全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-26
基金项目 : 农业微生物国家重点试验开放课题（AML200806）, 湖北省科技厅自然基金重点项目（2010CBB03801）, 湖北省科技攻关计划
（2007AA201C26）, 湖北省教育厅重大项目（Z20091201, CXY2009A006）
作者简介 : 周 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 植病生防菌与微生物基因功能 ; E-mail: yiyizhzh@ yahoo.com.cn
通讯作者 : 孙明 , 男 , 教授 , 博士生导师，研究方向 : 苏云金芽孢杆菌 ; E-mail: m98sun@mail.hzau.edu.cn
固氮类芽孢杆菌 YUPP-5中环糊精糖基转移酶基因的
克隆与功能分析
周 1 杨廷宪1 杨佩1 孙正祥1 王斌先1 杨晓秋1 孙明2
（1 长江大学农学院，荆州 434025 ；2 华中农业大学农业微生物国家重点实验室，武汉 430070）
摘 要： 从魔芋根际分离的固氮类芽孢杆菌 Paenibacillus azotofixans YUPP-5对多种 β-1，4糖苷键连接的多糖具有水解作用。
通过构建该菌的 fosmid文库，克隆到 2 157 bp的基因片段，编码环糊精糖基转移酶。大肠杆菌中表达此酶，能降解葡甘聚糖、羧
甲基纤维素钠盐、几丁质、木聚糖等多种 β-1，4糖苷键连接的多糖，同时该酶还能以葡甘聚糖为底物生成 β-1，4糖苷键连接的环
糊精，而文献报道这种酶仅能利用 α-1，4糖苷键连接的淀粉为底物生成环糊精；并展示了环糊精糖基转移酶的一些新功能。
关键词： 固氮类芽孢杆菌 魔芋葡甘聚糖 环糊精糖基转移酶 Fosmid文库
Cloning and Functional Analysis of CGTase Gene from
Paenibacillus azotofixans YUPP-5
Zhou Yi 1 Yang Tingxian 1 Yang Pei1 Sun Zhengxiang1 Wang Binxian1 Yang Xiaoqiu1 Sun Ming2
（1College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025；2 State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，
Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070）
Abstract: Paenibacillus azotofixans YUPP-5, which was isolated from the rhizosphere of Amorphophallus konjac, is able to hydrolyze
polysaccharide with β-1, 4 linkage, including glucomannan, galactomannan, xylan, carboxymethyl cellulose, and chitin. To clone the relative
encoding genes, we constructed the fosmid library of strain YUPP-5 to pick out the transformant with activity of degrading glucomannan. By
screening fosmid library, the encoding gene had an open reading frame of 2 157 bp, which deduced cyclodextrin glycosyltransferase（CGTase）,
including 718 amino acids with a signal peptide in the N-terminal region. The gene was expressed in Escherichia coli BL21. The purified CGTase
exhibited strong activity in degrading polysaccharides with β-1, 4 linkage, and forming cyclodextrin using glucomannan as substrate. The CGTase
with some new function was different from others reported in previous literature.
Key words: Paenibacillus azotofixans Konjac glucomannan Fosmid library Cyclodextrin glycosyltransferase
自然界产生各种各样的多糖，维系着人、动物
和植物的物质和能量代谢。而由多糖衍生的寡糖也
同样发挥着重要的作用 ：一些寡糖能刺激人体和动
物肠道双歧杆菌的生长，可作为益生因子添加到食
品中［1, 2］；另外一些寡糖（如 Chitin oligosaccharide）
可诱导哺乳动物、昆虫和植物细胞的防卫反应［3-5］，
还可抑制小鼠 Lewis 肺癌细胞的扩散转移［6］；半乳
葡甘聚糖衍生的低聚糖能诱导黄瓜对烟草坏死病
毒 TNV 的抗性［7］；氨基寡糖素能诱导植物抵抗病
毒病、黄萎病、枯萎病等多种系统性病害［8-10］。由
于寡糖的这些特殊作用，一些多糖水解酶逐渐从微
生物中被发现并用于工业化生产。这些多糖水解酶
中，有一种特殊的水解酶——环糊精糖基转移酶
（cyclodextrin glycosyltransferase， 简 称 CGTase）， 该
酶主要有 3 种功能［11］：降解淀粉产生糊精，并把糊
精进行环化产生桶装结构（内部具有疏水性而外部
2012年第3期 129周 等 ：固氮类芽孢杆菌 YUPP-5 中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析
具有强亲水性）的环糊精 ；打开环糊精，使之变成
线性分子 ；通过转糖苷反应把两个线性低聚糖偶联
成分子量不同的线性分子。
至今已报道多种细菌能够分泌环糊精糖基转移
酶， 包 括 Anaerobranca gottschalkii［12］，alkalophilic
Bacillus sp.［13］，Bacillus circulans［14］，Bacillus firm-
us［15］，Bacillus licheniformis［16］，Bacillus macerans
糖 ［17-25］等。目前 NCBI 蛋白质数据库中共有 1 681
个环糊精糖基转移酶的相关序列，已报道的环糊精
糖基转移酶的氨基酸链长短差异较大，有的只有 500
多个氨基酸残基，较大的则有 700 多个氨基酸残基，
各种来源的环糊精糖基转移酶在氨基酸序列上有 47
% 至 99 % 的相似性 ［26］。这些报道的 CGTase 都是利
用淀粉（由 α-1，4糖苷键连接）为底物生成环糊精 ［27］，
这在一定程度上限制它的来源和用途。由于这些
纺织物和纸张都是以 β-1,4 糖苷键为骨架的材料，
传统的环糊精难以直接连上。假如环糊精是以纤
维素（而不是淀粉）为底物合成的（β-1,4 糖苷
键链接而成），则环糊精就较容易接枝到织物和
纸张上，所以希望找到能水解 β-1,4 糖苷键的环糊精
糖基转移酶，创造新型的环糊精，进一步拓展其应
用空间。
1 材料与方法
1.1 材料
宿主菌株 Escherichia coli DH5α、E.coli BL21（DE3）
均为本室保存，pMD18-T 载体及 DNA 纯化试剂
盒购自大连宝生物工程有限公司 ；fosmid 文库构
建试剂盒 EpiFOS™ 购自 Epicentre 技术公司 ；薄层
层析 TLC-60 膜购自德国 MERCK 公司 ；半乳甘露聚
糖（刺槐豆胶，LBG 型）、木聚糖、羧甲基纤维素、
几丁质和甘露寡糖（二糖至六糖）标准品等购自
Sigma 公司 ；葡甘聚糖购于建始农泰有限公司 ；魔芋
豆腐是购自当地市场 ；其他试剂均为进口或国产分
析纯。
大肠杆菌在 Luria-Bertani（LB）培养基上培养 ；
其余多糖降解菌培养基组成为 0.5％蛋白胨，0.2％
酵母膏，0.2％-2％魔芋葡甘聚糖，0.1％磷酸二氢钾
和硫酸镁 0.02％。不同的多糖可替代培养基中的魔
芋葡甘聚糖用于不同试验。
1.2 方法
1.2.1 富集和分离降解葡甘聚糖的菌株 取魔芋根
际土壤样品 5 kg 放入消毒的玻璃缸中，在其中埋入
1 kg 的魔芋豆腐，于 25℃下培养 7 d 后，待魔芋豆
腐降解液化，从玻璃缸中取 1 mL 液体加入灭菌的
500 g 魔芋豆腐中，25℃ 过夜使魔芋豆腐再次液化，
取 50 μL 液体稀释涂平板，挑选菌落接种于 2 个平
板的相同位置上（培养基均含 0.2% 葡甘聚糖），一
皿用于 I-KI（0.2％ 2％）溶液染色，有明显水解圈
的菌落即为目标菌株，另一皿用于菌落纯化保存。
1.2.2 16S rDNA 鉴定 提取细菌的总 DNA，利用引
物 1（5-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，E. coli 16S
rDNA 中 第 9 至 第 27 核 苷 酸 序 列 ） 和 引 物 2
（5-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3，E. coli 16S
rDNA 中第 1 525 至第 1 542 核苷酸序列）进行扩增，
PCR 产物连接到 pMD18-T 载体进行测序。
1.2.3 Fosmid 文库构建 固氮类芽孢杆菌 YUPP-5
于 25℃在液体基本培养基中培养 16 h，提取总
DNA 后按 EpiFOS™ 试剂盒的程序进行操作。大致
程序如下 ：总 DNA 后用枪头吹打剪切成约 40 kb
的片段，纯化后在其末端加上平端化接头，再与
pEpiFOS™-5 载体连接，然后用试剂盒中 MaxPlax™
包装蛋白（λ 噬菌体的外壳蛋白组分）进行包
装，侵染感受态 E. coli EPI100™-T1R 菌株，涂布于
Luria-Bertani（LB）琼脂平板（含 12.5 μg/mL 氯霉素）
上筛选抗性菌落，构建 fosmid 文库。
1.2.4 环糊精糖基转移酶基因的克隆 为了筛选含
有目的基因的转化子，把 fosmid 文库中的转化子接
种到含有葡甘聚糖底物的培养基中，生长 16 h 后，
用 I-KI 染液（0.2％ 2％）染色，筛选出周围具有透
明降解圈的转化子菌落。抽提其质粒，加入 Sau III
AI 进行不完全酶切，收集并纯化 5 kb 大小的片段，
插入到 pUC18 质粒的 BamH I 酶切位点（同尾酶），
转化 E. coli DH5α 菌株，挑选具有透明降解圈的亚
克隆子进行测序分析。
1.2.5 基因表达 环糊精糖基转移酶基因的扩增所
需的上游引物为 5-AGGGTGTCGACTCGATGCGGAT
ACGGCTGTC-3，下游引物为 5- AATTATGTCGACT
TATTGCCAGTTTACCGT-3。 PCR 产物（不含信号肽
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期130
编码序列）和 pGEX- 6P-1 表达载体，用 Sal I 进行
酶切，然后在 T4 DNA 聚合酶的作用下连接，重组质
粒转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3），在 IPTG 诱导
下进行表达，利用 GST 融合蛋白纯化试剂盒对表达
的蛋白进行纯化。
1.2.6 表达蛋白的检测 纯化后的 CGT ase 利用活
性胶进行检测（参照 Jiang 等［28］的方法）：活性胶
是利用底物（0.15％魔芋葡甘聚糖）与 12.5％的聚
丙烯酰胺进行聚合。电泳后的凝胶浸泡在 25％的
异丙醇（V/V）中，轻轻摇动去除十二烷基磺酸钠
（SDS），随后凝胶用 50 mmol/L 的柠檬酸缓冲液（9 mL
0.1 mol/L 柠檬酸与 41 mL 0.1 mol/L 柠檬酸钠混合，
加去离子水，调 pH 值为 6.5，定容至 100 mL）在
4℃下洗涤 3 次（去除异丙醇），每次 30 min。然后
在 50 mmol/L 的柠檬酸缓冲液中于 37℃下温育 12 h，
用刚果红溶液（0.1％，W/V）染色然后用 1 mol/L
NaCl 脱去多余的刚果红，活性胶上无色透明的带即
为目的酶带。
1.2.7 环糊精的检测 环糊精的检测参考 Qi 等［29］
酚酞染色法并稍加修改。在 50 mmol/L 柠檬酸缓冲
液（pH6.5，参照 1.4 中的配制方法）中添加 0.5%
琼脂糖和 0.3% 的葡甘聚糖，用梳齿在凝胶中央制备
3 cm×0.3 cm×0.3 cm（长×宽×高）的凹槽。从E.coli
BL21 中纯化环糊精糖基转移酶，溶于 50 mmol/L 柠
檬酸缓冲液（pH6.5）中，添加到凝胶的凹槽，在凝
胶周围添加 50 mmol/L 柠檬酸缓冲液以防凝胶失水，
置于 40℃保温过夜。凝胶用酚酞溶液染色，酚酞染
液的配制 ：3 mL 的酚酞溶液（1% （W/V）酚酞溶于
50% （V/V）乙醇中）和 24 mL 0.03 mol/L 的 NaOH
混合。凝胶的凹槽周围无色区表明有环糊精形成（环
糊精络合酚酞，使之不能在碱性条件下显色）。
2 结果
2.1 固氮类芽孢杆菌的鉴别
通过富集培养从魔芋的根际分离到一株强烈水
解葡甘聚糖的菌株。该菌株在基本培养基上形成不
规则的暗白色菌落（图 1-A），革兰氏染色阳性，能
够产生孢子，其营养体细胞大小为（0.7-0.8）μm×
（2-4）μm。该菌株不能在含 Na+ 浓度高于 1％的培
养基上生长。16S rDNA 序列分析表明，该菌株与
Paenibacillus azotofixans（GenBank 登录号 AJ251192）
同源性达到 99%（图 1-B）。因此，该菌株被命名为 P.
azotofixans YUPP-5 菌株。
2.2 YUPP-5菌株对各种多糖的降解活性
YUPP-5 菌株除了能降解葡甘聚糖外，对其他
多糖 ：刺槐豆胶（galactomannan）、羧甲基纤维素
（carboxymethyl cellulose），木聚糖（xylan），几丁质
（chitin）和淀粉都有降解活性（图 2）。从图 2 可知，
该菌株更善于利用 β-1，4 糖苷键连接的多糖，而不
善于利用 α-1，4 糖苷键连接的淀粉。
2012年第3期 131周 等 ：固氮类芽孢杆菌 YUPP-5 中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析
2.3 克隆编码CGTase的基因
从 fosmid 文库中克隆到一个 ORF 为 2 157 bp 的
基因序列，序列分析表明该 ORF 在起始密码子的上
游含有 -35 区（5- TTGGCG- 3）、-10 区（5-TCTTTA-
3）和一个假定的 Shine-Dalgarno（SD 序列，5-TG-
AAGGGTGG-3）（图 3）。BLAST 的结果表明，该基
因编码环糊精糖基转移酶，由 718 个氨基酸组成，
其中 N 端 34 个氨基酸为信号肽序列（图 3），这一
氨基酸序列与已知的地衣芽孢杆菌中 CGTase 的同
源序列高达 99%（GenBank 登录号 CAA33763），与
Paenibacillus pabuli中 CGTase 的同源序列高达 93%
（GenBank 登录号 CAO05752）。
经过序列分析，YUPP5分泌的CGTase含有A、B、
C、D、E 五个结构域，具有 Rahman 等［30］报道的
CGTase 基本结构域。除此以外，YUPP- 5 中 CGTase
的氨基端还含有 4 个保守的淀粉酶催化结构域名（黑
色背景标记，图 3）。
2.4 重组YUPP- 5基转移酶的表达和分离纯化
从 Pazotofixans YUPP- 5 的基因组 DNA 中扩增出
cgt 基因序列中 2 055 bp（不包含信号肽序列），插
入到表达载体 pGEX-6P-1 中，转化 E.coli BL21 菌株，
25℃ 培养 3 h 后添加 0.01 mmol/L IPTG 再诱导培养
10 h，根据 GST 纯化试剂盒纯化表达的 CGTase，其
分子大小约为 70 kD（图 4）。
2.5 纯化的CGTase能降解多种多糖
从E.coli BL21菌株中纯化的环糊精糖基转移酶，
能够水解魔芋葡甘聚糖、刺槐豆胶、羧甲基纤维素
钠盐（CMC）、木聚糖（xylan）、壳聚糖（chitosan）、
几丁质（chitin）及淀粉等多糖（图 5）。该酶水解淀
粉的能力稍弱于水解其他多糖的能力。
2.6 以魔芋葡甘聚糖为底物生成环糊精
在 CGTase 存在的情况下，凹槽周边的葡甘聚
糖在酶的作用下会形成环糊精，环糊精能与酚酞络
合，使酚酞在碱性条件下不显色。根据图6结果可知，
凹槽周围有环糊精形成。 以前报道的 CGTase 仅能
利用淀粉（主链由 α-1，4 糖苷键连接）催化形成环
糊精，这是首次报道 CGTase 能够利用 β-1，4 糖苷
键连接的多糖形成环糊精，利用该特点可产生不同
结构类型的环糊精，这将大大扩大环糊精在医药和
食品加工中的应用范围。
3 讨论
糖 P. azotofixans YUPP-5 分泌的 CGTase 对 β-1，
4 糖苷键连接的多糖具有较强的水解活性，这可能
与该菌株的来源有关。因为在魔芋根际，根系渗
漏的营养主要有葡甘聚糖和其他物质，根系死亡
后的成分主要有纤维素、半纤维素和木聚糖等，P.
azotofixans YUPP-5 能够降解这些成分，说明该菌株
本身属于魔芋根际的优势菌株，能够利用这些营养
繁殖自身种群。大肠杆菌表达的 CGTase 与 YUPP-5
菌株本身所表现的水解特性是类似的，由此可推测，
CGTase 对 YUPP-5 菌株降解多糖的活性起着重要作
用。一般来说，每种多糖都有各自的水解酶对其进
行降解，但也有一种酶可以降解多种底物的报道。
Palackal 等［31］报道了一个糖基水解酶可以水解木
聚糖、甘露聚糖、葡聚糖等，这说明 P. azotofixans
YUPP-5 分泌的 CGTase 是一种多功能的酶。
P. azotofixans YUPP-5 分泌的 CGTase 能够降解
多种多糖底物，包括 α-1，4 糖苷键连接的淀粉和 β-1，
4 糖苷键连接的各种多糖，而这些多糖底物的糖基
也是不一样的，说明 CGTase 识别的是糖苷键，而不
是糖残基，并且可能有两种底物识别位点，一个负
责与 α-1，4 糖苷键识别 ；一个负责与 β-1，4 糖苷
键识别。
CGTase 属于 GH13 酶家族中一个独特的成员。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期132
图 3 YUPP-5菌株中 CGTase的核苷酸序列与衍生蛋白质序列分析
2012年第3期 133周 等 ：固氮类芽孢杆菌 YUPP-5 中环糊精糖基转移酶基因的克隆与功能分析
GH13 家族中大部分酶的结构由 3 个结构域组成 ：即
A、B和C，但CGTase的三维结构显示，除了含有A、B、
C 这 3 个结构域外，还有 D 和 E 结构域［32］。A 和 B
结构域形成与底物结合的凹槽及催化相关的结合位
点。C 结构域主要包含底物结合位点［33］，而 D 结构
域的功能还不清楚。E 结构域主要包含两个淀粉结
合位点［34］。然而，通过分析该 CGTase 的 E 结构域，
发现有几丁质结合位点（GDQVS，616-620 氨基酸
残基），因此。推测结构域 D 和 E 可能在降解 β-1，
4 糖苷键连接的多糖过程中发挥着重要的作用。
YUPP-5 菌株中 CGTase 究竟是如何水解 β-1，4
糖苷键连接的多糖，以及如何形成环糊精的，这一
机制尚不清楚。这一新型环糊精糖基转移酶的结构
与功能的关系还需要进一步研究，以期阐明底物结
合位点和催化位点的特殊性。另外，YUPP-5 菌株
是否还有其它多糖水解酶还需要进一步探索，毕竟
YUPP-5 菌株的基因组并没有被测序，还有很多未知
的序列需要分析。
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（责任编辑 李楠）