全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
毕赤酵母可应用于外源蛋白的重组表达，其作
为一种优秀的真核表达系统，得到了广泛应用［1-7］。
毕赤酵母菌体内没有天然质粒存在，需表达载体通
过与毕赤酵母染色体发生同源重组，进而将携带外
源基因的表达框架整合于染色体中来实现外源基因
的表达。因此，使外源基因进入酵母细胞内与基因
组发生同源重组是外源蛋白获得有效表达的前提，
而建立一种简便、快速而有效的方法将外源基因导
收稿日期 ： 2013-07-22
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81101957），十二五国家科技重大专项（2012ZX09301003-001-007）
作者简介 ：杨小盼，女，硕士研究生，研究方向 ：重组蛋白药物 ；E-mail ：yangpanyp1218@163.com
通讯作者 ：高新，女，博士，副研究员，研究方向 ：重组蛋白药物 ；E-mail ：gaox_amms@126.com
毕赤酵母电转化方法的探索
杨小盼 董立厚 万德有 华玲 刘蕴慧 高新
（军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室，北京 100850）
摘 要 ： 旨在通过优化转化条件提高毕赤酵母电转化效率。采用不同的酵母细胞预处理液成分及浓度、不同的细胞体积、
不同的质粒 DNA 用量，在不同的电压下进行转化，计数转化后在平板上产生的克隆数，通过计算每微克 DNA 获得的克隆数来评
价转化效率。 研究表明，用 0.1 mol/L LiAc，0.01 mol/L DTT，0.6 mol/L sorbitol，0.01 mol/L Tris-HCl 处理细胞可获得最佳转化效率 ；
质粒 DNA 用量为 10 ng 时转化效率最高。使用 0.1 cm 电转杯，采用 0.6 kV 电压，对 80 μL 细胞进行转化，转化效率最高，可达 9.6×
105 /μg DNA ；而使用 0.2 cm 电转杯，采用 1.1 kV 电压，对 150 μL 细胞进行转化，转化效率最高，可达 8.8×105 /μg DNA。采用优
化后条件，用 10 μg pPIC9K 质粒 DNA 转化 GS115，可获得 1.1×106 个转化子。此外通过对 3 种常用毕赤酵母载体转化效率的比
较，发现 pPIC9K 的转化效率约是 pPICZαA 的 160 倍，是 pGAPZαA 的 2 900 倍。采用优化后的转化条件，毕赤酵母的电转化效率
从 103-4 提升到了 106。采用单个电转杯最多可获得 1.1×106 个转化子。
关键词 ： 毕赤酵母 电转化 转化效率
Exploration of Pichia pastoris Electroporation Method
Yang Xiaopan Dong Lihou Wan Deyou Hua Ling Liu Yunhui Gao Xin
（Department of Pharmacology and Toxicology，Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850）
Abstract: This paper aims to improve the transformation efficiency of Pichia pastoris by optimized electroporation. The transformation
was carried on with different pretreatment buffer, cell volume, DNA amounts and electroporation voltage. The transformation efficiency was
defined by counting the numbers after cultivating and calculating the clones per μg DNA. Research showed that a better transformation efficiency
can be obtained when the pretreatment buffer is 0.1 mol/L LiAc, 0.01 mol/L DTT, 0.6 mol/L sorbitol, 0.01 mol/L Tris-HCl and the DNA amount
is 10 ng. For the 0.1 cm cuvette, the highest transformation efficiency was 9.6×105 /μg DNA when the electroporation voltage was 0.6 kV and the
cell volume was 80 μL. For the 0.2 cm cuvette, the highest transformation efficiency was 8.8×105 /μg DNA when the electroporation voltage was
1.1 kV and the cell volume was 150 μL. At the same time, we compared the transformation efficiency of different type of plasmid and found that
the transformation efficiency of pPIC9K was 160 times than that of pPICZαA and 2 900 times than that of pGAPZαA. By applying this developed
protocol, it have improved the transformation efficiency of Pichia pastoris from 103-4 to 106 / μg DNA.
Key words: Pichia pastoris Electroporation Transformation efficiency
入毕赤酵母细胞无疑具有重要意义。毕赤酵母除了
作为外源蛋白的重组表达系统外，在构建抗体文库
方面也有应用［8］，而更高的转化效率是获得更大的
抗体库容量的保证。Lorenzo 等［9］通过对酿酒酵母
电转化条件进行优化，获得了（1-1.5）×1010 的抗
体库。与酿酒酵母相比，毕赤酵母具有糖基化程度低、
表达量高等优势。但是由于毕赤酵母与酿酒酵母等
其它类型的酵母不同，在基因操作上存在无效整合、
2013年第12期 157杨小盼等 ：毕赤酵母电转化方法的探索
插入困难等问题，即使采用电穿孔转化，其转化效
率也通常局限在 103-104 个转化子 /μg DNA［10，11］。
而其它方法如 PEG、醋酸锂和原生质体法，则存在
转化效率更低或操作不便等问题［10，12］。因此要充
分发挥毕赤酵母表达系统的优势并扩展其在抗体库
构建领域的应用，有必要对毕赤酵母的电转化条件
进行优化，以期获得更高的转化效率，提升抗体库
容量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和培养基 毕赤酵母菌株为 GS-
115， 质 粒 为 pPIC9K， 均 为 Invitrogen 公 司 产 品。
YPD 培 养 基（1% yeast extract、2% tryptone、2%D-
Glucose），筛选培养基为 MD（2%D-Glucose、1.8%
agar、1.34%yeast nitrogen base、0.004%D-biotin）。
1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶 Sac I 及 Bsp HI 购自
New England Biolabs，DTT 购自 Promega，Tris-BASE
购自 ANGUS Chemical Company，D-Sorbitol、D-Biotin
购自 Amresco，Polypepton 购自日本制药株式会社，
tryptone、yeast extract、agar bacteriological（AGAR
NO.1）购自 OXIOID，yeast nitrogen base 购自 Difco。
Regular agarose G-10 购自 BIOWEST，LiCl.H2O、LiAc
.
2H2O 及 D-Glucose 均为国药分析纯。质粒小量快速
提取试剂盒（离心柱型）购自北京博迈德生物科技
发展有限公司，快捷型琼脂糖 DNA 回收试剂盒Ⅱ型
（离心柱型）购自北京百泰克生物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器 DYCP-31DN 型电泳仪（北京六一
仪器厂），LN-301 基因导入仪（天津理工大学），紫
外可见分光光度计（eppendorf），CR21G Ⅲ型高速冷
冻离心机（HITACHI），Tanon-1600 凝胶成像系统（上
海天能科技有限公司），隔水式恒温培养箱（上海一
恒科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 转化用 DNA 片段的制备 使用质粒小量快速
提取试剂盒（离心柱型）提取 pPIC9K 质粒，并用
Sac I 进行酶切线性化，0.8% 琼脂糖电泳检测无误后
利用快捷型琼脂糖 DNA 回收试剂盒Ⅱ型（离心柱型）
回收线性的 pPIC9K 质粒，经分光光度计测定其浓
度为 220 μg/mL，分装备用。
1.2.2 感受态细胞的制备 将 GS115 菌株在 YPD 平
板上划线活化，取单菌落，接种至含有 5 mL YPD 培
养基的试管中，30℃、250 r/min 震荡培养 24 h，取
20-25 μL 转接至含 100 mL YPD 的三角瓶中，30℃、
250 r/min 培养至 OD600 达到 1-2。取上述 100 mL 菌
液中的 30-50 mL 2 500 r/min 离心 5 min 后弃上清，
收集菌体，用 40 mL 预处理液重悬，室温放置 30
min 后，2 500 r/min 离心 5 min，弃上清。用 5 mL 冰
上预冷的 1 mol/L Sorbitol 洗涤 3 次，尽量去除洗涤液。
菌体计数后，用 1 mol/L Sorbitol 重悬，使菌体浓度
为 1010 个 /mL 制成感受态细胞，保存于冰浴中备用。
1.2.3 电转化 将感受态细胞与适量质粒混合后转
入电转杯中，冰上放置 5 min 后电击。设置电容和
电压进行电击，电击结束后立即用 1 mL 冰上预冷
的 1 mol/L Sorbitol 洗出菌体。涂板（MD 或 YPD）后
30℃培养至长出白色克隆。
1.2.4 克隆计数 利用天能凝胶成像系统的 Colon
计数软件进行计数，并计算转化效率。
2 结果
2.1 预处理试剂对电转化的影响
本研究中分别比较了 LiCl、LiAc、CaCl2 以及不
同浓度的 Tris-HCl 对转化效率的影响，结果如表 1
所示，0.01 mol/L Tris-HCl 的转化效率约为 0.1 mol/L
Tris-HCl 的 1.9 倍 ；LiAc 的转化效率约为 LiCl 的 2.1
倍 ；而 CaCl2 则会降低转化效率。
表 1 预处理液成分对转化效率的影响
预处理液成分 转化效率（DNA/μg ）
0.1 mol/L LiCl+0.1 mol/L Tris-HCl （1.2±0.10）×104
0.1 mol/L LiCl+0.01 mol/L Tris-HCl （2.3±0.12）×104
0.1 mol/L LiAc+0.01 mol/L Tris-HCl （4.8±0.07）×104
0.1 mol/L LiAc+0.01 mol/L Tris-HCl+0.001 mol/L CaCl2（4.0±0）×10
2
2.2 电压对转化效率的影响
通过尝试不同电压进行电击，考察电压对转化
效率的影响。对于 0.1 cm 电转杯，在 0.2-1.5 kV 的
电压范围内进行电击，对于 0.2 cm 电转杯在 0.4-1.5
kV 的电压范围内进行电击，结果如图 1 所示。使用
0.1 cm 电转杯时，当电压超过 1.0 kV 时，转化效率
低于 103，当电压为 0.6 kV 时，转化效率最高，达
7.0×105 /μg DNA ；使用 0.2 cm 电转杯时，电压低于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期158
0.6 kV 时，转化效率低于 102，而电压为 1.1 kV 时，
转化效率最高。随着电压升高，转化效率有所提高，
但当电压超过一定值时，转化效率随着电压的升高
而下降。
mol/L LiAc、0.01 mol/L DTT、0.6 mol/L sorbitol、0.01
mol/L Tris-HCl，转化体积为 80 μL 的条件下对转化
过程中质粒的用量进行优化，优化范围为 10 ng-10
μg。结果如图 4 所示，质粒量为 10 ng 时转化效率
最高，达 2.4×106 /μg DNA ；而使用 10 μg 质粒 DNA
在单个电转杯内进行转化时可获得最多的转化子数
量，达 1.1×106。
2.5 质粒类型对转化效率的影响
比较了实验室中常用的 3 种质粒 pPIC9K、pPI-
CZαA、pGAPZαA对转化效率的影响，结果如表2所示，
pPIC9K 约 是 pPICZαA 的 160 倍， 是 pGAPZαA 的
2 900 倍。这可能与载体同源臂的数量、大小、种类
及线性化位点有关。
3 讨论
目前电转化已经成为酵母外源基因导入的首选
方法。虽然电转化方法简单快速，但是影响外源基
因导入酵母细胞的因素却相当复杂，主要表现在宿
主菌的生长状态、电压、感受态细胞的处理方式、
质粒 DNA 的量及线性化位点等方面。
10
8
6
4
2
0.5 0.6 0.8 1.0 1.1 1.2 1.3
0.2 cm
0.1 cm
voltage kV
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
05
p
er
μ
g
ve
ct
or
D
N
A
图 1 电压对转化效率的影响
2.3 转化体积对转化效率的影响
分别通过固定质粒量（100 ng/ 电转杯）及固定
质粒浓度（2.7 ng/μL）的方式考察转化体积对转化
效率的影响。结果（图 2）表明，在相同质粒量的
条件下，0.1 cm 电转杯的转化体积为 80 μL 时，转
化效率最高 ；0.2 cm 电转杯的转化体积为 150 μL 时
转化效率最高。但差异不明显。在相同质粒浓度条
件下（图 3），0.1 cm 及 0.2 cm 电转杯的转化体积均
在 100 μL 时，转化效率最高 ；0.1 cm 电转杯的转化
体积为 100 μL 以上的总转化子数差异并不明显，0.2
cm 电转杯的转化体积为 400 μL 时转化子数最多，
达 3.4×105。
2.4 质粒量对转化效率的影响
电压为 0.6 kV，电转杯为 0.1 cm，预处理液为 0.1
Volume μL per cuvette
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
05
p
er
μ
g
ve
ct
or
D
N
A
0
3
6
9
12
0.2 cm
0.1 cm
400 5060 80 100 150 200 250 300
0.2 cm
0.1 cm
6A
4
2
0
50 100 150 200 250 300
Volume μL per cuvette
350 400 500
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
05
p
er
μ
g
ve
ct
or
D
N
A
0.2 cm
0.1 cm
6B
4
2
0
50 100 150 200 250 300
Volume μL per cuvette
350 400 500
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
05
图 2 相同质粒量条件下转化体积对转化效率的影响
图 3 相同质粒浓度条件下转化体积对转化效率（A）及转
化子总数（B）的影响
2013年第12期 159杨小盼等 ：毕赤酵母电转化方法的探索
毕赤酵母细胞的不同生长时期对转化率的影响。
处于对数生长中期的酵母细胞生长旺盛，细胞壁结
构较稳定期细胞的细胞壁结构疏松，是最适于进行
电转化的生长阶段。对数中期，电转化后细胞死亡
率较高，但存活的细胞中转化子的比例较高［13］。文
献［14］报道毕赤酵母在 A600 为 1.0-2.6 之间的转化效
率最高，尤其是在 1.5 左右时可获得最高转化效率。
据此本研究选择处于对数生长期，即 A600=1.5 左右
的毕赤酵母进行转化研究。
细胞需要通过一些有效的化学处理来改变细胞
膜及细胞壁对 DNA 的通透性，以便于外源基因进
入受体细胞实现转化。常用的化学试剂包括 PEG、
LiCl、LiAc、DTT、CaCl2 等
［15，16］。本研究中，预处
理液采用 LiAc 增加酵母细胞壁通透性［17］；同时加
入 DTT 作为还原剂通过作用于蛋白质的二硫键［13］，
达到疏松酵母细胞的作用，以便于电压在酵母细
胞壁上产生微孔洞，促进外源质粒 DNA 进入细胞。
LiAc 和 DTT 联合使用，使转化效率明显提高。
目前，毕赤酵母的电转化多采用文献报道的条
件进行电击。实际上应根据不同的电穿孔仪对转化
参数进行优化。本研究中，使用 0.2 cm 电转杯时，
电压为 1.1 kV 时的转化效率最高，0.1 cm 电转杯的
电压为 0.6 kV 时转化效率最高。转化率先随着电压
的加大而增加，但当超过一定值时，转化率反而下
降，可能是过高的电压常会导致感受态细胞大量死
亡。这与文献［18，19］报道中电压对转化效率的影响
是一致的。
此外，只有外源 DNA 浓度在一定的水平才能实
现 DNA 的有效转化，DNA 浓度过低时，DNA 分子
太少不利于与基因组 DNA 发生重组反应 ；而 DNA
量超过阈值时，细胞能吸收的 DNA 分子达到饱和，
继续增加质粒的量也不会提高转化效率［13］。通过条
件优化，毕赤酵母的转化效率提高到 105-6。而在常
规的表达研究中，只需 10 ng 质粒就足以获得 20 000
个以上的克隆用于筛选，大大减少了质粒的使用量，
从而可节省质粒大量制备的时间和成本。而用于构
建表面展示文库时，则希望获得尽可能多的转化子
以提升库容量。在 105-6 的转化效率下，可通过增大
感受态细胞用量，包括在每个电转杯内增加细胞用
量，或者采用多个电转杯进行转化的方法，将毕赤
酵母展示文库的容量提升到 1×107 以上。由于毕赤
酵母表面展示蛋白能正确折叠加工、具有翻译后修
饰、表达量较高，以及酵母本身操作简便、成本低
廉的等特点，使毕赤酵母成为构建抗体等蛋白表面
展示文库的有力工具。
4 结论
毕赤酵母的最佳转化条件为，预处理液 0.1 mol/L
LiAc，0.01 mol/L DTT，0.6 mol/L sorbitol，0.01 mol/L
Tris-HCl，质粒 DNA 用量为 10 ng，使用 0.1 cm 电转
杯，采用 0.6 kV 电压，对 80 μL 细胞进行转化，转
化效率最高，而使用 0.2 cm 电转杯，采用 1.1 kV 电
压，对 150 μL 细胞进行转化，转化效率最高。采用
优化后条件，毕赤酵母的电转化效率从 103-4 提升到
3
2
1
0
0.01 0.05 0.10 0.50
μg vector DNA/cuvette
1.00 2.50 5.00 10.00
A
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
06
/μ
g
ve
ct
or
D
N
A
1.5
1.0
0.5
0.0
0.01 0.05 0.10 0.50
μg vector DNA/cuvette
1.00 2.50 5.00 10.00
B
Tr
an
sf
or
m
an
ts
×1
06
图 4 质粒量对转化效率（A）及转化子总数（B）的影响
表 2 质粒类型对转化效率的影响
质粒类型 转化效率（/μg DNA）
pPIC9K （2.6±0.07）×106
pPICZaA （1.6±0.2）×104
pGAPZaA （8.7±1.4）×102
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期160
了 106。采用单个电转杯最多可获得 1.1×106 个转化
子。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）