显提高。
图 9 固定化中性蛋白酶的最适作用温度 图 10 固定化中性蛋白酶的热稳定性
2.4.5 米氏常数的测定 以酪素为底物，在 40℃水
浴中，测定不同底物浓度条件下的酶促反应速率。
以［S］/V 对［S］作 Hanes-Woolf 曲线，如图 11 所示。
结果表明，以酪素为底物时，Km 值为 24.83 mg/mL，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期164
最大反应速度 Vmax=0.043 12 mg/min。前期报道，游
离酶 Km 值为 2.84 mg/mL，最大反应速度为 Vmax=0.32
mg/min。固定化酶的 Km 值大于游离酶的 Km 值，而
Vmax 小于游离酶的 Vmax，其原因可能是固定化增加了
底物扩散与酶接触的难度［5］。
有效地解决渗漏问题。固定化酶的质量受固定化
时间、海藻酸钠浓度、戊二醛浓度和 CaCl2 浓度
的影响。固定化时间延长，可能使载体孔径变小，
底物不容易与酶结合，而使酶促反应速度降低。
有报道认为［11］，海藻酸钠浓度影响酶的固定化率，
单纯增加海藻酸钠浓度有利于固定化率的提高，
但海藻酸钠浓度太高影响到凝珠的机械强度和成
球的难易程度，同时也影响固定化酶活力。戊二
醛能和多个分子分别偶联从而使这些分子结合在
一起。张斌等［8］认为，低浓度的戊二醛使得海藻
酸钠分子交联及酶交联到载体上的程度不够，所
以酶的活性不高。但戊二醛的浓度过高则使海藻
酸钠载体交联度过大，限制了底物和反应产物的
扩散 ；同时，过高浓度的戊二醛会与酶蛋白过度
交联而有可能使酶失活。王刚强等［12］单独以海藻
酸钠为载体固定化胰蛋白酶，最适固定化条件为
固定化时间 3.0 h，CaCl2 浓度 3.0%，海藻酸钠浓
度 3.0%。固定化胰蛋白酶最适 pH、最适温度较
游离酶分别提高 1.0 和 10℃。本试验获得的固定
化中性蛋白酶的 Km 值大于游离酶的 Km 值，而 Vmax
小于游离酶的 Vmax，这跟固定化增加了底物与酶扩
散接触的难度有关［5］。本试验获得的固定化中性
蛋白酶经连续使用 5 次后凝胶珠严重变形，而且
测不到酶活力，说明其操作稳定性还有待进一步
改善。
4 结论
本试验以海藻酸钠为载体，戊二醛为交联剂固
定化米曲霉 F-81 产中性蛋白酶。固定化酶的质量受
固定化时间、海澡酸钠浓度、戊二醛浓度和 CaCl2
浓度的影响。结果表明，固定化的最佳工艺条件为：
固定化时间 1 h、海澡酸钠浓度 4%、戊二醛浓度 9%、
CaCl2 浓度 0.7 mol/L。在此条件下固定化的中性蛋白
酶活力为游离酶活力的 68%。固定化酶的最适作用
温度为 65℃，最适作用 pH 值为 7.0。固定化酶 60℃
下稳定性较好，80℃下处理 60 min，粗酶中几乎检
测不到酶活力。其 pH 稳定范围为 6.5-9.5。Km 值为
24.83 mg/mL，最大反应速率 Vmax 为 0.043 12 mg/min。
经过固定化，酶的热稳定性和 pH 稳定性均显著好
于游离酶。
图 11 Hanes-Woolf作图法 [S]/V对 [S]作图
2.5 固定化中性蛋白酶的操作稳定性
将中性蛋白酶固定化的一个目的是提高其操作
稳定性，以便于将水解产物和固定化酶分离，再重
复使用固定化酶。操作稳定性试验表明，第 2 次使
用后酶活性为原来的 94%，第 3 次只剩 65%，第 5
次基本测不到酶活力，此时凝胶珠严重变形，酶活
力基本丧失，说明固定化中性蛋白酶的操作稳定性
有待进一步提高。
3 讨论
酶的固定化方法中，包埋法适用的酶种类多，
工艺简便，酶分子仅仅是被包埋起来，固定化过程
中酶并未参与化学反应，故可以得到活力较高的固
定化酶。常用的包埋材料有琼脂糖、卡拉胶、明胶、
海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等，其中海藻酸钠
是一种从海藻中提取的亲水性胶态多糖，具有无毒、
安全、价格低廉、材料易得等特点，它与多价阳离
子接触时，具有瞬时凝胶化特性，可以在温和条件
下实现对酶的固定，从而保持酶的生物活性［9］，是
酶工程中常用的包埋材料之一［3, 10］。
海藻酸钠直接包埋固定化酶容易导致酶的渗
漏，回收使用性较差。用戊二醛作为交联剂可以
2012年第3期 165汤鸣强等 ：米曲霉 F-81 产中性蛋白酶的固定化条件及其特性
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