全 文 ：《生命的化学 》 20 2年 2卷 6期
文章编号 : l O0 (卜 23 3 6( 2伪 2)0 6习 5 5 5很
芸 蔓 属 作 物 的 遗 传 转 化
钟 军 李 构 官春云
湖南农业大学油料作物研究所 1 40 1 2助
摘要 :本文论述了用于芸荃作物转化的各种受体组 织的优缺点 、 转化筛选标记 、 转化方法的特点以
及转化的基因在转基因芸鳌作物农艺性状改良中所发挥的作用 ,在此基础 上综述 了芸荃属作物遗
传转化的研究成果与进展 。
关键词 :芸釜属 ; 转化受体 ;筛选标记 ;转化方 法
中图分类号 : 7Q 86
芸蔓属作物属于婴粟目 、 十字花科植物 ,
大约有 10 个种 ,其中包括许多重要的油料 、
饲料和蔬菜作物 。 应用常规方法进行作物育
种已经取得了很大成功 , 然而它能够利用 的
种质资源非常有限 。 随着 DN A 重组技术和
植物遗传转化技术的发展 , 可以将特定的 、不
同来源的基因导人到植物细胞使其定向而稳
定地遗传 ,能充分利用 自然界不同种质资源
来改良农作物以满足农业生产的需求 , 这是
常规遗传育种方法所不能比拟的。 近几年 ,
芸蔓属作物的遗传转化及其利用有 了新的进
展 ,本文从芸蔓属作物遗传转化受体组织 、筛
选标记和转化方法及应用等方面作简要的综
合评述 。
1
. 转化受体
芸蔓属作物的遗传转化大多数以甘蓝型
油菜为材料 , 但也在花椰菜和黑芥中得到了
转基因植株 , 在白菜型油菜和芜著中得到了
转化的愈伤组织川 。 遗传转化受体主要包
括无菌苗的叶片 、 下胚轴 、 子叶 、根 、茎的皮层
组织 、 叶柄 、花粉和合子胚等 。 用叶片转化能
从一株植株上获得大量原生质体 ,但其缺点
收稿 日期 : 2 0 2习 9刀2
作者简介 : 钟军 , 女 , 博士研究生 ,研究方向 : 分子遗传
是 : 1) 芸蔓属植物的叶片对根癌农杆菌一般
比较敏感 , 感染后不容易得到存活的组织 ;
2 ) 叶片原生质体生长慢 , 容易出现褐 化现
象 ; 3) 叶片原生质体的活性受植株的生长环
境影响比较大 。 下胚轴是较好的受体 , 具有
分裂快 、 分裂频率 高和再生 能力 强 的优
点仁’ 了 ,但需大量的小苗而且群体的遗传异质
性较高 ,不适于在同质性要求很高的情况小
使用 。 用子叶和根做材料也存在与下胚轴同
样的问题 。 觅 im a s z e w s k a [ ’ 〕等发现用皮层组
织做材料不需要对受体植株的生长条件进行
特殊的控制 , 而且转化频率也较高 ,但缺点是
在转化受体之前需要进行预培养 , 取材也受
到季节的限制 。 罗科等发现叶柄的再生能力
较高 , 而且遗传上同质的试管苗可以通过无
性繁殖而大量 获得 ,试管苗叶柄即综合了叶
片和下胚轴的优点 ,又克服了它们的缺点 ,是
一种很好的受体材料川 。 M ol on ey 等发现芸
蔓属作物种子萌发后 ,切取 1一Z m m 子叶柄的
子叶 ,子叶柄末端切处的细胞不但再生能力
强 ,而且容易被农杆菌感染和转化 [ 4〕 ;程振
东等川的研究证实了这一点 。 19 92 年李仕
琼等〔“ 〕用甘蓝型油菜花粉为受体材料 , 但未
得到再生植株 。
用以上外植体为受体材料进行遗传转化
比较简便 、快速 。 但由于它们是多细胞结构 ,
再生植株可能是嵌合体 ;而且它们一般是二
倍体 ,外源基因同时整合到同源染色体相同
《生命的化学 》 2 02年 2卷 6期
座位的可能性较小 , 因而 ,转化植株常常是杂
合体 ,后代会发生分离 。 用原生质体转化可
克服第一个缺点 ,此外 ,原生质体还能克服细
胞之间的不亲和 ,便于进行各种远缘种 间的
杂交 。 李 昌功 仁8 〕等用青菜花粉原生质体与
甘蓝型油菜下胚轴原生质体融合得到了再生
植株 ; M en cz el 止” : 用甘蓝型油菜与经 x 一射线照
射过的细胞质雄性不育的甘蓝型油菜原生质
体融合 ,得到 了一株雄性不育种 。 小抱子同
时具备单细胞和单倍体两个特性 ,用它做受
体材 料 可 同时 克 服 以 上 两个 缺 点 。 自
L ict ht .er
’ 0 韭首次从甘蓝 型油菜小抱子培养获
得胚状体以后 , 已相继在甘蓝 、 白菜和芥菜等
芸墓属作物上获得成功 ,并被用于种 间杂种
的研究 。 F uk uo ak 等对油菜小抱子转基因 0R
和 R l 植株外源基因的性状表现和 DN A 进行
分析 ,结果表 明其 R。 植株外源基因是纯合
的 ,后代 R , 植株性状不分离 。 目前甘蓝型油
菜的小抱子培养技术已经建立并完善 , 但其
它芸蔓属作物小抱子培养技术还不成熟 , 原
因是用小抱子做转化受体存在感受态差和不
易再生苗的问题 ,转化较困难 。
2
. 筛选标记
在芸墓属遗传转化中最常用的筛选标记
基因是新霉素磷酸转移酶基因 ( N rP n ) 、 潮
霉素磷酸转移酶基因和二氢 叶酸还 原酶基
因 ,它们分别可以转化细胞产生对卡那霉素 、
G礴 18 和 巴龙霉素等氨基糖昔类物质的抗
性 。 由于这些筛选基因的结构 、功能和特性
已研究得较透彻且这类基因较小 ,容易进行
体外操作 ,可将它们与许多抗生素基因及 目
的基因连接在一起 , 因而被用来做筛选标记 。
对其它科属的作物 , 氯霉素乙酞转移酶
基因 ( C A )T 是一个很好的标记基因 , 但在芸
墓属作物中 ,它不能作为筛选基因 , 因为芸墓
属作物 中含有较高的 内源 C A T 活性水平 。
c ha er st 等〔7 发现芥菜和甘蓝型油菜含有针
对外源基因表达产生 的 C A T 转移酶选择性
抑制剂 ,这使 C A T 基因的应用受到了很大的
影响 。 D e B l o e k 等 [ ’ 。 j在对 N叮 n做筛选标记
检测 中发现 ,在油菜转化植株中 ,虽有 N PT n
基因的整合 ,但表达水平低 ,而且凡此基因在
35 5 启动子 、 NO S 启动子和 R B C S 启动子控
制之下 ,均表现出低水平的表达 。 出现这种
现象的原因还不 十分清楚 , 基因的甲基化可
能是原 因之一 。 此外 , 在用 卡那霉素筛选
N rP n 时 , 随着植物材料和转化方法 的不同 ,
卡那霉素筛选的效果也有较大的差异 。
3
. 转化方法
3
.
1 农杆菌介导的基因转移 农杆菌介
导的基因转移因无需以原生质作 目的基因的
受体 ,而使其操作简便易行 , 得到 了普遍 应
用 。 常用于植物遗传转化的农杆菌有发根农
杆菌和根癌农杆菌 , 其中根癌农杆菌感染芸
墓属作物时可在被感染的伤 口附近形成冠瘦
瘤 ,而发根农杆菌在感染时则产生发根状 。
利用农杆菌介导的基因转化方法有 三
种 : l) 直接用农杆菌感染芸墓属 作物的伤
口 。 将新鲜萌发的种子用刀切出一个伤 口 ,
接种上农杆菌 , 经过 3石 周切 下伤 口表面的
肿瘤 ,在无激素的培养基上培养 ,就可诱导出
再生转基因植株 ; 2) 原生质体与根癌农杆菌
共培养 。 当原生质体再生出细胞壁进行分裂
时 ,用农杆菌感染原生质体并共培养 24 4 0
小时 ,然后将原生质体转移到选择性培养基
上 ,并诱导愈伤组 织 ; 3) 叶盘转化法 。 从新
鲜的叶片上用打孔器取下 3 一s m m 的叶盘 , 加
人农杆菌并摇动 , 以保证切 口处感染农杆菌 ,
然后将叶盘转移到培养基上培养 2 天后再将
其转移到有卡那霉素诱导 的分化培养基上 ,
待长出苗后 ,再将其转移到含抗菌素的选择
性培养基上 , 使转化细胞直接再生 为植株 。
郭学兰〔” 〕将玉米转座子基因借助于根癌农
杆菌介导人甘蓝型油菜 W es at r 的具柄子 叶
中 ,得到了转基因植株 ;蓝海燕 ￡’ 4 了利用农杆
菌介导法将真菌基因导人甘蓝 型油菜品种
1H 65 中 , 得到 了抗卡那霉素的再生 植株 ;
rG iso
n 〔” 〕等将几丁质酶基因导入油菜中 , 表
《生命的化学》 2 02年 2卷 6期
现出对菌核病的明显抗性 。 芸墓属作物虽是
农杆菌的 良好寄主 ,但对于某些物种 (如花
椰菜 ) ,不同类型 的农杆菌对其转化菌株的
能力差异较大 ,这种差异可能是由于质粒上
V I R 区的功能所决定的 。 利用农杆菌与外植
体共培养进行的遗传转化 ,应注意加人农杆
菌的最佳时间随物种的不同而有所差异 , 甘
蓝型油菜在原生质体开始培养的第三天加人
农杆菌效果最好 , 花椰菜则以原生质刚培养
时加人最好 。
发根农杆菌在作物遗传转化方面的优点
是 : l) 用 其质粒做基因载体时 , 从转化的作
物细胞上很容易产生再生植株 ; 2) 发根农杆
菌转化的作物产生 的毛根来源于 同一个细
胞 ,不存在嵌合体现象 ; 3) 由发根农杆菌质
粒转化产生的毛根分化为正常植株的分化率
较高 ,倍性稳定 ,并且容易建立一系列能够在
不同作物细胞核染色体上插入一个 T 一D N A
拷贝 。 何玉科 〔川 等用发根农杆菌 LB 9A 4 02
的遗传转化作用 , 从甘蓝下胚轴诱导含其 T -
D N A 的 转化根 , 并且再生 出小植株 ; 黄菊
辉 [” 〕用发根农杆菌质粒的 T 一D N A 区对茎用
芥菜进行转化 ,也获得了转化植株 。
3
.
2 基因直接转移 基因直接转移不受
宿主范围的限制 , 易摄人外源 D N A , 转化频
率高 ,便于选择转化体 , 可以避免嵌合体的生
成 ,而且也不需要使用特定的载体 。 在芸蔓
属作物的甘蓝型油菜 、 黑芥和芜著上取得了
成功「’ “ } 。 PE G 法是将原生质体悬浮于含质
粒 DN A 的 PE G 中 , 由于渗透压的作用 ,质粒
DN A 透过原生质体膜进人细胞内并随机整
合到在作物基因组中 , 经原生质体再生完整
的植株 。 用 P E G 法 已从甘蓝型油菜原生质
体再生了转基因植株 ,从黑芥和芜著原生质
体转化了愈伤组织 。 有些学者发现如果在转
化处理后用低剂量 的 X 一射线照射原生质体
可 以把转化频率提高 3石 倍而不影响细胞克
隆的形成和植株的再生能力 。
电击法是利用短暂的电场脉冲增加原生
质体膜的透性 , 使 DN A 进入转化受体内 。
Gue cr h 等用电击法转化了 4 x lo “ 个原生质
体 ,筛选到了 21 个克隆 ,转化植株形态和育
性都完全正常 ;如果在培养基中加人细胞抑
制剂 ,能使细胞处于原生质体状态 ,培养几天
后再进行转化 , 其转化效率比立即转化 的可
以提高 10 0 倍 。
显微注射法不受细胞壁 的限制 , 转化频
率也比较高并且不需要特定 的选 择 系统 。
eR ic h 等在无选择压力的情况下得到了愈伤
组织转化占 57 石 6% 。 N eu h au s 把外源基因
注射到花粉胚的每个细胞中 , 再生植株中有
一半被转化了 。 此法 的成功 , 为将 NPT n 基
因注射到油菜小抱子而来的细胞的体细胞中
奠定了基础 ,经注射过的小抱子有 2 7 一51 % 生
长成为转基因植株 。
由美国 C o m el l 大学 的 aS fon dr 等人研制
的基因枪法是利用高速微弹将核酸转移到完
整植物细胞的转化技术 。 采用此法进行遗传
转化 ,不但没有宿主的限制 ,而且受体类型也
很广泛 , 几乎所有具有分生能力 的组织或细
胞都可用基因枪加以轰击 。 W eb er 等用基因
枪法在甘蓝型油菜的细胞壁 、 细胞膜和叶绿
体膜上穿击了一个小孔 , 外源 D N A 由此流入
到细胞内部 , 而且对细胞的分裂能力和叶绿
体的光合作用能力影响较小 。
4
. 应用
4
,
1 杭病 虫 几丁质和 压 1 , 3 一葡聚糖昔
是菌核病病原菌的主要组成成分 ,而几丁质
酶和 p一 1 , 3 一葡聚糖昔酶可催化几丁质和 p -
1
,
3
一葡聚糖昔的水解 ,致使病原菌死亡 ,而且
产生的细胞壁碎片具有诱导物的作用 , 从而
刺激寄主的抗病反应 。 所以人们试图将几丁
质酶和 p一1 , 3 一葡聚糖昔酶基因转人油菜品种
中来达到抗病的 目的 。 o p p e n h e im 仁` ,」等构建
了转几丁质酶基因的抗菌核病的油菜植株 。
G isr on[
` , 〕将几丁质酶基因通过农杆菌转人到
冬油菜品种 中 ,通过抗性鉴定 ,其抗病性显著
提高 。 B or isl e 〔“ 〕从菜豆中分离出几丁质酶
《生命的化学》2 02 年 2 卷 6期
基因 , 并将其与 C a M 35 S 启动子相连构建植
物表达载体转化油菜 , 结果转基因植株对菌
核病具有一定的抗性 ,几丁质酶表达量越高
其抗病性越强 。 蓝海燕利用农杆菌介导的转
化方法将抗菌核病的 汗1 , 3 一葡聚糖昔酶基因
导人油菜 ,获得了保持优良性状的抗菌核病的
转基因植株让’ 4 一 ,并进一步利用农杆菌转化法 ,
将组成型表达的 p 一 1 , 3一葡聚糖昔酶基因和几
丁质酶基因的双价植物表达载体转化甘蓝型
油菜得到了再生植株 〔’ 9几将大麦根草酸氧化
酶基因导人油菜后也可增强对草酸的耐病性 。
毒蛋 白基因 、 蛋白酶基因 、淀粉酶抑制基
因和植物外源凝集素类基因的表达产物具有
相当是杀虫性并具有一定的转化性 , 其中发
展最快的就是利用 Bt 基 因的完善和转化 。
目前已将此基因通过农杆菌质粒导人到植物
细胞中 , 并得到了抗虫的转基因植株 。 俄罗
斯植物生理研究所把 Bt 毒蛋 白基因导人到
油菜中 , 并用卡那霉素筛选出抗卡那霉素的
油菜苗 。 化学军将 Bt 毒蛋 白基因导人到花
椰菜中 , 得到了转基因愈伤组织及再生植株 ;
由湖南农业大学官春云主持的中国转 Bt 基
因抗虫油菜也诞生了 。
4
.
2 杭除草剂 目前 已知控制植物抗除
草剂性状的基因是单基因 ,所以利用遗传转
化技术转移抗除草剂基因比较容易 。 在这方
面的」 作进展也相对较快 , 可利用的基因有
草甘磷 、 草丁磷 、 磺酞脉类及咪哇酮类除草
剂 、澳苯睛 、 2 , 4 一D 等基因 。 现在 已经分离到
抗除草剂的 P盯 基因和 B A R 基因 , D B 等把
经过农杆菌介导的 P lyT 基因导到甘蓝型油
菜中 ,转基因植株对高剂量的除草剂具有抗
性 ;加拿大有 2 个抗草甘磷的转基因油菜品
系参加了 19 9 2 一 19 9 4 年加拿大油菜品种联合
试验 ;英国的抗除草剂 “ 工程基因油菜 ” 新品
种已经进人田间试验 ,能有效地除掉杂草而
作物不受影响 ;法国抗除草剂转基因油菜品
种也 已 经进 行试验性 种植 ; 抗镇草 宁 和
OX YN IL S 的转基因油菜品种于 19 98 年也实
现了商品化 。 据统计 ,大约 50 % 的转基因油
菜是抗除草剂的 。
4
.
3 改 良品质 利用基因工程改 良作物
品质是当前作物基因研究的热点 。 芸蔓属作
物的品质改良主要包括种子储藏蛋 白 、淀粉 、
油脂含量和组成 、 脂肪酸等方面 。 Rad ke 等
将外源种子储藏蛋 白基因 “ an p in ” 导入到甘
蓝型油菜中 ,获得了转基因植株 ;把巴西豆的
2S 种子储藏蛋白基因导入到甘蓝型油菜中 ,
提高了转基因油菜种子中甲硫氨酸的含量 ,
其编码的富甲硫氨酸的蛋白质在转基因油菜
中的含量 占总蛋白质的 2 4 % ; D o w en y 利用
转基因技术 , 在甘蓝型油菜中导人 了油脂合
成的关键酶 一丙酮酸激酶基因 , 使油脂含量提
高了 2% , 目前已经有经油脂改 良的转基因
油菜在美国获得了商业化生产许可 ;将月桂
酸酞基载体蛋白去饱和酶的反义基因导入到
油菜中 ,在种子检验中 , 月桂酸 的含量提高
了 ;陈锦青等构建立 了反义 P E G 基因 ,利用
农杆菌介导法将反 义 PE G 基因导人油菜基
因组中 , 相继获得 了多批反义 PE G 基 因植
株 , 含油量高达 47 . 4 一52 . 8% 。
4
.
4 雄性不育性的利 用 利用转基因对
芸蔓属雄性不育性 的利用多采 用启动子 与
RN A 酶基因构建嵌合基因这一策略而实现
的 。 19 9 0 年 , M a ir an i 利用烟草花药绒毡层特
异启动 子 T2A 9 与芽胞杆菌 RN A 酶 ( ha r -
an se )基因构建嵌合基因 ,并使该嵌合基因经
农杆菌介导转化 到甘蓝 型 油 菜 中 , 由 于
T A 29
一
ba m as
e 基因在绒毡层中特异表达 , 选
择性地破坏了花药绒毡层组织 , 导致花粉发
育不正常而使植株表现出不育 , 从而获得转
基因植株的不育系 。 为了实现在油菜花药中
特异表达芽胞杆菌 RN A 酶抑制剂 ( ha sr at r )
基因来获得不育系的恢复系 , 他们又克隆了
b a sr at r 基因并与 T 2A 9 基因构建了 T A 2 9 一b ar -
n as e 嵌合基因的恢复基因 T 2A 9 一b ar st a : ,将此
基因转化油菜使不育系的不育性得到恢复 。
将这种纯的可育转基因植株和转基因不育系
《生命的化学》2 02 年2 卷 6期
文章编号: 1 0 0 0 一1 3 3 6(2 )( X2 )0 6一5 5 9刀3
细胞生长的中心调控因子— 纳 巴霉素靶
赵咏梅 刘 奕 于秉治
( 中国医科大学基础医学院生物化学教研室 ,沈阳 H (X K) 1 )
摘要 : 细胞生长和细胞增殖是不 同的而又相互联系的过程 , 二者共同作用引起器官 、个体或肿瘤的
发生 。 细胞周期蛋 白依赖性激酶 ( cy d i n 一de eP n de nt k ina se s , CD sK ) 是细胞增殖的中心调控因子 。 最
近的研究认为 , 纳巴霉素靶 ( the at gr et of arP a m yc in , T O R )通过调节翻译 、 转录等过程调控细胞生长 ,
是细胞生长的中心调 控因子 。
关键词 :纳 巴霉素靶 ; 细胞生长 ;转录 ;翻译
中图分类号 : Q591 . 2 ; 2Q 53
收稿 日期 : 2 0 2习9刀 8
作者简介 : 赵咏梅 ( 197 0一 ) , 女 , 在职博士研究生 , 沈
阳军区总 医院心内科 , 主治医师 ; 于秉治 ( 194 4 一 ) , 男 ,
博士生导师 , 教授。
7 0 年代末 , H art w el 首先提出细胞生长
和细胞增殖间的区别 。 增殖是细胞不断分裂
的过程 ,导致细胞数 目增加 。 而生长是生物
大分子蓄积的过程 , 导致细胞体积或重量增
加 。 近年来科学家对细胞增殖及细胞周期调
控进行了广泛而深人的研究 ,但却忽视了对
细胞生长及其机制的研究 ,有时甚至将二者
,J .
I
,
le几r es.J
34567910仁[[[
叫l5[]
进行杂交 ,结果 F , 代植株全部恢复了育性 。
这是因为 T A 2 9 一 b a rn a s e 基 因和 T A 2 9 一 b a r s ta r
基因同时在 F , 代植株的花药绒毡层中特异
表达 ,二者的产物结合成复合体 ,抑制了核酸
酶的活性 ,从而引起 lF 代植株恢复了育性 。
芸墓属作物遗传转化受多种因素的影
响 ,包括转化受体 、 筛选标记和转化方法等 。
目前 ,在芸蔓属作物遗传转化方面需待解决
的问题有 : l) 进一步提高再生频率 ; 2 ) 扩大
有用基因型的再生 ; 3 )加强对多基因控制的
性状方面的研究 。 随着分子生物学各领域的
不断发展和转基因技术的完善 , 相信在不久
的将来 ,芸墓属作物遗传转化技术将在农业
生产方面做出进一步贡献 。
[ 1 1 ]
[ 12〕
仁13」
[ 16 〕
仁17 ]参 考 文 献
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