全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-09-09
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30800704）, 国家“973”项目（2007CB109307）
作者简介 : 孙静文 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 土壤重金属污染植物修复 ;E-mail:syauman@163.com
通讯作者 : 周卫 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 植物营养分子生理 ;E-mail:wzhou@caas.ac.cn
苋菜 IRT1 基因克隆、序列及表达分析
孙静文 赵世诚 范洪黎 周卫
（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 农业部作物营养与施肥重点开放实验室，北京 100081）
摘 要 : 通过对镉超积累苋菜品种天星米铁转运蛋白基因（IRT1）的克隆、序列及表达分析，旨在为植物修复镉污染土壤
奠定基础。依据同源克隆原理，通过 RACE 技术克隆苋菜 IRT1 基因及生物信息学方法分析基因序列结构和功能，Northern 杂交研
究基因表达。苋菜 IRT1 基因 cDNA 全长 1 135 bp，包含完整的阅读框，编码 322 个氨基酸。苋菜 IRT1 蛋白与已知铁转运蛋白相
似性在 53.70%-63.04%，具有铁转运蛋白典型的功能结构特征，即 N 端含有 1 个信号肽、氨基酸序列上具有完整的 ZIP 家族功能
结构域（Pfam: Zip）和 7 个跨膜结构域（TMs）。苋菜 IRT1 蛋白还具有 1 个 COGO428 超级家族（转运二价金属离子功能）、２个蛋
白激酶Ｃ磷酸化位点和２个酪蛋白 II 磷酸化位点。低铁胁迫时苋菜根中 IRT1 基因表达量增加 , 加镉处理没有改变 IRT1 基因表达量。
因此，推断苋菜 IRT1 基因是 ZIP 家族的一员，具有转运二价金属离子功能，将基因在 GenBank 中注册，序列号为 ：GU363501，
命名为 AmIRT1。
关键词 : 苋菜 铁转运蛋白 克隆 基因表达 IRT1 基因
Cloning, Sequence and Expression Analysis of the IRT1
Gene in Amaranthus mangostanus L.
Sun Jingwen Zhao Shicheng Fan Hongli Zhou Wei
（Ministry of Agriculture Key Laboratory of Crop Nutrition and Fertilization，Institute of Agricultural Resource and
Regional Planning，CAAS，Beijing 100081）
Abstract: To contribute to the development of the phytoremediation removing Cd from the soil, IRT1 gene was cloned according to
homologous gene conserved region by RACE method from Amaranthus mangostanus L., a typical Cd hyperaccumulator named Tianxingmi. Its
sequence and expression character were examined by bioinformatics and northern blot analysis, respectively. Its full-length cDNA is 1135 bp and
encodes a polypeptide of 322 amino acids with an entire ORF. The AmIRT1 protein showed homology to other IRT-like proteins between 53.70%
and 63.04% identity. All conserved features of IRT-like proteins described previously were present in the amino acids sequence of AmIRT1
protein，such as a putative N-terminal signal peptide, a Pfam: Zip function domain and seven transmembrane domains （TMs）. The AmIRT1
protein also contains COGO428 superfamily known as a divalent heavy-metal cations transporter, two protein kinase C phosphorylation sites
and two casein kinase II phosphorylation site. Expression of the AmIRT1 gene was increased in roots under iron deficiency，but no significant
changes in its mRNA accumulation were observed under different Cd treatments. Therefore, the present results suggested that the IRT1 protein
from Amaranthus mangostanu. might be a novel member of the ZIP family with the functions as a divalent heavy-metal cations transporter. This
gene named AmIRT1 had been submitted to GenBank with the accession number GU363501.
Key words: Amaranthus mangostanus L. Iron transporter Cloning Gene expression IRT1 gene
苋菜品种天星米（Amaranthus mangostanus L.）
具备镉超富集植物的特征［1］，既可用于镉污染土壤
的植物修复，又可用作深入研究植物镉超富集机制
的试验材料。高等植物对重金属离子的超富集是一
个复杂的过程，可能有众多金属转运蛋白参与此过
程，其中研究最多的是 ZIP 家族。ZIP 家族多数存在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期60
于真核细胞中，参与 Fe、Zn、Mn 和 Cd 的运输，但
家族成员的作用底物范围和作用专一性不同［2,3］。从
植物中首次分离并鉴定的 ZIP 家族成员包括 ZIP1、
ZIP2、ZIP3、ZNT1 和 IRT1［4］。IRT1 为铁离子转运
蛋白，定位于细胞质膜上，与 ZNT1 具有高度相似性，
在缺铁条件下主要在根部外皮层表达，它能够高效
地转运 Fe、Zn、Mn 和 Cd 等二价金属离子，是植物
富集 Cd 的一个重要转运蛋白，并被乙烯信号转导途
径所调控［3,5-7］。
目前，IRT1 基因已经从模式植物拟南芥、烟
草、水稻和非模式植物豌豆、小金海棠等成功克
隆［5-6,8-10］。但是国内在重金属超积累植物方面还未
成功克隆该基因。如果能够用重金属超积累植物成
功克隆该类基因，应用基因工程技术使该类基因超
量表达，这样可以极大提高转基因植物的修复效率，
对促进植物修复技术的发展和应用具有重要意义。
因此，本研究以镉超富集苋菜品种天星米为试材，
采用 RACE 方法（cDNA 末端快速扩增法）克隆苋
菜 IRT1 基因全长序列，利用生物信息学方法分析基
因序列结构和功能，Northern 杂交方法研究 IRT1 基
因的表达，旨在为进一步阐明高等植物镉超富集的
分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物培养及试验处理
苋菜品种天星米（Amaranthus mangostanus L.）。
种子经消毒后播种于蛭石——草炭基质中培养，幼
苗生长出 3-4 片真叶后，移至盛有营养液的育苗
盆 培 养。 培 养 溶 液 为 Hogland 营 养 液。 环 境 温 度
（28±2）℃，相对湿度（70±5）%，光照 / 黑暗时
间为 14 h/10 h。种苗生长 15 d 后，设置 4 种处理 ：
+Fe，加铁处理（原营养液条件下培养）；-Fe，缺铁
处理（原营养液去掉 Fe 源培养）； +Fe+Cd，加铁加
镉处理（原营养液加 Cd 培养）； -Fe+Cd，缺铁加镉
处理（原营养液去掉 Fe 源加 Cd 培养）。Cd 浓度为
2.5 mg/L。处理 6 d 后取样，将样品液氮迅速冷冻后
置于 -80℃超低温冰箱保存。
1.2 苋菜根系总RNA的提取
采取 TRizol 提取方法，TRizol 试剂购自天根公
司。方法简述如下 ：取苋菜根系 0.15 g，液氮研磨
后，将其装入用 DEPC 处理过的离心管 ；加 1 mL 的
TRizol 提取液，振荡 30-60 s ；加 0.2 mL 的氯仿，颠
倒混匀，冰浴中放置 5 min ；12 000 r/min 低温 4 ℃，
离心 10 min，取上清液 ；加 0.6 体积的异戊醇，室
温下放 10 min ；在转速 12 000 r/min 低温 4℃条件下，
离心 10 min，取沉淀 ；用 70% 的乙醇洗涤，干燥，
溶于 50 μL 的 DEPC 水 -80℃中保存。
1.3 苋菜IRT1基因的克隆
采用 Bio-Rad 公司 MyCycler 型 PCR 仪。PCR 反
应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，
循环 30 次 ；72℃ 10 min。反转录反应参数为 ：70℃
变性 5 min，置于冰上 5 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min。
PCR 及反转录反应所使用的相关试剂购自 TaKaRa
公司。大肠杆菌感受态细胞由本试验室制备。引物
合成由上海生工公司完成，基因测序由北京三博远
志公司完成。
1.3.1 苋菜 IRT1 基因３端克隆 利用 NCBI 中 BLA-
ST 软件搜索已知的 IRT 类基因，然后以拟南芥、烟草、
水稻、豌豆及小金海棠的 IRT1 基因进行序列比对，
设计两个简并引物 IRT-3-1 和 IRT-3-2（5-CATCAAA
TGTT（C/T）GAAGG（A/C/G）ATGG-3 和 5-CTTGG
（C/T）GG（C/T）AT（C/T）CT（A/C/T）CAGG-3）。
以苋菜总 RNA 为模板，以 Adaptor-dT 为引物（5-GA
TTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3），进
行反转录合成第一链 cDNA。以此 cDNA 为模板，简
并引物 IRT-3-1、IRT-3-2 分别与 Adaptor-dT 引物配对，
进行两轮 PCR 扩增，分离苋菜 IRT1 基因 3 端。
1.3.2 苋菜 IRT1 基因 5端克隆 根据已经获得的苋
菜 IRT1 基因 3 端序列设计 3 个特异性引物：IRT-5-1、
IRT-5-2 和 IRT-5-3（5-AAGCAAGCACATAACAGC
-3、5-AGGTCCCTTGAAATCTGAAGC-3 和 5-CCAAT
CACTATCAATGCTGTTG-3），参照 Invitrogen 公司 5
RACE 试剂盒的说明书进行反转录和两轮嵌套 PCR
扩增，分离苋菜 IRT1 基因 5 端。
1.3.3 苋菜 IRT1 基因 cDNA 全长序列克隆 利用 D-
NAMAN 软件将克隆到的 3端序列和 5端序列进行拼
接，获得苋菜 IRT1 基因 cDNA 的全长序列，在该序列
读码框（open reading frame，ORF）的两端设计全长引
物 IRT1-up 和 IRT1-down （5-ATGGCAAATTATAATTT
2012年第2期 61孙静文等 ：苋菜 IRT1 基因克隆、序列及表达分析
CAAG -3和 5-CTAAGCCCATTTAGCCAAGAA-3），以
cDNA 为模板，进行普通 PCR 反应，分离苋菜 IRT1
基因 cDNA 全长序列。
1.4 Northern杂交
Northern 杂交中的电泳、转模、杂交和显影均
参照参考文献［11］的方法。探针制备采用 TaKaRa
公司随机引物标记试剂盒。
1.5 苋菜IRT1基因编码蛋白的生物信息学分析［12］
利用 DNAMAN 6.0 软件对 AmIRT1 基因进行序
列分析。采用 ScanProsite 服务器预测苋菜 IRT1 蛋白
的功能位点（http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/）。
采 用 MEGA4.1 软 件 的 NJ 法（Neighbor-Joining， 邻
接法）构建系统进化树，并进行 bootstrap 检验。采
用 TMHMN2.0 软件 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TM
HMM/）进行蛋白质跨膜区预测。利用 SMART 数据
库 占 线 分 析（http://smart.embl-heidelberg.de） 苋 菜
IRT1 基因编码蛋白的功能。具体方法如下 ：（1）登
录 SMART 数 据 库（http://smart.embl-heidelberg.de）；
（2） 输入 IRT1 基因编码蛋白的氨基酸序列，在“PFAM
domains”和“signal peptides”选项前打勾 ；（3）点
击“Sequence SMART”按钮，即可获得未知基因编
码蛋白的功能预测。
2 结果
2.1 苋菜IRT1基因的克隆
克隆苋菜 IRT1 基因 3 端序列，扩增出一段 400
bp 左右的特异片段，回收该特异片段，进行测序。
测序结果（图 1 中虚线框内序列）表明该片段长度
为 432 bp。克隆苋菜 IRT1 基因 5 端序列在 800 bp
左右处出现特异条带。测序结果（图 1 中实线框内
序列）表明该片段长度为 857 bp。
利用 DNAMAN 软件将克隆到的 3 端和 5 端序
列进行拼接，获得苋菜 IRT1 基因 cDNA 的全长序列。
同时在该序列读码框的两端设计全长引物 IRT1-up
和 IRT1-down，扩增出一个 969 bp 的特异片段（图 1）。
将该片段进行测序，发现测序结果和拼接结果完全
相同。将此基因全长 cDNA 序列在 GenBank 中注册，
序列号为 ：GU363501，命名为 AmIRT1。
2.2 苋菜IRT1基因的序列分析
对 AmIRT1 基因的全长 cDNA 序列进行分析，
结果（图 1）表明，该基因序列全长为 1 135 bp，5
和 3 端非编码序列长度分别为 61 bp 和 105 bp，包
括一个完整的开放阅读框，该编码框含有 969 bp 核
苷酸，编码 322 个氨基酸，推测其分子量为 35.241
kD，等电点值为 7.67。
2.3 苋菜IRT1基因编码蛋白的结构功能预测
苋菜 IRT1 基因编码蛋白存在２个蛋白激酶Ｃ
磷酸化位点（20-22 ：TPR ；196-198 ：TIK）和２个
酪 蛋 白 II 磷 酸 化 位 点（25-28 ：SVVE ；105-108 ：
SWND，图 1）。
分析苋菜 IRT1 基因编码蛋白的氨基酸序列，结
果（图 2）表明该段氨基酸序列包括完整的 ZIP 家
族 Pfam : Zip 功能结构域和一个 COGO428 超级家族，
其功能为二价重金属离子的转运子。
在线分析苋菜 IRT1 基因编码蛋白的功能，发现
该蛋白具有一个信号肽（起始于第 1 个氨基酸结束
于第 25 个氨基酸）和一个典型的 Pfam : Zip 结构域
（起始于第 45 个氨基酸结束于第 319 个氨基酸），该
结构域由 275 个氨基酸组成，与 NCBI 上的 BLASTp
软件预测基本一致（图 3）。
对苋菜 IRT1 基因编码蛋白结构进行预测（图
４），推断该蛋白含有 7 个跨膜域（TMs），这７个
跨膜区分别分布在 IRT1 蛋白氨基酸序列的 5-27，
47-69，81-103，123-145，231-250，260-282，
302-319 的位置上。
2.4 苋菜IRT1基因编码蛋白与其他IRT类蛋白的系
统进化树及相似性分析
在 GenBank 中搜索与苋菜 IRT1 基因编码蛋白
相似性最高的蛋白，找到一大批 ZIP 家族蛋白，从
中选出 9 个得分最高的 IRT 类蛋白，利用 DNAMAN
软件对这些蛋白进行相似性分析发现，苋菜 IRT1 基
因编码蛋白与这 9 个蛋白的相似性最高为 63.04%
（拟南芥锌转运蛋白），最低为 53.70%（水稻 IRT1）。
系统进化树分析（图 5）表明，苋菜 IRT1 基因编码
蛋白与拟南芥锌转运蛋白和拟南芥铁转运蛋白聚类
在一起，并且双子叶植物的 IRT 类蛋白聚在一起，
单子叶植物的 IRT 类蛋白聚在一起。进行 bootstrap
检 验 发 现， 除 黄 瓜 IRT1、 小 金 海 棠 IRT1、 豌 豆
IRT1 之间分枝的 bootstrap 值较低外，其他分支的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期62
虚线框 . IRT1 基因 3 序列；实线框 . IRT1 基因 5 序列；TPR 和 TIK. 蛋白激酶Ｃ磷酸化位点 ;
SVVE 和 SWND. 酪蛋白 II 磷酸化位点
图 1 苋菜 IRT1 基因 cDNA 全长序列及其编码蛋白
图 2 利用 BLASTp 对苋菜 IRT1 基因编码蛋白的功能结构分析
图 3 利用 SMART 对苋菜 IRT1 基因编码蛋白的功能结构分析
2012年第2期 63孙静文等 ：苋菜 IRT1 基因克隆、序列及表达分析
bootstrap 值均大于 90，说明本研究采用 MEGA4.1 软
件的 NJ 法构建的系统进化树结果较为可靠。
2.5 苋菜IRT1基因的表达分析
利用 Northern 杂交方法分析（图 6）苋菜 IRT1
基因在各种处理条件下的表达情况。在缺铁处理及
缺铁加镉处理下，苋菜中两个 IRT-like 基因表达均
上升，而在单独加铁处理及加铁加镉处理下，其表
达没有发生变化。这说明苋菜 IRT1 基因受外源缺铁
胁迫所诱导，而不受外源镉的浓度所诱导。
3 讨论
目前用于植物修复的超积累植物由于地上部生
物量小、生长缓慢等原因难以大规模应用［13］。如果
从超积累植物成功克隆重金属富集的关键基因，利
用基因工程技术将关键基因转入生长迅速、生物量
大的植物，将会极大改进植物修复效率。Varotto 等［2］
通过突变体试验发现 IRT1 基因是拟南芥铁离子吸收
的关键基因，而突变拟南芥 IRT12 基因没有造成拟
南芥体内铁离子缺乏。Wert 等［14］研究指出 IRT2 基
因不是拟南芥吸收铁离子的关键基因，但是该基因
与铁离子有高亲和性，通过区室化作用降低 IRT1 基
因过量吸收铁离子造成的毒害。因此，在本研究中
选择 IRT1 基因为研究对象，依据同源克隆原理，采
用 RACE 技术，从镉超富集苋菜品种天星米中分离
图 4 利用 TMHMM 对苋菜 IRT1 基因编码蛋白跨膜结构预测
图中从上至下依次为 ：拟南芥锌转运蛋白，拟南芥铁转运蛋白，苋菜 IRT1，黄瓜 IRT1，小金海棠 IRT1，豌
豆 IRT1，拟南芥 IRT1，拟南芥 IRT2，水稻三价铁转运蛋白和水稻 IRT1（图中数值为 bootstrap 值）
图 5 苋菜 IRT1 基因编码蛋白的系统进化树分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期64
IRT1 基因 cDNA 全长序列。
尽管苋菜 IRT1 基因编码蛋白与已知铁转运蛋白
相似性不高，与拟南芥锌转运蛋白相似性最高，一
致性为 63.04%，与水稻 IRT1 蛋白相似性最低，一
致性为 53.70%。但是苋菜 IRT1 蛋白具有铁转运蛋
白典型的功能结构特征，即 N 端含有 1 个信号肽（分
泌蛋白或膜蛋白的特有结构）、氨基酸序列上具有完
整的 ZIP 家族功能结构域（Pfam : Zip）和 7 个跨膜
结构域（TMs）。通过生物信息学进一步分析发现，
苋菜 IRT1 蛋白还具有 1 个 COGO428 超级家族（转
运二价金属离子功能）、２个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点
和２个酪蛋白 II 磷酸化位点。因此，推断苋菜 IRT1
基因是 ZIP 家族的一员，该基因编码蛋白具有转运
二价金属离子功能，定位于细胞膜上，存在翻译后
修饰，受蛋白激酶磷酸化调控。
植 物 IRT1 基 因 的 表 达 受 外 源 缺 铁 胁 迫 所 诱
导［15］。范洪黎［1］利用 109Cd 同位素示踪试验证实
缺铁能促进苋菜根系对镉的吸收。本研究在缺铁条
件下，苋菜 IRT1 基因的 mRNA 表达丰度明显上调，
这一变化趋势与 109Cd 同位素示踪试验中根系对 Cd2+
吸收量显著增加的变化趋势一致，这暗示苋菜 IRT1
基因可能是植物镉吸收的一个关键基因。Plazar 等［3］
研究也指出植物体内 TcIRT1 基因表达量不同是造成
两种遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）对金属镉富集能
力差别的原因之一。
4 结论
苋菜 IRT1 基因是植物金属离子转运蛋白 ZIP 家
族的一员，具有转运二价金属离子的功能，低铁胁
迫时苋菜根中 IRT1 基因表达量增加，加镉处理没有
改变 IRT1 基因表达量，苋菜 IRT1 基因可能是植物
镉吸收的一个关键基因。
参 考 文 献
［1］ 范洪黎 . 苋菜超积累镉的生理机制研究［D］. 北京 : 中国农业
科学院研究生院 , 2007.
［2］ Varotto C, Maiwald D, Pesaresi P, et al. The metal ion transporter
IRT1 is necessary for iron homeostasis and efficient photosynthesis
in Arabidopsis thaliana. Plant J, 2002, 31（5）:589-599.
［3］ Plaza S, Tearall KL, Zhao FJ, et al. Expression and functional
analysis of metal transporter genes in two contrasting ecotypes of
the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. J Exp Bot, 2007, 58
（7）:1717-1728.
［4］ Pence NS, Larsen PB, Ebbs DS, et al. The molecular physiology
of heavy metal transport in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi
caerulescens. Proc Nat Acad Sci, 2000, 97（9）:4956-4960.
［5］ Vert G, Grotz N, Dédaldéchamp F, et al. IRT1, an Arabidopsis
transporter essential for iron uptake from the soil and for plant
growth. Plant Cell, 2002, 14（6）:1223-1233.
［6］ Bovet L, Rossi L, Lugon-Moulin N. Cadmium partitioning and gene
expression studies in Nicotiana tabacum and Nicotiana rustica.
Physiologia Plantarum, 2006, 128（3）:466-475.
［7］ Barberon M, Zelazny E, Robert S, et al. Monoubiquitin-dependent
endocytosis of the IRON-REGULATED TRANSPORTER 1 （IRT1）
transporter controls iron uptake in plants. Proc Nat Acad Sci, 2011,
108（32）:450-458.
［8］ Yoshihara T, Hodoshima H, Miyano Y, et al. Cadmium inducible Fe
deficiency responses observed from macro and molecular views in
tobacco plants. Plant Cell Rep, 2006, 25（4）:365-373.
［9］ Li P, Qi JL, Wang L, et al. Functional expression of MxIRT1, from
Malus xiaojinensis, complements an iron uptake deficient yeast
mutant for plasma membrane targeting via membrane vesicles
trafficking process. Plant Sci, 2006, 171（1）:52-59.
［10］ Cohen CK, Fox TC, Garvin DF et al. The role of iron-deficiency
stress responses in stimulating heavy-metal transport in plants.
Plant Physiol, 1998, 116（3）:1063-1072.
［11］ 萨姆布鲁克 , 拉塞尔著 , 分子克隆 ［M］. 第 3 版 . 黄培堂 , 等
译 . 北京 : 科学出版社 , 2002:544-552.
［12］ Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters. Biochim
Biophys Acta, 2000, 1465（1/2）:190-198.
［13］ Garbisu C, Alkorta I. Phytoextraction: a cost-effective plant-
based technology for the removal of metals from the environment.
Bioresource Technoi, 2001, 77（3）:229-236.
［14］ Vert G, Barberon M, Zelazny E, et al. Arabidopsis IRT2 coope-rates
with the high-affinity iron uptake system to maintain iron homeosta-
sis in root epidermal cells. Planta, 2009, 229（6）:1171-1179.
［15］ Lombi E, Tearall KL, Howarth JR, et al. Influence of iron
status on cadmium and zinc uptake by different ecotypes of the
hyperaccumulator Thlaspi caerulescens.Plant Physiol, 2002, 128
（4）:1359-1367.
（责任编辑 狄艳红）