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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
低温是经常发生且危害严重的逆境因素之一，
许多果树在经受低温胁迫后都发生不同程度的伤
害，严重时甚至导致整个植株死亡。近年来，在模
式植物拟南芥中发现的 CBF（C- repeat/ dehydration
responsive element binding factor）低温反应途径，使
当前果树抗寒基因工程研究取得了重大突破。CBF
转录因子能够特异结合启动子中含有 CRT/DRE 的顺
式元件，激活 COR 等基因的表达，从而提高植物的
抗冻力［1，2］。本研究采用生物信息学方法对来自不
同种属的植物的低温诱导基因 CBF1 的同源性进行
分析，以此为基础克隆山葡萄低温诱导基因 CBF1，
收稿日期 ：2013-03-20
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30400300），吉林省杰出青年基金项目（20050117）
作者简介 ：刘洋，女，硕士，讲师，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：274381295@qq.com
山葡萄转录因子 CBF1 基因的克隆及序列分析
刘洋1，2 孙佳帝2
（1. 吉林农业大学，长春 130118 ；2. 长春职业技术学院，长春 130033）
摘 要 ： 采用生物信息学方法比对多种低温诱导植物的 CBF1 同源基因，在其保守区域设计一对兼并引物，在特殊的 RT-
PCR 条件下，结合反向 PCR 技术对山葡萄低温诱导转录因子 CBF1 的全长基因进行了克隆，经测序和序列分析显示，山葡萄转录
因子 CBF1 基因 ORF 长为 753 bp，无内含子，编码 251 个氨基酸，编码蛋白分子量和等电点分别为 27.503 kD 和 3.11，属酸性蛋白质。
应用 Blast 软件将山葡萄转录因子 CBF1 基因与大麦（Hordeum vulquare）、水稻（Oryza sativa）等 10 种植物 CBF1 基因氨基酸序列
比较同源性达到 80.7%，且在 AP2/EREBP 结构域有高度的保守性，表明已成功克隆山葡萄（Vitis amurensis）转录因子 CBF1 基因，
将其命名为 ViCBF1，在 GenBank 上的登录号为 DQ517296。
关键词 ： 山葡萄（Vitis amurensis） 低温诱导 转录因子 CBF1 基因 COR 基因 克隆
Cloning and Sequence Analysis of CBF1 Gene in Vitis amurensis
Liu Yang1，2 Sun Jiadi2
（1. Agriculture University of Jilin，Changchun 130118 ；2. Changchun Vocational Institute of Technology，Changchun 130033）
Abstract: Bioinformatic method was used for the comparative analysis of CBF1 gene sequences in cold acclimation, conservative domains
among the sequences were determined for degenerate primer designing, the defined PCR conditions and Reverse PCR clone were adopted to
clone the full length CBF1 genes from genes of Vitis amurensis which is in cold acclimation. Sequence analysis showed that the ORF lengths
of CBF1 gene is 753 bp and has no intron in coding domain, and encoded proteins of 251 residues. Furthermore, their molecular weights and
isoelectric points of 27.503 kD and 3.11 were predicted from the calculated pI values. Similarity of amino acids to many plant which is Hordeum
vulquare and Oryza sativa is 80.7%, it have a highly conserved sequence in AP2/EREBP, this demonstrate we clone transcription factor CBF1
genes of Vitis amurensis . It is named ViCBF1 which is registered in GenBank, number is DQ517296.
Key words: Wild grape（Vitis amurensis） Cold acclimation Transcription factor CBF1 gene COR gene Cloning
并对该基因的核苷酸序列及氨基酸序列进行分析，
旨在为下一步表达载体的构建及基因转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料为吉林农业大学园艺学院选育的两性
花山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）栽培品种“双优”。
E.coli DH5α、表达质粒 pBI121 由吉林农业大学生命
科学院提供。克隆载体 pMD18-T vector、T4 DNA 连
接酶、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶及其他工具
酶购自宝生物工程（大连）有限公司 ；DEPC、Tris
等 RNA 提取试剂、植物基因组 DNA 小量提取试剂盒、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期58
切胶回收试剂盒、DNA 清洁试剂盒、DNA Marker
DL2000 购自杭州维特洁生化技术公司。引物合成和
测序由上海生工生物工程有限公司完成，序列测定
用测序仪 ABIPRISMTM377DNA Sequence 进行。
1.2 方法
1.2.1 山葡萄叶片组织中总 RNA 的提取 以水培法
培养山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）枝条，待枝条长
出 3-5 片真叶时进行 4℃低温处理 4 h，采用 CTAB
法（操作方法参见《分子克隆实验指南》第 3 版）
提取山葡萄叶片组织总 RNA。
1.2.2 山葡萄转录因子 CBF1 基因中间片段的分离
取 5 μL（≤2 μg）mRNA，2 μL 反转录酶，4 μL buf-
fer（5×），2 μL dNTP mix（10 mmol/L），0.5 μL RNa-
se Ribonuclease Inhibitor，3.5 μL DEPC 水，70℃ 水
浴变性 5 min，冰浴 5 min 稍离心，慢慢混匀后，低
速离心，收集液滴，42℃温浴 60 min，85℃加热 10
min 灭活反转录酶，得到 cDNA。以 cDNA 为模板
进行 PCR 扩增，20 μL 的体系包括 0.5 μL cDNA，2
μL buffer（10×），2 μL Mg2+（25 mmol/L），0.25 μL
dNTP（10 mmol/L），0.5 μL P1，0.5 μL P2，0.25 μL
Taq 酶（5 U/μL），14 μL ddH2O， 扩 增 引 物 见 表 1。
扩增程序如下 ：95℃温育 15 min 后，进入热循环，
第 1 个循环参数为 94℃ 45 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s，
此后每个循环的退火温度下降 1℃，共计 9 个循
环，然后以 94℃ 45 s，56℃→ 61℃ 30 s，72℃ 30 s
梯度 PCR 方式运行 35 个循环，72℃延伸 8 min 结
束。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳回收后连接到
pMD18-T 载体上，转化大肠杆菌 DH5α，在 Amp 平
板上挑取重组质粒，PCR 鉴定后送至大连宝生物工
程公司进行测序。
1.2.3 反向 PCR 方法分离山葡萄转录因子 CBF1 基
因侧翼序列 根据 1.2.2 分离出来的 CBF1 基因中间
片段，设计两对特异引物（ViCBF1-F1、 ViCBF1-R1
及 ViCBF1-F2、ViCBF1-R2），见表 1。用植物基因
组 DNA 小量提取试剂盒（见说明书）提取山葡萄基
因组 DNA，应用一种在已知序列及侧翼的未知区域
中没有酶切位点的限制性内切酶 Hind Ⅲ消化，消化
体系 40 μL，包括 Hind Ⅲ（30 U）2 μL，Buffer（10×）
4 μL，BSA（0.1%）4 μL，DNA 20 μL（1.5 μg），dd-
H2O 10 μL，65℃处理 18-20 min，灭活内在的限制
性内切酶。纯化回收 DNA 样品（用 DNA 清洁试剂盒），
具体操作方法按照说明书进行，利用回收的 DNA 样
品作为反向 PCR 的模板，进行 PCR 扩增，扩增产
物在 1% 琼脂糖凝胶中电泳分离，回收目的片段进
行克隆测序。
1.2.4 山葡萄转录因子 CBF1 基因全长 DNA 及 cDNA
的克隆 根据方法 2.3 得到的山葡萄转录因子 CBF1
基因的侧翼序列，在其侧翼序列设计一对特异引
物（ViCBF1-F3 、ViCBF1-R3）， 见 表 1。 以 山 葡 萄
基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，扩增产物在 1%
琼脂糖凝胶中电泳分离，回收目的片段进行克隆
测序。
在 ViCBF1 基 因 的 ORF 设 计 一 对 特 异 引 物
（ViCBF1-F4 、ViCBF1-R4）（表 1）。以反转录 cDNA
为模板进行 RT-PCR 扩增，获得山葡萄 CBF1 基因
的全长 cDNA 序列。
表 1 克隆 CBF1 基因所用引物
引物名称 引物序列（5-3）
CBF1 中间片段扩增引物 P1（gene merge primer） TTYMRDGAGACDMGDCACCC
P2（gene merge primer） ARRAGMADNCCYTCNGCCAT
CBF1 侧翼序列扩增引物 ViCBF1-F1（gene specific primer） CCAGGATATGGCTAGGCACC
ViCBF1-R1（nest gene specific primer） CCGCACGCCTCTGTATATTG
CBF1 侧翼序列嵌套引物 ViCBF1-F2（gene specific primer） CTCAATTTCCCCGACTCGGC
ViCBF1-R2（nest gene specific primer） GGTGTCGTgTCTCCCGGAA
CBF1 全长扩增引物 ViCBF1-F3（gene specific primer） ACTCTTTCTCTCCATGGAC
ViCBF1-R3（gene specific primer） AAGCGCACCTATGTCAAAC
ORF 扩增引物 ViCBF1-F4（gene specific primer） TCGGACCATGAAGAGTTT
ViCBF1-R4（gene specific primer） CATTCCACAAAGACAAGTC
2013年第8期 59刘洋等 ：山葡萄转录因子 CBF1 基因的克隆及序列分析
1.2.5 山葡萄转录因子 CBF1 基因的序列分析 山
葡萄转录因子 CBF1 基因序列相似性比较在 http ：//
ncbi.nlm.nih.gov 网站上用 BLAST 进行，根据目的基
因核苷酸序列用 Primer 5.0 软件推导出目的基因的氨
基酸序列，并进行序列分析。
2 结果
2.1 山葡萄总RNA的提取与mRNA的分离
山葡萄植物细胞中含酚类化合物，并且多糖含
量比较高，为此在本试验在 CTAB 原方法的基础上
增加 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）含量，因为 PVP 中的
CO-N= 基有很强的结合多酚化合物的能力，能有效
地去除多酚对 RNA 提取的干扰，从而获得纯度较
高的山葡萄 RNA，如图 1 所示，23S 核糖体 RNA 与
18S 核糖体 RNA 的带型清晰锐利，它们的亮度比基
本上呈 2∶1 关系，不存在蛋白质、多糖和酚类物质
的明显干扰。
图 1 4℃低温处理 4 h 山葡萄的 RNA 的提取
2.2 山葡萄转录因子CBF1基因中间片段及侧翼序
列的获得
以 mRNA 反转录产物 cDNA 为模板进行电泳，
通过 PCR 获得 cDNA 的扩增片段，将扩增产物重组
到 pMD18-T 克隆载体上进行测序，测序结果为 758
bp。根据序列信息，设计两对侧翼序列嵌套引物，
反向 PCR 获得一长度约为 750 bp 的片段（图 2）；
测序结果为 753 bp（图 3）所示，其中有 546 bp 是
与上述已经分离出来目的基因中间片段的重叠区域
（图 3 中的阴影部分即是）。图 3 中的方框部分是新
扩增出来的片段，长度为 206 bp，双下划线部分的
6 bp 是 Hind Ⅲ酶切位点，Hind Ⅲ的实际酶切位点是
AAGCTT，而在本试验中由于此酶产生了星号活性，
此位点变为 ATGCTT（双下划线），剩余的 200 bp 新
扩增出来的片段，其中有 94 bp 是目的基因的 5 端
片段（即方框中双下划线右侧序列，106 bp 目的基
因的 3 端片段（即方框中双下划线左侧序列）。
2000
M 1 2
1000
750
500
250
100
750
bpbp
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ： RT-PCR 产物 ；2 ：阴性对照
图 2 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳
CTCAATTTCCCCGACTCGGCTTGGCGCCTTCCACGGCCCAAGTCGTCCTCTGCAGAAGACATACAAGTAGCAGCGCTTGCAGCCACCAAGGCT
TTCAACCCAACTGCACCATCTTCGTCCTCCTTGGCCTCTGCATTAGATAATATGTCAGGAGTTGCAGACTCGAAGAAGGTACTAGAAACTTCACC
AAATGTGGAGTCGCCTAAGTTAAAGAGCCAAAGGATGGTTCTGGAAGTCTCTCCGGTGGATACTAAGAGGTCAGAGAAGGTTGGAGATGGTT
CAACGACAGTGTTCATGGATGAGGAGGCAATGCTCAATATGCAAGGTTTAATTAACAGCATGGCTGAGGGTTTGCTCCTTACTCCACCTGCTAT
GTGTAAAGGATTCAGCTGGGATGATGCAACTGATTCCCACATTGACTTGTCTTTGTGGAATGATGATTAGTTTGACATAGGTGCGCTTAGATTTC
AAGTTTCTTTTCTTTCCATTTCTTGTTCCGTGTCCATTTCGCGGACAAAATTCTATGCTTCCTACCCTTAAAAACTTTCTTGTCCCCCATTCAACAT
CTCACCCTTTGACATCTACTCTTTTACTCTTTCTCTCCATGGACTCGGACCATGAAGAGTTTTCAGCTTCGTCATCATCCTCTTCTTCTCGGACAA
ACCCTAATTCTTCTGATTCTTTGCTGCCTCTACAGTGCATTGGGCACAAGCGGAAAGCTGGGAGGAAGAAGTTCCGGGAGACACGACACC
图 3 反向 PCR 测序结果
28S
leaf
18S
5S
2.3 山葡萄转录因子CBF1基因全长DNA及 cDNA
的克隆
以山葡萄基因组 DNA 为模板，引物 ViCBF1-
F3、ViCBF1-R3（表 1）。进行 PCR 扩增，得到的 PCR
产物比较特异，无杂带，无降解现象（图 4）。以山
葡萄 mRNA 反转录产物 cDNA 为模板进行电泳，引
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期60
物 ViCBF1-F4、ViCBF1-R4（表 1），PCR 获得 cDNA
的扩增片段，如图 5 所示。测序结果所得到的序列
与我们用基因组扩增所得到的序列在编码区内完全
一致，这说明山葡萄转录因子 CBF1 基因在编码区
内没有内含子。与所报道的其他植物中 CBF1 基因
在编码区内没有内含子的结论完全一致。
过程受此区域的控制。位于 C 末端的转录激活区酸
性氨基酸含量较高，位于第 237-251 个氨基酸之间，
其 pI 在 3.6-3.9 之间，这一区域在转录激活中起主
要作用。
2000
bp bp
M 1 2
1000
750
250
100
500
900
2000
bp bp
M 1 2
1000
750
250
500
750
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：基因组 DNA 扩增产物 ；2 ：阴性对照
图 4 目的基因全长的 PCR 分析
M ：DNA Marker DL2000 ；1，2 ：目的基因 cDNA 的 PCR 产物
图 5 目的基因的 cDNA 克隆的 PCR 产物
2.4 山葡萄转录因子CBF1基因核苷酸序列及推导
的氨基酸序列分析
山葡萄转录因子 CBF1 基因序列全长为 910 bp，
编码区长为 753 bp，无内含子。山葡萄转录因子
CBF1 基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列，如图
6 所示。CBF1 转录因子属于 AP2/EREBP 类转录因子，
其一级结构中含有 AP2 DNA 结合域（图 6 中的阴影
部分），它由 79 个氨基酸残基组成，在不同的植物
中非常保守，山葡萄转录因子 CBF1 基因与其他几
种植物中的 CBF1 基因的同源性主要归因于它们的
AP2 DNA 结合域的高度同源。预测的碱性核定位信
号位于 N 末端区域，位于第 36-75 个氨基酸之间，
富含精氨酸和赖氨酸，CBF1 转录因子进入细胞核的
两侧的数字为核苷酸和氨基酸的编号 ；* 表示终止密码子 ；下划线部
分是推断的核定位信号区 ；波浪线部分是转录激活区 ；阴影部分为
AP2/EREBP
图 6 山葡萄转录因子 CBF1 的核苷酸序列及其相应
的氨基酸序列
2.5 山葡萄转录因子CBF1基因的氨基酸序列分析
根据开放阅读框的密码子翻译，推测该基因
编码一个含有 251 个氨基酸的多肽，分子量约为
27.503 kD，等电点偏低，pI=3.11，属酸性蛋白。
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2013年第8期 61刘洋等 ：山葡萄转录因子 CBF1 基因的克隆及序列分析
表 2 氨基酸成分组成成分
氨基酸 数目 摩尔浓度（%） 质量分数（%）
A Ala 24 9.56 6.68
C Cys 3 1.20 1.14
D Asp 17 6.77 7.07
E Glu 14 5.58 6.43
F Phe 8 3.19 4.13
G Gly 12 4.78 2.81
H His 5 1.99 2.15
I Ile 6 2.39 2.46
K Lys 16 6.37 7.31
L Leu 22 8.76 9.01
M Met 9 3.59 4.19
N Asn 11 4.38 4.54
P Pro 16 6.37 5.75
Q Gln 5 1.99 2.28
R Arg 17 6.77 9.25
S Ser 34 13.55 11.16
T Thr 13 5.18 4.84
V Val 13 5.18 4.76
W Trp 5 1.99 3.19
Y Tyr 1 0.40 0.57
通过氨基酸组成分析得知，山葡萄转录因子
CBF1 基因中丝氨酸的浓度较高，达到 13.55%，而
碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸的浓度分别为 6.37% 和
6.77%，酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的浓度分别为
5.58% 和 6.77%（表 2）。
2.6 山葡萄转录因子CBF1基因氨基酸序列比较
Blast 软件分析表明，山葡萄转录因子 CBF1 基
因与其他几种植物的 CBF1 有着很高的相似性，其
中与茄科辣椒属中的簇生椒（Capsicum annuum）、盐
芥（Thellungiella salsuginea）、橡胶树（Heavea brasi-
liensis）、 葡 萄（Vitis vinifera）、 拟 南 芥（Arabidopsis
thaliana）、水稻（Oryza sativa）苹果（Malus×dome-
stica）、 大 麦（Hordeum vulquare）、 马 蔺（Iris lactea
var. chinensis） 等 植 物 的 CBF1 基 因 的 氨 基 酸 同
源 性 达 到 80.7%。 如 图 7 所 示， 在 不 同 植 物 中
AP2/EREBP 区域内是高度保守的，它含有 1 个由约
60-70 个氨基酸残基组成的非常保守的 DNA 结合域
（DNA-binding domain），主要功能是调节低温、干旱、
高盐等胁迫条件下的应答反应。而且在 AP2/EREBP
结 构 域 的 上 游 和 下 游 分 别 有 两 段 保 守 序 列， 即
PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR，在预测由拟南
芥编码产生的 140 多种 AP2/EREBP 域蛋白中，只
有 CBF1、CBF2 和 CBF3 才具有这两段短多肽序列，
因而称其为 CBF 蛋白的特征序列，而在 AP2/EREBP
区域的两侧氨基酸序列总体上看没有明显的同源性。
cacbf1
hbcbf1
mdcbf1
atcbf1
ilcbf1
tscbf1
vacbf1
vvcbf1
hvcbf1
oscbf1
Consensus
cacbf1
hbcbf1
mdcbf1
atcbf1
ilcbf1
tscbf1
vacbf1
vvcbf1
hvcbf1
oscbf1
Consensus
111
118
108
98
98
101
102
102
106
105
154
165
157
147
147
150
161
161
159
159
k f r e t r h p i y r g v r r r n s g k w v c e v r e p n k k s r i w l g t f p t a e m a a r a h d v a a l a l r g r s
a c l n f a d s a w r l p v p s a k d i q k a a a e a a a f p l d
Capsicum annuum（ca）、Heavea brasiliensis（hb）、Thellungiella salsuginea（ts）、Hordeum vulquare（hv）、Vitis vinifera（vv）、Arabidopsis thaliana（at）、
Oryza sativa（os）、 Malus x domestica（md）、Vitis Amurensis（va）；黑色框中为高度保守氨基酸
图 7 十种植物低温诱导转录因子 CBF1 基因的氨基酸序列比较
3 讨论
近 3 年来，在拟南芥［3］、油菜［3］、水稻［4］和番茄［5］
等植物中发现了 CBF1 转录激活因子，本研究采用
生物信息学方法对所能获得的低温诱导植物的 CBF1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期62
基因序列进行了系统分析，进而获得了不同低温诱
导植物的 CBF1 基因的共同结构域，藉此合成兼并
引物，并以山葡萄叶片组织为材料，采用 RT-PCR
和反向 PCR 技术成功获得了山葡萄转录因子 CBF1
基因，在 GenBank 上的登录号为 DQ517296，并采
用 Blast 软件分析对大麦（Hordeum vulquare）、水稻
（Oryza sativa）等 10 种低温诱导植物的 CBF1 基因的
氨基端序列进行了比对，其同源性达到 80.7%，这
也说明基因进化的保守性。该研究的核心技术在于：
兼并引物的设计及兼并引物条件下 PCR 条件的设置。
该方法与惯常使用的同源序列法的不同点在于以大
量低温诱导植物的 CBF1 基因的相似性为基础，采
用梯度 PCR 方法，无须要求引物序列的完全匹配，
对同源性的要求较低。此外，本研究采用反向 PCR
的方法一次性获得目的基因的侧翼序列即非编码区
部分，该方法只需要提取基因组 DNA 进行单酶切和
自身环化，从而简化了分离未知基因的步骤。
比较分析现有的低温诱导的植物 CBF1 基因序
列发现，CBF1 基因中含有高度保守的 AP2/EREBP
结 构 域［6，7］，AP2/EREBP 家 族 的 转 录 因 子 是 与
环境胁迫应答反应等有关的一系列转录因子。在
山 葡 萄 AP2/EREBP 域 的 上 游 和 下 游 存 在 PKK/
RPAGRxKFxETRH 和 DSAWR 特征序列，在拟南芥［8］
编码产生的 140 多种 AP2/EREBP 域蛋白中，只有
CBF1、CBF2、CBF3 才具有这两段短多肽序列，两
序列在进化程度不同的物种［9，10］中保守存在。因此，
推测这两段序列为 CBF 蛋白的特征序列，在 CBF 基
因抗寒性功能研究中发挥非常重要的作用。结合本
研究的结果及 CBF1 同源基因研究方面的文献，可
以推测这样一种可能 ：即存在一种和 CBF 蛋白相似
的蛋白质与编码去饱和酶的基因的启动子中某一元
件结合，促进编码去饱和酶的基因的表达，去饱和
酶使膜脂的不饱和度增加，从而最终增加膜脂在低
温条件下的流动性和稳定性，增强植物的抗寒力。
4 结论
本研究设计了一对兼并引物，采用 RT-PCR 及
反向 PCR 技术克隆了山葡萄转录因子 CBF1 基因全
长，其 ORF 长为 753 bp，无内含子。经序列比较分析，
该基因属于 AP2/EREBP 类转录因子，其一级结构中
含有 AP2 DNA 结合域，它由 79 个氨基酸残基组成，
在不同的植物中较保守。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）