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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-09-19
基金项目 : 国家公益性行业科研专项（200910265）
作者简介 : 周琳华 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 转基因产品检测 , E-mail: zhoulinhua905@sina.com
通讯作者 : 肖维威 , 女 , 博士 , 研究方向 : 转基因产品检测 , E-mail: xweiwei@fimmu.com;
马文丽 , 女 , 博士 , 研究方向 : 基因诊断与基因治疗 , E-mail: wenli@fimmu.com
苏云金芽孢杆菌 Cry1A（b）抗虫基因 LAMP
检测方法的建立与应用
周琳华1 肖维威1 吴永彬1 蔡翠霞1 康文杰1 刘唐书2 马文丽1
（1 南方医科大学基因工程研究所，广州 510515; 2 广东省产品质量监督检验研究院，广州 510330）
摘 要： 以转基因玉米 MON810为模板，针对 Cry1A（b）抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物，建立 LAMP检测体系。
对该体系的可行性、灵敏性、特异性进行分析，并应用于转基因产品的检测。研究结果显示该方法快速简单、灵敏度特异性高、
结果可视化，可应用于转基因产品中 Cry1A（b）基因的初步筛选。
关键词： 苏云金芽孢杆菌 环介导等温扩增技术 检测
Construction and Application of the Method for Detecting Cry1A(b)
Gene from Bacillus thuringiensis by Loop-mediated Isothermal Amplification
Zhou Linhua1 Xiao Weiwei1 Wu Yongbin1 Cai Cuixia1 Kang Wenjie1 Liu Tangshu2 Ma Wenli1
（1Institute of Gene Engineering, Southern Medical University, Guangzhou 510515；2Guangzhou Testing Institute for
Product Quality Supervision, Guangzhou 510330）
Abstract: According to the conserved nucleic acid sequence of the Cry1A（b） gene, a set of specific primers were designed to establish
a LAMP assay for detection of Cry1A（b）. The sensitivity and specificity of the method were evaluated. Tests were also conducted on some kin
ds of plants and their products. The results showed that the LAMP method was rapid, simple, visualized, and highly sensitive and specific. It can
be used in initial screening of Cry1A（b）gene in GM products.
Key words: Bacillus thuringiensis Loop-mediated isothermal amplification Detection
自 1983 年含有抗生素类抗体的烟草培育成功，
世界转基因作物的研究范围不断扩大，技术逐渐
深入。1996 年全球转基因作物累计种植面积为 170
万 hm2，而到 2011 年该数据已经达到 1.6 亿 hm2，增
长了 94 倍［1］。种植国家也由美国试点增至 2011 年
的 29 个国家参与。转基因产品正以惊人的速度悄然
进入我们的生活。为维护消费者的知情权和选择权，
也为了严格监管转基因产品，世界上包括中国在内
的许多国家都针对转基因产品实行了标识制度［2］，
即要求市场上出售的转基因产品都要加贴明确的标
识。而标识制度需要准确、便捷、快速的检测方法。
在众多的检测方法中，2000 年由 Notomi 等［3］
发明的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal
amplification，简称 LAMP）技术是具有高特异性、
高效率和快速、灵敏等特点的一种新颖的体外恒温
核酸扩增方法。其基本原理是利用一种具有链置换
活性的 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），针对靶
序列 6 个特异性区域设计两对引物，在等温条件下
保温 60 min 左右，达到核酸大量扩增的目的。扩增
产物与 SYBR Green Ⅰ荧光染料结合能使其由橙色变
为绿色，使结果可视化。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称 Bt）
是一种寄生在昆虫体内的细菌，通过产生杀虫晶体
蛋白或内毒素而对棉铃虫、菜青虫、毒蛾、松毛虫、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期166
玉米螟、高粱螟、三化螟等宿主害虫有不同程度的
致病和毒杀作用，是天然的生物农药。鉴于 Bt 晶
体蛋白具有高度专一性、生物降解性、对人畜无害
的安全性，因此它被作为植物抗虫基因工程中理想
的杀虫目的基因。杀虫晶体蛋白由 cry 基因和 cyt 基
因编码。1990 年 Perlak 等人工改造了 Bt 杀虫基因，
使其在植物中表达能力提高，创造了转 Bt 抗虫作物。
现有 Bt 抗虫作物有烟草、马铃薯、番茄、棉花和玉
米等。本试验通过针对 Cry1A（b）基因的核酸保守
序列设计 LAMP 特异性引物，尝试建立特异、快速、
准确的 LAMP 检测方法，检测转基因产品插入的外
源基因是否含 Bt 基因。
1 材料与方法
1.1 材料
转基因玉米 MON810、转基因玉米 Bt176、转
基因玉米 MIR604、转基因玉米 GA21、转基因玉米
MON863、转基因玉米 Bt11、转基因玉米 NK603、
转基因大豆 GST-40-3-2、转基因油菜 RT73、转基因
甜菜 H7-1 品系标准品由欧洲 IRMM 购得。转基因水
稻 TT51.1 品系样品及大豆、玉米、油菜粕等产品由
广东省出入境检验检疫局提供。市售甜玉米、玉米
片、玉米油、玉米面、米粉等食品购自广州好又多、
吉之岛等超市。
无菌工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备
厂）；电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统
（Bio-RAD 科技有限公司）；紫外分光光度计（德国
eppendorf biophotometer plus）；水浴锅（上海一恒科
技有限公司）。
Bst DNA 聚合酶、10×Bst buffer 购自美国 New
England Biolabs 公司 ；甜菜碱购自美国 Sigma 公司 ；
dNTP、MgSO4 分 析 纯、Premix Taq DNA 聚 合 酶、
pMD18-T 载体、DNA 分子量 Marker、转基因基因组
DNA 提取试剂盒（GMO DetectionVer.2.0）购自宝生
物工程（大连）有限公司 ；凝胶回收试剂盒、质粒
小提试剂盒购自 OMEGA 公司 ；DH5α 菌株为本实验
室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成引物设计与合成 根据
GenBank 公布的 Cry1A（b）基因序列（GenBank 登
录号 ：AY326434.1），通过生物信息学分析，使用
在 线 http://primerexplorer.jp/e/PrimerExploerV4 软 件
设计了一组 Cry1A（b）基因 LAMP 检测引物。在线
BLAST 分析证实，该组引物为 Cry1A（b）基因的特
异性引物。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。
上游外引物 F3 ：ACGAGTGCATCCCGTACA，下游外
引物 B3 ：ATTTGCACCAGGAAGGCG ；上游内引物
FIP：TGGGGGTGTAACCGGTCTCGTCAGCAACCCTG-
AGGTCG ；下游内引物 BIP ：CCTCACGCAGTTCCT-
GCTCAGATGCCCCAGATGATGTCC。
1.2.2 基因组 DNA 的提取 样品 DNA 的提取参照
国家标准CTAB-2法［4］。得到的核酸使用分光光度计，
测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度，确定其浓度和
纯度后，调整浓度至 100 ng/μL，4℃保存备用。
1.2.3 标准质粒分子的制备 以 F3、B3 为引物，转
基因玉米 MON810 标准品提取的基因组 DNA 为模板
进行 PCR 扩增，纯化的 PCR 扩增产物与 pMD18-T
载体连接，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，在含
Amp+ 固体培养基的平板上过夜培养，随机挑取菌落
进行快速 PCR 筛查 ；根据筛查结果继续扩大培养阳
性克隆菌，提取质粒，送华大基因公司进行测序。
1.2.4 LAMP 反应体系的建立 LAMP 检测采用 25
μL 的反应体系，其中包括 ：10×Bst buffer 2.5 μL、
25 mmol/L dNTP 1 μL、0.2 mol/L MgSO4 0.25 μL、5
mol/L 甜菜碱 5 μL、10 μmol/L 上下游内引物各 4 μL、
10 μmol/L 上下游外引物各 0.5 μL、8 U/μL Bst DNA
聚合酶 1 μL、DNA 模板 2 μL、灭菌双蒸水 4.25 μL，
上述待反应物加入到扩增反应管中，混匀后，加入
70% 甘油 25μL，加入 2.5 μL 100×SYBR Green Ⅰ后
置于 65℃水浴温育 60 min，随后将水浴调至 80℃放
置 10 min 终止反应。振荡混匀后直接用肉眼观察颜
色变化。每个产物取 5 μL，用 EB 染色的 2% 琼脂糖
凝胶进行电泳分析。
1.2.5 LAMP 检测方法的敏感性 提取克隆成功的
质粒，测定其纯度和浓度，并按公式：质粒拷贝数 =
质粒质量（g）/（质粒分子碱基对数（bp）×660）
×6.02×1023。将浓度转换成以拷贝数作为计量单位
后，按 10 倍倍比的梯度稀释标准质粒分子，依次配
制成2×106拷贝/μL，2×105拷贝/μL，2×104拷贝/μL，
2×103 拷贝/μL，2×102 拷贝/μL，20 拷贝/μL，2 拷
2012年第4期 167周琳华等 ：苏云金芽孢杆菌 Cry1A（b）抗虫基因 LAMP 检测方法的建立与应用
贝/μL，7 个梯度的标准溶液。按照 1.2.4 的方法进行
检测，确定 LAMP 检测的灵敏度。
1.2.6 LAMP 检测方法的特异性 提取包括转基
因玉米 MON810 在内的 11 个品系的转基因标准品
DNA，使用分光光度计确定其浓度和纯度后，按照
1.2.5 中的方法进行 LAMP 检测，以确定方法的可行
性和特异性。
1.2.7 LAMP 检测方法的应用 采用 1.2.4 中的方法
对市售的玉米面、玉米粉、甜玉米、米粉等 48 份样
品及广东省出入境检验检疫局提供的 18 份玉米酒
糟粕和米粉进行 LAMP 检测。SYBR Green 荧光 PCR
验证检测结果，荧光 PCR 检测所用引物为 LAMP 的
上、下游外引物 F3、B3。
2 结果
2.1 Cry1A（b）基因LAMP检测方法的建立
以本实验室设计的针对 Cry1A（b）基因的
LAMP 引物对转基因玉米 MON810、非转基因玉米
基因组 DNA 进行 LAMP 扩增。扩增产物转基因玉米
样品管呈绿色，空白和阴性对照管则仍为橙色，结
果见图 1。扩增产物的琼脂糖电泳结果（图 2）显示，
转基因玉米 DNA 出现 LAMP 特征性阶梯状条带，作
为阴性对照的非转基因玉米及作为空白对照的水均
无条带产生，与预期相符。
1, 2. 转基因玉米 MON810 ；3. 非转基因玉米 ；4. 空白对照
图 1 LAMP法扩增产物 SYBR GreenⅠ染色结果图 1, 2. 转基因玉米 MON810 ；3. 非转基因玉米 ；4. 空白对照 ；M. DL2000 Marker
2.2 灵敏度试验
将标准质粒分子按 10 倍倍比的梯度稀释，进行
LAMP 检测，SYBR Green Ⅰ染色结果（图 3）显示
当模板 20 拷贝 /μL 时，反应管仍呈现绿色。电泳结
果（图 4）与染色结果一致。
2.3 LAMP法检测Cry1A（b）基因的特异性
采用上述建立的 LAMP 方法，对 11 个转基因
标准品进行检测，结果（图 5）表明，转基因玉米
Bt176、转基因玉米 Bt11、转基因玉米 MON810、转
1. 2×106/μL；2. 2×105/μL；3. 2×104/μL；4. 2×103/μL；
5. 2×102/μL ；6. 20 拷贝 /μL ；7. 2 拷贝 /μL
图 3 LAMP灵敏度试验 SYBR GreenⅠ染色结果
M. DL2000 Marker；1. 2×106/μL；2. 2×105/μL；3. 2×104/μL；
4. 2×103/μL ；5. 2×102/μL ；6. 20 拷贝 /μL ；7. 2 拷贝 /μL
图 4 LAMP灵敏度试验琼脂糖凝胶电泳结果
基因水稻 TT51.1 呈现阳性反应，其余为阴性，该
结果与中国转基因作物检测与监测网上公布的结果
一致。说明该引物组可用于不同种类转基因植物的
Cry1A（b）基因的检测。同时对 11 个转基因标准品
进行 SYBR Green 荧光 PCR 检测，检测结果（图 6）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期168
与 LAMP 法结果一致。
2.4 LAMP法对食品检测
对市售的玉米面、玉米粉、甜玉米、米粉等共
48 份样品分别采用 LAMP 和 SYBR Green 荧光 PCR
法定性检测 Cry1A（b）基因，试验结果显示，两种
方法检出结果一致，均未检出。对广东省出入境检
验检疫局提供的 18 份玉米酒糟粕和米粉进行检测，
两种方法检出结果一致，均检出 3 份阳性结果。
3 讨论
转基因产品的检测方法根据检测靶标的不同分
为两类 ：一类是基于核酸（DNA）的检测方法，另
一类是基于外源靶标蛋白的方法。因为转基因产品
经过重重加工处理，蛋白变性破坏严重，检出率较
低，所以目前使用最广的是基于基因 DNA 的检测方
法［5］。常用手段是各种类型 PCR 扩增技术，如定性
PCR、巢式 PCR、多重 PCR、实时荧光定量 PCR 等。
该类方法灵敏、特异，但需要昂贵的试剂和仪器，
限制了其在大样本量检测中的应用。环介导等温扩
增是近十年发展起来的一种新颖的体外核酸扩增技
术。该方法最大的特点是恒温，克服了因为变温而
需要昂贵仪器的缺陷，甚至只需要水浴锅即能完成
检测。该技术一经问世，在疾病诊断、流行病、病
原微生物检测等领域就显示其独特优势［6-11］。但在
转基因产品检测这一方面，国内外报道并不多见。
转基因产品的检测方法根据检测靶标的不同可
分为筛查法、基因特异性检测法、结构特异性检测
法、转化事件特异性检测法4个层次。检测通用元件，
包括启动子、终止子和标记基因来判断是否含有转
基因成分的方法称筛查法。检测样品中转入的是何
种外源基因的方法称基因特异性检测法。检测样品
中插入基因两个元件连接区域序列的方法称结构特
异性检测法。通过检测外源基因的侧翼序列鉴定转
化体属于何种品系的方法称转化事件特异性检测法。
M1. DL2000 Marker ；1. 转基因大豆 GST-40-3-2 ；2. 转基因玉米 Bt176 ；3.
转基因玉米 MIR604 ； 4. 转基因玉米 GA21 ；5. 转基因玉米 MON863 ；6. 转
基因甜菜 H7-1 ；M2. DL2000 Marker ；7. 转基因玉米 Bt11 ；8. 转基因油菜
RT73 ；9. 转基因玉米 MON810 ；10. 转基因玉米 NK603 ；11. 转基因水稻
TT51.1 ；12. 空白对照
图 5 LAMP特异性检测分析结果
1. 转基因大豆 GST-40-3-2 ；2. 转基因玉米 Bt176 ；3. 转基因玉米 MIR604 ； 4. 转基因玉米 GA21 ；5. 转
基因玉米 MON863 ；6. 转基因甜菜 H7-1 ； 7. 转基因玉米 Bt11 ；8. 转基因油菜 RT73 ；9. 转基因玉米
MON810 ；10. 转基因玉米 NK603 ；11. 转基因水稻 TT51.1 ；12. 空白对照
图 6 SYBR Green荧光 PCR检测结果
2012年第4期 169周琳华等 ：苏云金芽孢杆菌 Cry1A（b）抗虫基因 LAMP 检测方法的建立与应用
Bt 抗虫基因属于外源插入性基因，对其的检测为基
因特异性检测法。
本研究表明，应用所设计的特异性引物，采用
LAMP 方法检测 Cry1A（b）抗虫基因，灵敏度可达
20 拷贝 /μL。对玉米、水稻、大豆、油菜、甜菜等
植物原材料及其加工产品检测，LAMP 检测法与荧
光 PCR 法的检测结果完全一致。相比之下，该方法
对试验设备要求不高，结果可视，因此特别适合基
层普及使用。直接把 SYBR Green Ⅰ荧光染料加入反
应体系中后，反应完成后能直接根据颜色变化判断
扩增结果，避免出现因开盖而产生的假阳性。本试
验发现，转 Bt 基因的玉米一般为饲料的原料，在玉
米酒糟粕中能检测出。但是到目前为止，在我们检
测的食品中并没有发现 Cry1A（b）抗虫基因。
4 结论
本研究建立了对 Cry1A（b）抗虫基因的 LAMP
检测方法。用该方法对玉米面、玉米粉、甜玉米、
米粉等共 48 份样品及玉米酒糟粕和米粉 18 份检测，
结果显示该检测技术结果可靠，特异性强，能推广
应用。其检测灵敏度达 20 拷贝/μL，可用于现场批
量筛查转基因食品。
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（责任编辑 李楠）