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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的一类转
录因子，最初于 1983 年被发现存在于非洲爪蟾卵
母细胞的转录因子 TFIIIA 中 ［1］，锌指结构由多个半
胱氨酸或（和）组氨酸组成，通过锌离子来维持结
收稿日期 ：2014-02-11
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31371984）
作者简介 ：伍文宪，硕士研究生，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：wuwenxian07640134@163.com
通讯作者 ：邱德文，研究员，博士生导师，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：qiudewen@caas.cn
刘勇，研究员，研究方向 ：生物农药与生物技术 ；E-mail ：liuyongdr@163.com
烟草 C3HC4 型锌指蛋白的原核表达及转基因
植株功能研究
伍文宪1，2  杨秀芬1  刘勇2  邱德文1
（1. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100081 ；2. 四川省农业科学院植物保护研究所，成都 610066）
摘 要 ： 植物中 C3HC4 型 RING 锌指蛋白在泛素化、光形态建成、抗逆及生长发育等过程中均起到非常重要的作用。首
次从本生烟中扩增获得一个锌指蛋白基因的完整阅读框，编码 203 个氨基酸，含有 C3HC4 型锌指结构域，命名为 NbZFP1。将
NbZFP1 基因分别克隆到原核表达系统载体 pGEX-6P-2 以及 pMAL-C2X 中，成功构建了重组表达载体 pGEX-6P-2-NbZFP1 与 pMAL-
C2X-NbZFP1，经 IPTG 获得了大量可溶性表达的 NbZFP1 融合蛋白。将 NbZFP1 基因克隆于植物表达载体 pBI121 中，通过农杆菌介
导法获得转基因烟草，PCR 检测及 Southern blot 分析表明 NbZFP1 基因已整合到烟草基因组中，转 NbZFP1 基因烟草表现出株型紧
凑，节间缩短，茎干粗壮和对 TMV 抗性增强。
关键词 ： 锌指蛋白 重组表达 转基因烟草 抗病性
Prokaryotic Expressing and Functional Analysis of C3HC4-type Zinc
Finger Protein in Nicotiana benthamiana
Wu Wenxian1，2 Yang Xiufen1 Liu Yong2 Qiu Dewen1
（1. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；2. Institute of Plant Protection，
Sichuan Academy of Agricutural Sciences，Chengdu 610066）
Abstract:  C3HC4-type RING finger genes comprise a large family in the plant kingdom and play important roles in various physiologic
processes of plant life. In this study, a zinc finger gene was isolated from Nicotiana benthamiana. Sequence analysis indicated that the gene
encodes a 24 kD protein with 203 amino acids and contains one typical C3HC4 zinc finger domain and named NbZFP1. The entire coding region
of NbZFP1 gene was then cloned into the bacterial expression vectors pGEX-6P-2 and pMAL-C2X. After IPTG induction, the recombinant
protein was analyzed by SDS-PAGE, which showed that the expected protein was expressed at a high level in bacterial cells. NbZFP1 gene was
cloned into the over-expression vector pBI121, and then transfered into Nicotiana benthamiana through Agrobacterium tumefacien-mediated
transformation. According to PCR and Southern blot detection, NbZFP1 gene was successfully integrated into Nicotiana benthamiana genome.
Regeneration plants showed type compactness, internode shorten and stem sturdy, also enhanced disease resistance against tobacco mosaic virus
（TMV）.
Key words:  Zinc finger protein Recombinant expression Transgenic tobacco Disease resistance
构的稳定性。锌指蛋白通过与目的基因的 DNA 或
RNA 结合，或与其他蛋白之间的相互作用来调控基
因表达。根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基
数及在蛋白中的位置，可将含锌指结构域的转录因
2014年第7期 101伍文宪等 ：烟草 C3HC4 型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究
子分为 C2H2、C2C2、C3H、C3HC4（Zinc finger）和
C3HC5（LIM finger）5 个 亚 类［2］，C3HC4 锌 指 蛋
白具有较为简单的蛋白质结构［3］，由能结合两个离
子的 4 对双配体构成，不仅能结合 DNA，还能与
RNA，蛋白质和脂质结合［4］。C3HC4 锌指蛋白参与
基因转录与重组，细胞间信号转导等各种生命过程，
也能在蛋白间互作以及泛素化进程中发挥重要作用，
许多 C3HC4 锌指蛋白本身就是 E3 泛素化连接酶，
介导泛素化目标蛋白的转移［5］。
植物 C3HC4 型锌指蛋白基因的研究多集中在
拟南芥与水稻 ［6］。为人们所熟知的拟南芥 C3HC4 型
锌指蛋白有 AtCOP1（参与光反应）、AtCIP8（参与
光形态建成）［7］、AtTED3（参与光信号传导）［8］、
AtRMA1（参与分泌途径）［9］、AtXB3（参与根的发
育）［10］、AtSDIR1（抗逆反应）［11］等。在水稻中，
研究比较深入的 C3HC4 型锌指蛋白大多与光形态建
成有关，主要包括 OsCOP1、OsCOIN1、OsXB3.1 和
OsRHC1［7］。目前，尚无对烟草中 C3HC4 型锌指蛋
白的研究报道，本研究以诱导植物抗性的蛋白激发
子 Hrip1 为诱饵蛋白，从烟草 cDNA 文库中首次获
得本生烟 C3HC4 型锌指蛋白基因 NbZFP1，建立该
蛋白大肠杆菌体外重组表达系统，获得转基因烟草
植株并分析转化株的表型特征和抗病功能，以期为
进一步研究烟草 C3HC4 型 RING 锌指蛋白在生长发
育以及蛋白激发子诱导植物抗性分子机制中的功能
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本生烟种子由本实验室保藏。
1.1.2 载 体 和 菌 株 原 核 表 达 载 体 pGEX-6P-2 与
pMAL-C2X、 植 物 表 达 载 体 pBI121、 农 杆 菌 菌 株
GV3101 均由本实验室保存，TMV-GFP 病毒由清华
大学生命科学学院刘玉乐教授提供，大肠杆菌感受
态 BL21 购自北京全式金公司。
1.1.3 仪器与试剂 蛋白纯化仪 AKTA explorer 900
（Amersham 公司）；地高辛分子检测试剂盒（Roche
公司）；植物组织 RNA 提取试剂盒（北京全式金公
司）；mRNA 反转录试剂盒（北京全式金公司）；各
化学试剂均购自 AMRESCO 公司。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 采用植
物组织 RNA 提取试剂提取本生烟总 RNA，取 2 μg
mRNA 用于 cDNA 第一链的合成（具体方法参见北
京全式金公司反转录试剂盒说明书）。
1.2.2 NbZFP1 的 克 隆 与 序 列 测 定 以 从 烟 草
cDNA 文库中获得的一段约 200 bp 的序列为信息
探 针， 搜 索 本 生 烟 SGN mRNA 序 列 库， 同 源 比
较，设计一对特异性 PCR 引物 ：F-NbZFP1 ：5-CG
GGATCCATGTCACTTTCTGGTCGT-3，R-NbZFP1 ：
5-GCGTCGACTCAGGTTTTCAGCCCTGT-3（ 引 物 由
北京华大公司合成）。PCR 程序扩增目的基因 ：94℃
预变性 2 min ；94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃
延伸 1 min，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。目
的条带经胶回收纯化后连接到 pEASY-Blunt-Zero 载
体中，转化至大肠杆菌感受态细胞 Trans5α，测序由
北京华大公司完成。
1.2.3 NbZFP1 原核表达重组质粒的构建 质粒提
取、双酶切、连接及转化等参照试剂说明书和相关
的分子生物方法［12］，简要操作步骤如下 ：提取原核
表达载体 pGEX-6P-2、pMAL-C2X 以及测序正确的
pEASY-Blunt-Zero-NbZFP1 转化子质粒，用限制性内
切酶 BamH I 和 Sal I 双酶切并回收载体片段及目的
基因片段 NbZFP1，22℃连接 15 min 后转化至表达
宿主菌 E. coli BL21（DE3）中，过夜培养，待长出
单菌落，挑取单菌落为模板进行菌落 PCR，筛选出
阳性转化子后送测序，将验证无误的转化子分别命
名为 pGEX-6P-2-NbZFP1 和 pMAL-C2X-NbZFP1。
1.2.4 NbZFP1 蛋白的诱导表达和检测 挑取 pGEX-
6P-2-NbZFP1、pMAL-C2X-NbZFP1、pGEX-6P-2 空载
体和 pMAL-C2X 空载体单菌落，分别接种于 50 mL
含 Amp（终浓度为 100 μg/mL）的液体 LB 培养基中，
37℃ 220 r/min 振荡培养 6-7 h，按 1∶100 的比例稀
释到 1 L 含 Amp（100 μg/mL）新鲜液体 LB 培养基中，
37℃ 220 r/min 振荡培养 4 h，温度调至 16℃，转速
调至 200 r/min，待温度降至 16℃后，加入终浓度为
0.1 mmol/L IPTG 诱导培养过夜，次日将菌液分别转
入离心桶中，4℃，5 000 r/min 离心 15 min，弃上清，
向沉淀中加入 40-50 mL pH8.0 的 Tris 缓冲液重悬，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期102
之后进行超声破碎处理，待超声波破碎完全，4℃，
12 000 r/min 离心 50 min，取上清，用相应的预装亲
和层析柱初步纯化，收集洗脱液以及穿透液，洗脱
液经脱盐后，用蛋白纯化仪 AKTA explorer 900 离子
交换层析，收集各个洗脱峰。各个样品通过变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。SDS-
PAGE 试剂的配制及方法参照文献［13］。
1.2.5 目标基因转化烟草 利用 Primer 5.0 软件设计
1 对特异性引物 5-CGGGATCCATGTCACTTTCTGGT-
CGT-3（下划线为 BamH I 酶切位点）和 5-GCGTC-
GACTCAGGTTTTCAGCCCTGT-3（下划线为 Sal I 酶
切位点）扩增 NbZFP1 的开放阅读框，连接至 pEA-
SY-Blunt-Zero 载体中，之后用 BamH I 和 Sal I 双酶
切，同时双酶切载体 pBI121，然后用 T4 DNA 连接
酶连接获得融合载体 pBI121-NbZFP1，用农杆菌介
导的叶盘浸染法［14］将融合载体 pBI121-NbZFP1 转
化到野生型本生烟中，叶盘置于培养基（MS+0.1
mg/mL NAA+1 mg/mL BA+3% 蔗糖 +0.375% phytagel，
pH5.7）2℃ 暗 培 养 2 d， 将 叶 盘 转 移 至 分 化 培 养
基（MS+0.1 mg/mL NAA+1 mg/mL BA+3% 蔗糖 +500
mg/mL 头 孢 霉 素 +100 mg/mL 卡 那 霉 素 +0.375%
phytagel，pH5.7），光照培养一个月左右，保持 28-
30℃，每 10 d 更换一次分化培养基，待分化出小苗后，
将 苗 转 移 至 生 根 培 养 基（MS+0.1 mg/mL NAA+3%
蔗 糖 +250 mg/mL 头 孢 霉 素 +80 mg/mL 卡 那 霉 素
+0.375% phytagel，pH5.7），最终获得转基因烟草。
1.2.6 转基因烟草的分子鉴定 用植物组织基因组
DNA 试剂盒（北京全式金公司）提取长势较好的 T0
代转基因烟草基因组 DNA，以 pBI121 载体上一段
1 000 bp 左右特异性高的序列设计引物，PCR 鉴定
阳性植株。将阳性烟草植株做 Southern 杂交试验，
Southern 鉴定按试剂盒说明书进行。
1.2.7 株高及节间长的测定 温室培养 T0 代阳性转
基因烟草，获得 T1 代种子，分别在温室中培养野生
型本生烟与 T1 代转基因本生烟，待长至四叶期后每
隔 10 d 测量株高及节间长。
1.2.8 转基因烟草抗病性测定 分别选取培养 20 d
左右的 T1 代转基因烟草和野生型烟草，在烟草中部
叶片上用棉棒涂抹含 TMV-GFP 的 PBS 缓冲液，重
复 3 次。3 d 后在紫外灯下观察发病情况［15］。
2 结果
2.1 NbZFP1的克隆
利 用 设 计 的 特 异 性 PCR 引 物， 从 本 生 烟 的
cDNA 中扩增了一条 576 bp 产物，命名为 NbZFP1。
同时将其克隆到平末端载体 pEASY-Blunt-Zero 中，
转化大肠杆菌 Trans5α，获得的转化子经菌落 PCR
及测序后，经序列比对与数据库中序列完全一致。
2.2 NbZFP1的原核表达质粒的构建
原核表达载体 pGEX-6P-2 在其多克隆位点上游
有一个谷胱甘肽 -s-转移酶编码序列，目的基因在不
改变阅读框架的条件下插入多克隆位点（MCS），在
转化大肠杆菌后经过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）
的诱导及相应条件的优化，就可表达出与谷胱甘
肽 -s-转移酶融合的蛋白。将之前构建好的克隆子
用 BamH I 和 Sal I 双酶切并回收目的条带后，与同
样使用 BamH I 和 Sal I 双酶切过的表达载体 pGEX-
6P-2 连接，转化大肠杆菌 BL21，通过菌落 PCR 及
测序验证阳性转化子。
原核表达载体 pMAL-C2X 在其多克隆位点上游
有一个麦芽糖结合蛋白编码序列，设计引物时在反
向引物添加 6 个组氨酸密码子，这样在诱导表达时
C 末端含 6 个 His 标签，可以用 His 亲和层析柱纯
化。pMAL-C2X 载体可以较高幅度的提高目标蛋白
的可溶性。pMAL-C2X-NbZFP1 的构建与 pGEX-6P-
2-NbZFP1 一致。
2.3 NbZFP1的原核表达检测
将构建好的含有 NbZFP1 基因的原核表达载
体 pGEX-6P-2-NbZFP1、pMAL-C2X-NbZFP1 和 空 白
对照质粒 pGEX-6P-2、pMAL-C2X 分别转化大肠杆
菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导后，表达产物经亲和
层析，离子交换层析纯化后，进行 SDS-PAGE 凝胶
电泳分析，经考马斯亮蓝染色成像。由于所克隆的
基因约为 576 bp，所以编码蛋白分子量约为 24 kD，
表达载体 pGEX-6P-2 上的 GST 蛋白约 26 kD，因此
pGEX-6P-2-NbZFP1 融合蛋白的分子量约为 50 kD。
而 pMAL-C2X 上 的 MBP 标 签 蛋 白 约 为 45 kD， 因
此 pMAL-C2X-NbZFP1 融合蛋白的分子量为 69 kD。
SDS-PAGE 结果（图 1，图 2）显示，在预计的大小
处有明显的深染蛋白条带，而空载对照只分别在 25
2014年第7期 103伍文宪等 ：烟草 C3HC4 型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究
kD 和 45 kD 有条带，说明已成功构建了 pGEX-6P-2-
NbZFP1 以及 pMAL-C2X-NbZFP1 基因原核表达载体，
并在大肠杆菌中成功表达。
116
kD
50
kD
2 1 M
66
45
35
25
18
14
120
kD
69
kD
2 3 4 M21 M1
100
80
70
50
40
30
20
M ：蛋 白 Marker ；1 ：经 亲 和 层 析、 离 子 交 换 层 系 纯 化 的 GST-
NbZFP1 ；2 ：GST 蛋白
图 1 pGEX-6P-2-NbZFP1 表达产物 SDS-PAGE 分析
M1：蛋白 Marker1；M2：蛋白 Marker2；1：经亲和层析后的 MBP-NbZFP1 蛋白；
2 ：经亲和层析，离子交换层析的 MBP-NbZFP1 ；3 ：pMAL-C2X 空载体表达
产物上清 ；4 ：pMAL-C2X 空载体表达产物经 His 纯化后的蛋白
图 2 pMAL-C2X-NbZFP1 表达产物 SDS-PAGE 分析
2.4 转NbZFP1基因的烟草植株获得
将 携 带 NbZFP1 基 因 的 过 表 达 载 体 pBI-121-
NbZFP1 通过电击法转化至农杆菌 GV3101 中，利用
农杆菌介导的叶盘转化法，侵染本生烟叶片，再经
共培养、分化培养后，将分化出的抗性苗剪下转移
至生根培养基中，4 周左右得到生根的抗性苗。
选取野生型本生烟植株和在抗性培养基上生根
的转基因本生烟株系，用植物基因组 DNA 提取试剂
盒提取烟草叶片基因组 DNA。选取 pBI121 载体上
特性较高的约 1 000 bp 的片段设计引物，结果（图 3）
显示，在 18 个烟草转化株系中，8 个转化株系能稳
定扩增出 pBI121 载体上一段 1 000 bp 左右特异性条
带，与阳性对照大小一致，初步说明 NbZFP1 基因
M ：DNA Marker ；1-8 ：转基因植株 ；+ ：阳性质粒 ；- ：野生烟草植株
图 3 T0 代转基因烟草基因组 DNA PCR 扩增结果
1-3 ：转基因烟草 ；- ：野生型烟草
图 4 转基因植株的 Southern 杂交鉴定结果
-1 2 3
已成功转化烟草。
随 机 挑 选 的 3 个 PCR 阳 性 的 T0 代 植 株 用 于
Southern blot，均检测到目的基因的整合，一个株系
为单拷贝，两个株系为多拷贝，而在非转基因对照
中没有检测到杂交条带，说明 NbZFP1 已成功整合
到烟草基因组（图 4）。
8- 7 6 5 4 3 2 1 M
1
kb
+
2.5 NbZFP1对三生烟表型及抗病性的影响
将单拷贝的 T1 代转基因种子及野生型烟草种子
分别培养于 1/2MS 培养基，生长 1 周左右，将幼苗
移栽至土中，待四叶期后，每隔 10 d 分别测量野生
型和转基因烟草株高及节间长，直至第 60 天。结
果（图 5-图7）显示，单拷贝 T1 代转基因烟草植株
相对野生型有明显矮化，株型紧凑，节间缩短。利
用 TMV-GFP 接种于烟草后，通过 TMV-GFP 荧光强
度分析判断抗病能力的方法，将 TMV-GFP 分别接种
于转基因和野生型烟草中部叶面大小一致的叶片上，
重复 3 次。3 d 后在紫外灯下观察，发现野生型烟
草叶片上绿色荧光强度高于转基因植株（图 8），说
明单拷贝的转 NbZFP1 基因植株抗病性强于野生型
植株。
3 讨论
锌指蛋白普遍存在于植物中，它们在调节植物
生长发育及非生物应答等多种重要的生命过程中起
着不可替代的作用。目前，在植物中对锌指蛋白家
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期104
族的研究主要集中在 C2H2 型，对 C3HC4 型的研究
比较少，尤其是对烟草 C3HC4 行锌指蛋白的研究未
见报道。本实验室利用酵母双杂交技术筛选蛋白激
发子 Hrip1 互作过程中，首次从烟草 cDNA 文库中
筛选到了一个 C3HC4 型锌指蛋白，通过病毒介导
的基因沉默（VIGS）技术发现该蛋白能影响烟草果
实发育（另文发表）。本研究构建了本生烟 NbZFP1
基因的原核表达载体，获得了在大肠杆菌中大量表
达不同标签的融合蛋白，同时利用亲和层析、离子
交换层析以及分子筛技术分离纯化了不同 NbZFP1
融合蛋白，为进一步研究该蛋白影响烟草果实发育
的作用机制奠定了基础，同时为今后利用不同技
术研究蛋白互作，如 GST-Pull down、免疫共沉淀、
Biacore 等提供了纯化的蛋白样品。
利用农杆菌介导的转基因方法将 NbZFP1 基因
在烟草植株中过表达，结果发现单拷贝的 T1 代转基
因烟草植株表现出株型紧凑、节间缩短。这个结果
与其他植物中所报道的锌指蛋白功能上有相似之处，
如矮牵牛中锌指蛋白 EPF 家族基因，以及拟南芥中
锌指蛋白 SUPERMAN、NNT 控制其生殖发育［16-18］，
水稻锌指蛋白基因 PROG1 在株型发育调控和驯化中
起重要作用［19］，水稻锌指蛋白基因 OsZRL 沉默后
能对根系及植株的生长具有促进作用［20］。在前人研
究报道的基础上，猜测 NbZFP1 可能是作为转录因
子通过某种机制参与到生长素信号传导或生长素 / 细
胞分裂素信号传导，从而影响烟草的生长发育，本
研究得到的单拷贝转基因植株为下一步研究该蛋白
的分子机制提供了试验材料。
在拟南芥中，含有类 LSD1（组蛋白赖氨酸特异
性脱甲基酶）锌指结构域的 LSD1 相关蛋白参与抗
病反应和细胞程序性死亡，在水稻中，编码锌指蛋
白的 OsLOL2 基因通过调节 PR 蛋白含量参与调控水
稻的生长和抗病［21］。推测本试验转 NbZFP1 基因烟
草可能也是通过上调 PR 基因达到抗病性增强目的。
为此，作者将在下一步试验中验证 NbZFP1 基因是
A，B ：野生型烟草叶片侵染 TMV-GFP 后，第 3 天在凝胶成像仪中观察其荧
光情况 ；C，D ：T1 代单拷贝转基因烟草侵染 TMV-GFP 后，第 3 天观察荧光
情况
图 8 TMV-GFP 侵染野生型及转基因烟草后叶片情况
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
2.1
2.4
T1ԓঅᤧ䍍䖜สഐἽṚᒣ൷㢲䰤䮯cm 䟾⭏රἽṚ
图 5 T1 代单拷贝转基因烟草与野生型烟草平均节间长比较
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10 20 30 ᰦ䰤d40 50 60T1ԓঅᤧ䍍䖜สഐἽṚ䟾⭏ර䖜สഐἽṚṚ儈cm
图 6 T1 代单拷贝转基因烟草与野生型烟草不同时间株高
比较
A B C D
A，C：分别为 T1 代单拷贝转基因烟草四叶期后第 20 天和第 50 天生长情况；
B，D ：分别为野生型烟草四叶期后第 20 天和第 50 天生长情况
图 7 T1 代单拷贝转基因烟草与野生型烟草
A B
C D
2014年第7期 105伍文宪等 ：烟草 C3HC4 型锌指蛋白的原核表达及转基因植株功能研究
否参与相应 PR 基因的表达。
4 结论
本研究以蛋白激发子 Hrip1 为诱饵蛋白，从烟
草 cDNA 文库中首次获得本生烟 C3HC4 型锌指蛋白，
命名为 NbZFP1。将该蛋白基因构建于原核表达载
体 pGEX-6P-2 及 pMAL-C2X 上并分别转化至大肠杆
菌中，经诱导表达得到大量可溶性重组蛋白，通过
亲和层析技术、离子交换层析等纯化技术获得了纯
度较高、性质稳定的 GST-NbZFP1、MBP-NbZFP1 蛋
白。构建植物表达体系，将 NbZFP1 基因转化本生烟，
经 Southern blot 检测获得了单拷贝转 NbZFP1 基因
本生烟株系。与野生型烟草植株相比，T1 代单拷贝
转基因植株株型紧凑、节间缩短、茎干粗壮。同时，
NbZFP1 基因过表达可以显著提高植株对 TMV 的抗
病性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）