全 文 ：·综述与专论· 2012年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2012-04-25
基金项目 : 农业部转基因专项（2011ZX08001-003）
作者简介 : 陈扬勋 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 植物功能基因组学与蛋白组学 ; E-mail: cylzu05@163.com
通讯作者 : 张治国 , 男 , 博士 , 研究方向 : 植物功能基因组学 ; E-mail: zhangzhiguo@caas.net.cn
随着生物技术的发展，转基因技术已经成为
作物育种的一种重要手段并且已经取得显著的成
就。从 2004 年批准的第一个商业化转基因大豆起
至 2010 年，我国含 Bt 基因的转基因水稻和含 phyA
基因的转基因玉米相继获得了安全证书，转基因的
安全性也越来越受到公众的关注。这其中包括转基
因作物本身的安全性及转基因作物存在的筛选标记
的安全性。因大部分的转基因技术都得借助抗性基
因筛选转化子，从而引起了公众对转基因作物安全
性的担忧，这些安全性包括对环境和人类本身，极
大地阻碍了转基因作物商业化的进程。此外，这些
筛选标记的存在给基因聚合带来了巨大的困难。因
此，消除筛选标记成为了转基因技术应用的一大难
题。为了消除转基因作物中的筛选标记，一种全新
无筛选标记转基因作物的研究进展
陈扬勋  张治国  路铁刚
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 目前，大部分植物遗传转化都要使用选择标记基因，诸如抗生素、除草剂等来筛选转化子，由此而引起的转基因
生物安全性问题受到了人们的关注。为了消除转基因作物中的筛选标记，一种全新的策略即无选择标记的转基因技术迅速发展起
来。该技术既能够减轻大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧，又能将多个基因逐个整合到同一作物以实现基因聚合。
因此这种新策略有着巨大的应用价值。对获得无筛选标记转基因作物的一些方法及其最新研究进展进行综述。
关键词 ： 筛选标记 位点特异性重组 转座子
Review of Marker-free Transgenic Crop
Chen Yangxun Zhang Zhiguo Lu Tiegang
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  Selectable marker genes（SMGs）based on antibiotic or herbicide resistance have been widely used to identify ‘true’
transformants. To release the public concerns for the bio-safety of SMGs，a new strategy has been developed to obtain marker-free transgenic
plants to eliminate the marker gene from the nuclear or chloroplast genome after selection. Marker-free transgenic crops have a lot of unique
advantage such as reducing the trepidations from the SMGs and transferring exogenous genes gradually into transgenic crops. In this review，
different approaches of marker-free transgenic method were discussed.
Key words:  Selectable marker genes（SMGs） Site-specific recombination Transposons
的策略即获取无选择标记的转基因技术迅速发展起
来。该技术一方面能够获得所需的转基因植株，另
一方面又能消除标记基因，因而受到了转基因作物
育种学家的推崇，成为现阶段转基因作物育种的主
要手段，极大地推动了转基因技术的发展。本文主
要对无标记转基因技术不同方法作一论述。
1 共转化-分离的方法（Co-transformation-
segregation method）
所谓的共转化（co-transformation）是指将不同
的外源基因分别构建到不同的载体或同一载体的不
同区段，将多种载体同时转入同一受体细胞，筛选
出共转化植株。它为无标记转基因技术提供了一种
可行的方法，分别将目的基因和筛选标记构建到不
同的载体上，通过共转化使其整合到植物基因组，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期2
由于自身不连锁，其可能整合到基因组的不同位点，
T2 便会出现彼此分离的植株［1］。通过适当的方法筛
选便可获得无筛选标记的转基因植株。该方法消除
筛选标记原理简单，而在具体使用过程中却有不同
的途径。
1.1 农杆菌介导的双T-DNA载体的共转化
农杆菌介导的共转化方法已经成功应用于筛选
标记的剔除。分别将含筛选标记基因和目的基因的
T-DNA 通过农杆菌介导转化。包含筛选标记（SMG）
和目的基因（GOI）的两个 T-DNA 既可以通过单一
农杆菌株转化［2］，也可以通过不同的农杆菌株转
化［3］。当然，两个 T-DNA 也可以整合到同一质粒载
体实现共转化［4］，这些策略原理相同，但使用效果
却千差万别。
1.1.1 单菌法 单菌法是指分别将含有目的基因和
筛选标记的两个 T-DNA 构建到不同或同一载体上，
导入同一农杆菌细胞并转化。根据所用载体数目的
不同又有不同的策略。
1.1.1.1 双 载 体 - 单 菌 株 转 化 所 用 的 农 杆 菌 细
胞含有两个载体，分别携带目的基因和筛选标记。
Daley 等［2］利用此方法获得了无筛选标记的转基因
油菜和烟草，其共转化效率都在 50% 以上，且大部
分整合基因组的不同位点。Miller 等［5］利用此方法
转化玉米，共转化效率高达 90%。可见，此方法获
得共转化的效率非常高。
1.1.1.2 单载体（双 T 载体）- 单菌株 转化所用的
农杆菌仅含有 1 个载体，其中包含有目的基因和筛
选标记的不同 T-DNA 区。Mattews 等［4］利用此方法
转化大麦，共转化效率高达 66%，而其中 25% 的共
转化植株后代出现了分离。
1.1.2 混菌法 混菌法是将含有目的基因和筛选标
记的两个 T-DNA 构建到不同的载体上并导入到不同
的农杆菌细胞，将这些农杆菌以一定的比例混合转
化。这种转化方法的转化效率与菌液的配比有关。
Park 等［6］以不同的比例混合菌液并转化烟草，获得
共转化植株的比率差异显著（0-54%）。此外，混合
菌株的特性也影响共转化的效率。陆美芳等［7］将两
个双元载体分别导入到 EHA105-AGL-1、EHA105 和
EHA105-LBA4404 中检测其共转化效率，结果发现
前两组的共转化效率相当且明显高于第三组，推测
可能的原因为 EHA105 和 AGL-1 的特性比较接近。
研究表明，混菌法共转化效率较单菌法低，而
其中又以双 T 载体的转化效果为最好。Miller 等［5］
在玉米中比较了上述 3 种策略，发现共转化的效率
分别为 93.4%、98.2% 和 11.7%。Chen 等［8］在比较
了混菌法与双 T 载体之后也得出相似的结论。但由
于载体容量和酶切位点的限制，双 T 载体构建的难
度很大，尤其是对大片段的目的基因。
共转化方法获得无筛选标价转基因植株见图 1。
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MFTPs（marker-free transgenic plants）：无筛选标记转基因植株
图 1 共转化方法获得无筛选标记转基因植株
1.2 基因枪介导的共转化方法
利用基因枪进行共转化一直不被人们重视，主
要是人们认为基因枪介导的双元载体的共转化形成
单一位点重组，造成目的基因和筛选标记连锁，后
代得不到分离的植株。此外，基因枪轰击所形成的
多拷贝问题也一直被人们所诟病。然而，利用基因
枪进行共转化获得无筛选标记的转基因植物也有报
道，Rooke 等［9］利用该方法成功地获得了无筛选标
记的转基因小麦，而 Romano 等［10］也用此方法获得
无筛选标记的转基因马铃薯，并且证明了这种共转
化是相互独立的。Fu 等［11］证明了利用完整表达盒
（cassette DNA）替代完整的载体能够避免双元载体
中单一位点重组带来的连锁，而 Lowe［12］证实如果
利用有限量的 DNA 能够避免基因枪轰击所形成的多
拷贝的问题。Shiva Prakash 等［13］利用两个完整的表
达盒（NPT 和 GUS 基因），且在适量的 GUS 基因表
达盒联合轰击玉米，获得了大量单拷贝的无筛选标
记的转基因玉米。这种技术没有载体，不会出现多
余的载体骨架，而这种骨架也被证实能够高效的整
合植物基因组。
由于原理相对简单，共转化的方法现在已经成
2012年第12期 3陈扬勋等 ：无筛选标记转基因作物的研究进展
为获得无筛选标记转基因作物的主要方法。然而，
此种方法也有许多不足之处。首先，它是基于有性
繁殖以获得无筛选标记的转化子，这对多年生木本
植物和后代不育的作物不再适用 ；其次，共转化的
效率普遍不高，且周期长，这也对这种方法的应用
带来了不利的影响。
2 位点特异性重组系统（site-specific recom-
bination method）
位点特异性重组广泛应用于不同的转基因作物
以剔除筛选标记。这种方法包含两个模块 ：重组酶
和重组酶识别的短的 DNA 序列。这个短的 13 bp 左
右的序列能够专一的和 34 bp 的串联重复序列（靶
位点）配对并将其切除或使其反转，将筛选标记整
合到靶位点之间，重组酶能够专一的识别靶位点并
催化靶位点序列转移［14］。位点特异性重组系统，如
Cre/lox，FLP/FRT，R/RS 已经被广泛应用于转基因
作物中筛选标记的清除［15］，并且在特异位点的基因
整合也发挥了其优势［16］。在烟草、拟南芥和水稻
中［17］，这种系统获得的无筛选标记的转基因植株已
经有很多，它需要同一植物的再转化或遗传杂交。
此外，成功清除目标筛选标记基因后，重组酶基因
需要被分离出去，这是一个非常繁琐的过程。
2.1 Cre/loxP 位点特异重组系统
Cre/loxP 重组系统来源于噬菌体 P1，在植株中
应用非常广泛。cre 基因编码的重组酶 Cre 专一介导
了位于两个 34 bp 的 lpx 位点之间的序列重组［18］，
这种重组反应不需要额外因子的协助，并能将 lox
位点之间的 DNA 片段切除（图 2）。Dale 和 Ow 等［14］
证明了这种切除反应能够应用于转基因植物筛选标
记的切除。此后，这种方法在转基因烟草、拟南芥、
玉米、水稻和大豆中得以应用。尽管 Cre/loxP 位点
特异重组系统应用十分广泛，但是所用的策略却又
不太相同，根据 cre 基因表达的模式不同至少可以
分为 3 类。
第一种策略使 cre 基因组成型表达。将 cre 基
因连接到组成型启动子后构建到载体上，将其转化
含有 loxP 位点的转基因植株，或者先转化得到转基
因植株，再与含 loxP 位点的转基因植株杂交，通过
Cre 切除位于 loxP 位点之间的筛选标记，使筛选标
记与目的基因分离［19］。这种方法最先使用且重组效
率高，但费时费力。此外，组成性表达 Cre 重组酶
会引起植物一些遗传和农艺性状发生变化。
第二种策略是瞬时表达 Cre。现在可用的瞬时
表达载体有两种 ：农杆菌［20］和 Cre-病毒载体。这
种载体重组的效率与第一种相当，但是需要额外的
工作引入 Cre 重组酶和筛选重组细胞。最近，Kim 等［21］
将 Cre 基因连接到一个 -46 的 35S 启动子（Minimal
Promoter）下（-46∷Cre），这种启动子只含有 TATA
box 和转录起始位点，正常情况下，cre 基因不能表达，
但其整合到含有增强子元件的基因组时，-46 启动
子在增强子的作用下便能启动 Cre 重组酶瞬时表达，
从而切除 loxP 位点之间的序列。将其连接筛选标记
的下游后一起连接到 loxP 序列之间，loxP 的两侧分
别连接完整的 35S 启动子和 gus 基因。这种载体好
处在于大部分时间由于 Cre 基因不表达，而使筛选
标记在 35S 启动子下表达进行筛选，由于距离启动
子太远 gus 基因也不能表达。而当其整合到含有增
强子元件的基因组时，便会瞬时表达 Cre 重组酶从
而启动切除反应，使得 gus 基因表达。利用转化拟
南芥，在 T1 代获得了 10 个筛选标记切的转基因系，
在 T2 代中，每个转基因系后代出现的无筛选标记的
转基因植株超过 30%。这种方法操作简单，且缩短
了一个周期。
第三种策略是将 cre 基因连接到诱导性或组织
特异性启动子后，cre 基因只能在特定的条件下表达，
如热激活［22］或者化学物质刺激。这种策略存在着
一些不足，如特定背景激活、重组效率低和不完全
GOI loxP M loxP
GOI loxP
M
loxP
与携带Cre基因的载体共转化或者
与含有Cre基因的植株杂交
GOI（gene of interest）：目的基因 ；M（Marker）：筛选标记
图 2 位点特异性重组系统获得无筛选标记
转基因植株 -Cre/LoxP
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期4
切除等。近几年，大量的生育期特异启动子被应用
到该系统［23］，使上述问题得到了很好的解决。
2.2 FLP/FRT位点特异重组系统
FLP/FRT 位点特异性重组系统来源于酿酒酵
母。这种系统与 Cre/loxp 系统类似，在烟草、拟南
芥、玉米和水稻中都获得了成功。FLP 基因既可以
由 35S、玉米中分离的热诱导启动子启动，也可以
由玉米泛素化（Ubi）启动子启动。然而，在烟草
和拟南芥中，FLP 的介导的筛选标记基因的切除效
率却很低［24］。在水稻中，T-DNA 载体包含了 FRT-
nptⅡ-nosT-FRT 序列，Ubi 启动子和 gus 基因位于两
侧。当上述片段被切除时，gus 基因在 Ubi 启动子启
动表达。但在水稻中，大部分 FLP 基因表现出沉默
或表达受抑制，这使得 FRT 序列的切除效率相当低。
2.3 R/RS位点特异重组系统
R/RS 是从酵母中获得另外一种位点特异性重组
系统。重组酶基因切除与之相邻位于重组位点 RS 之
间的 DNA 片段。农杆菌转化时标记基因可以选择
ipt 或者 rol 基因配合 MAT 载体系统。iptV 基因编码
的异戊希基转移酶能够催化细胞分裂素的合成从而
导致多表皮毛，而 rol 基因会引起毛状根。Ebinuma
和 Komamine 等［25］报道了 ipt-MAT 载体系统通过一
步转化获得无筛选标记转基因水稻，选择标记 ipt 和
GFP 位于 RS 位点之间，而 npt Ⅱ、gus 和 hpt 等目
的基因位于 RS 区域外，他们获得大量的正常的转基
因水稻。Sugita 等［26］报道了两步法转化烟草，MAT
载体中 R 重组酶由来源于玉米的化学诱导启动子谷
胱甘肽 -s-转移酶（GST-Ⅱ-27）启动，转基因植株
培养添加外源除草剂的解毒剂 Safener R29148 即可
激活，R 重组酶的将筛选标记 ipt 切除，从而高效获
得无筛选标记的转基因植物（图 3）。经过二次筛选，
获得大量的单拷贝、无筛选标记且表型正常的植株。
一种通过 T-DNA 单边界携带 bi-功能的筛选标记的
载体，获得了无骨架的转基因番茄。这种载体名叫
PROGMO，只有一个单一的右边界，位于 RS 侧翼
的目的基因连接在一个由 codA 和 npt Ⅱ的融合标记
后。重组酶由位于目的基因下游的 35S 启动子启动，
转化过程中，整个载体整合到植物基因组。RS 位点
将除了目的基因的整个载体骨架切除，从而获得了
无骨架的转基因番茄。利用合适的诱导型启动子启
动重组酶的表达能够得到低拷贝的转化子。
3 利用转座子（Transposons）清除筛选标记
20 世纪 40 年代，Barbara McClintock 在研究玉
米籽粒颜色的时候取得了一个惊人的发现 ：在玉米
中存在两个能够使 DNA 转移的元件——位于 9 号染
色体断裂位点的 Ds 和一个遗传上不连锁的能够激活
染色体断裂的因子 Ac，而玉米籽粒颜色不稳定可能
是由 Ds 跳跃所引起的［28］。后来，人们把这些能够
跳跃的 DNA 片段命名为转座子。转座子用于清除筛
选标记主要包含以下步骤 ：（1）将筛选标记插入到
转座子内部 ；（2）与目的基因共转化 ；（3）筛选目
的基因和标记基因分离的植株。利用转座子消除筛
选标记基因最早在马铃薯中获得成功［29］。此后，在
水稻中利用类似的方法获得了转 cry1B 的无标记转
基因水稻［30］。然而，这种方法不适用于营养生殖的
植物，也无法实现当下比较热门的多基因聚合。此
外，不同的物种转座的效率不同，大部分植物中存
许多这样的转座子，从而导致转座的效率普遍低下。
转座的不精确切除和杂交、后代转化子的筛选时大
量耗时耗力也大大降低人们对该方法的热情。并且，
由于转座可能导致后代出现突变也使该方法逐渐淡
出了人们的视野。
4 染色体重组（Intrachromosomal recombi-
nation）消除筛选标记
染色体重组消除筛选标记是位点特异性重组的
一个变种。它通过基因工程的方法将重组位点整合
到植物基因组，却不需要重组酶的表达。重组位点
序列如果来源于噬菌体则称之为 POP’或者 attP，
如果来源于细菌则称之为 BOB’或者 attB［30］。在
植物体内，如果将筛选标记整合到 attP 的两个直接
重复序列之间，就会自发的产生染色体内部重组切
RS RS
GSTP R T
35P GUS T
ཆⓀ␫࣐Safener࠷䲔ㆋ䘹ḷ䇠
P. 启动子 ；T. 终止序列 ；R. R 重组酶基因 ；GSTP. GST-II-27 启动子
图 3 R/RS-MAT 载体系统获得无筛选标记转基因植株
除了上述几种无筛选标记的转基因策略外，一
些其他的方法证明也能够适用。Kondrak 等［27］利用
2012年第12期 5陈扬勋等 ：无筛选标记转基因作物的研究进展
除筛选标记。由于 attP 位点序列富含 A+T，因此
推测它能够激活重组反应［31］。此外，引入双链断
裂［double-strand breaks（DSBs）］能够形成重组热
点［32］，但也会降低后续转基因序列的稳定性。由
酿酒酵母线粒体内含子编码的归巢内切酶 I-SceI 能
够引起高达 33% 的位点特异性重组效率，它使 DSB
介导的特异性重组酶切除筛选标记成为可能［33］。
在 attP 序列下游引入来源于矮牵牛的转化激活序
列［transformation booster sequence（TBS）］，在矮牵牛、
烟草和玉米中大大提高了染色体内部重组和无规则
重组效率［34］。这种方法的潜在优点在于 ：所利用的
是植物体内存在的重组酶系统，不需要外源表达重
组酶，且对无性生殖的作物也适用，重组的效率与
重组片段的大小成正相关［35］。
5 清除叶绿体筛选标记
叶绿体和质体繁殖不依赖于植物本身基因组的
复制。质体因其遗传上独特的优势而被用于基因工
程中。如母系遗传、高水平的蛋白表达、不会通过
花粉管传播、蛋白的高表达及不会出现基因沉默［36］
等。尽管质体基因在植物中是母系遗传，筛选标记
传播到野生型植物［37］或者微生物［38］中的可能性还
是存在［39］。同源重组［40］、位点特异性重组（Cre/lox
系统）或重组酶瞬时表达［41］等都可以应用到叶绿
体筛选标记的切除。叶绿体的载体一般基于同源重
组构建，即在目的基因或者筛选标记的两侧构建同
源重组序列，然后在重组酶的作用下将目的基因或
者筛选标记整合到叶绿体基因组。因此，这种方法
既可以将标记基因整合基因组上，也可以从基因组
上移除标记基因。此方法在烟草、棉花、大豆和花
椰菜中都获得成功。最近，利用同一标记基因成功
实现再次转化充分证明除了高拷贝的叶绿体基因，
所有拷贝的筛选标记都能够通过同源重组切除。
6 直接获取无筛选标记的转基因植株
直接利用不含筛选标记载体的转化植物获得无
筛选标记的转基因作物已经获得成功。De Vetten 等
利用不含筛选标记的载体转化番茄［42］，其转化效率
为 0.8%-5.6%，且嵌合体发生的频率非常低。Jia 等［43］
通过叶盘法将不含筛选标记的载体转化烟草，转化
效率达到了 15%，Ahmad 等［44］利用逆境诱导型启
动子 SWPA2 启动豌豆 Cu/Zn SOD 和 APX 转化番茄
叶绿体以增强植物的抗氧化能力，通过基因枪直接
转化，其效率达到 6.25%。此种方法在苜蓿幼苗也
成功得到应用［45］。最近，利用没有筛选标记的质粒
载体 pCAMBIA2300 将玉米基因 Zmpsy1 和水稻 Rchit
基因转化花生，其效率达到 75%［46］。另一篇报道显
示也获得了直接转化的转基因苹果。但嵌合体的存
在是利用此方法遇到的最大的技术难题［47］。尽管这
种方法原理十分简单，但是筛选过程却耗时耗力。
7 展望
随着烟草、水稻、玉米等作物转基因技术的日
渐成熟，转基因的安全性成为了转基因作物商业化
最大的障碍，这种安全性主要包括外源基因本身对
生物和环境的危害性和残留的筛选标记对生物和环
境的危害性。如何降低转基因技术中有毒害的或者
尚不明确的外源基因的残留成为了转基因技术研究
的热点。
共转化、位点特异性重组和转座等方法已经能
够成功的将核基因和叶绿体基因组中的筛选标记清
除。现存的各种筛选标记清除方法不仅在烟草和其
他一些作物中得到了优化，而且在一些较难转化的
作物中也获得了成功。尽管共转化方法简单且高效，
但 Cre/loxP 似乎更具发展潜力，因其对有性生殖和
营养生殖的作物都适用。尽管各种方法清除筛选标
记的效率越来越高，但到目前为止还没有一种方法
能够高效而简洁的清除所有的作物的筛选标记。
另外一种可行的方法就是通过来源于植物或其
他物种的非致死的筛选标记替代致死的筛选标记筛
选转化子。这种筛选标记被称为第二代筛选标记，
如 M6PR、NiR 和 manA 等，据报道这些标记基因不
会给转基因作物的安全释放带来影响。这些筛选标
记中，manA 的应用最为成功。由于 manA 来源于大
肠杆菌，在植物中可以用植物来源的 M6PR 替代。
从水稻中分离的 NiR 也与之类似，由于它整合水稻
基因组非常方便，为一些转化存在困难的水稻品种
提供了一种新的思路，同时也加速了转基因水稻的
商业化进程。
确切地说，无论是清除转基因作物中的筛选标
记，还是用非致死的筛选标记替代，无筛选标记转
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期6
基因技术还只是停留在试验摸索阶段，二者都有一
些细节需要改进和完善。因为到目前为止，还没有
一种无筛选标记的转基因作物商业化。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）