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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):113-119
戊糖磷酸途径（Pentose phosphate pathway，PP-
P）是植物体中糖代谢的重要途径，其主要生理功能
是产生供还原性生物合成需要的 NADPH 以及可供
核酸代谢的磷酸戊糖［1-4］，一些中间产物则可参与
氨基酸和脂肪酸合成等［5，6］。已有研究表明，磷酸
戊糖途径与植物的生长发育、各类环境胁迫密切相
关［6-12］。葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate
dehydrogenase，G6PDH） 和 6-磷 酸 葡 萄 糖 脱 氢 酶
（6-phosphaogluconate dehydrogenase，6PGDH） 是 磷
酸戊糖途径的两个关键酶，广泛分布于高等植物的
胞质和质体中［6］。由于 G6PDH 和 6PGDH 是 PPP 的
限速酶而受到人们更多的研究，人们也常常通过对
收稿日期 ： 2014-09-12
基金项目 ：中国烟草总公司重点项目（110201302004），贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金（黔科合人字［2013］02 号），贵州省
科学技术基金项目（黔科合 J 字［2012］2256 号）
作者简介 ：林世锋，男，博士，副研究员，研究方向 ：烟草遗传育种与分子生物学 ；E-mail ：linshifeng1978@163.com
通讯作者 ：王仁刚，男，硕士，副研究员，研究方向 ：烟草遗传育种与分子生物学 ；E-mail ：rengangwang@126.com
烟草胞质 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及
表达分析
林世锋  付强  余婧  赵杰宏  任学良  王仁刚
（贵州省烟草科学研究院 烟草行业分子遗传重点实验室，贵阳 550081）
摘 要 ： 采用电子克隆的方法，结合 RT-PCR 和 SMART RACE 技术，首次从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆到 1 个胞质
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）基因的 cDNA 序列，命名为 Nt6PGDH（GenBank 登录号 ：KM211534）。该基因 cDNA 全长 1 932
bp，开放阅读框 1 455 bp，编码 484 个氨基酸，与番茄（Solanum lycopersicum）和马铃薯（Solanum tuberosum）的 6PGDH 氨基酸序
列一致性最高，为 95%。生物信息学分析表明，Nt6PGDH 氨基酸序列不存在信号肽和转运肽，无跨膜结构域，定位于细胞质。对
烟草不同发育时期 Nt6PGDH 基因的表达情况分析发现，Nt6PGDH 基因在烟草旺长期根、茎、叶中的表达量均高于苗期，并且在同
一发育时期，烟草根中表达量最强，茎次之，叶片最弱。
关键词 ： 烟草 ；胞质 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 ；基因克隆 ；表达分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.018
Cloning and Expression Analysis of Cytosolic 6-phosphogluconate
Dehydrogenase Gene in Tobacco（Nicotiana tabacum）
Lin Shifeng Fu Qiang Yu Jing Zhao Jiehong Ren Xueliang Wang Rengang
（Key Laboratory of Molecular Genetics，CNTC，Guizhou Academy of Tobacco Science，Guiyang 550081）
Abstract: A cDNA sequence of cytosolic 6-phosphogluconate dehydrogenase（6PGDH）gene was cloned from Nicotiana tabacum by
in silico cloning combined with RT-PCR and SMART RACE technologies, and designated as Nt6PGDH（Accession number KM211534）.
The full length of its cDNA sequence is 1 932 bp, with a 1 455 bp open reading frame, and the gene encoded a protein of 484 amino acids with
the sequence of highest identity, 95% as 6PGDH from Solanum lycopersicum and Solanum tuberosum. Bioinformatics analysis indicated that
Nt6PGDH had no signal peptide, no transit peptide and notrans-membrane domain, and it was located in cytoplasm. Gene expression analysis
showed that the expression levels of Nt6PGDH in roots, stems and leaves were higher at fast-growirg stage than at seedling stage. Moreover, at the
same developmental stage, the highest level of Nt6PGDH expression were in the roots, then in the stems, the lowest in the leaves.
Key words: Nicotiana tabacum ；cytosolic glucose-6-phosphate dehydrogenase ；gene cloning ；expression analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5114
这两个酶的研究来研究磷酸戊糖途径。据报道烟草
叶片受到马铃薯 Y 病毒侵染时，植物体内 G6PDH
与 6PGDH 的活性显著增强，而且质体中的 G6PDH
与 6PGDH 酶活性的增幅远大于胞质中两个酶活性的
增强，研究者认为 G6PDH 活性的增强可能受到某种
粗调节机制的调节［13］。目前，研究者已从烟草中克
隆到 G6PDH 基因的全长 cDNA 序列［14］，并进行了
相应的功能研究［15］，但对烟草中 6PGDH cDNA 序
列的克隆与分析还未见报道。为此，本研究利用生
物信息学方法，结合 RT-PCR 和 SMART RACE 技术，
对编码烟草 6PGDH 的 cDNA 全序列进行克隆 ；并运
用实时荧光定量 PCR 技术，对其在烟草组织中的表
达情况进行研究，以期为烟草 6PGDH 基因功能的深
入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
分 别 采 集 烟 草 栽 培 品 种 K326（Nicotiana
tabacum L. K326）生根期幼苗的根、茎、叶和芽组织，
液氮迅速冷冻，于 -80℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取与 cDNA 第一链的合成 所有植
物 材 料 RNA 采 用 Trizol Reagent（Invitrogen 公 司 ）
法提取总 RNA，并参照 TaKaRa 公司反转录试剂盒
说明书合成 cDNA 第一链。
1.2.2 Nt6PGDH 全长 cDNA 的克隆 以黄瓜 6PGDH
全 长 cDNA 序 列（ 登 录 号 ：FJ610345） 为 信 息 探
针，在 NCBI 烟草 EST 数据库中进行 BLAST 检索，
将检索到的来自烟草品种 K326 的全部 EST 序列利
用 DNAMAN6.0 软 件 进 行 拼 接， 获 得 1 个 重 叠 群
（Contig）。根据获得的重叠群设计合成 1 对 PCR 引
物 P-iF 和 P-iR，见表 1。以烟草品种 K326 cDNA 为
模板，进行 PCR 扩增，验证拼接结果。
根据验证得到的基因片段设计基因 3RACE 嵌
套引物和 5RACE 嵌套引物，使用 SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit（TaKaRa 公 司 ）， 按 照 说 明
书进行操作，RACE 扩增后分别获得基因的 3 端序
列和 5 端序列。利用 DNAMAN 软件组装以上序列，
获得全长 cDNA 序列信息，设计合成 1 对基因全长
表 1 引物序列及预期片段大小
扩增类别 引物名称 序列（5-3） 长度 /bp
Nt6PGDH 中间片段扩增
P-iF GCTTACATGGAGAAAGGAGACTGTATCATTG
436
P-iR TGATTTCAATCAAGAAGCTCAGAAGCTC
Nt6PGDH 3RACE P-3GSP ACATGCAGTTAATTGCAGAGGC
650
P-3NGSP TGTTGGCAAGCTCTCTAATGATG
Nt6PGDH 5RACE
P-5GSP CACTGTCGACTTGAGCTGCAAC
1180
P-5NGSP AAGATGTCCTCTATGTTCTTGTAGGC
Nt6PGDH 全长扩增
P-F ACCGCGTTTGACAAAAGGGGATTAG
1932
P-R GAGAAGTGCACATCATCATAGATTCATATTGC
Nt6PGDH RT-qPCR
P-rF AGTCTGCCTAGCTATCAACTCGG
199
P-rR TGACTGTCTCGCAATCTTGAAC
内参基因 RT-qPCR
Actin-rF CAAGGAAATCACCGCTTTGG
106
Actin-rR AAGGGATGCGAGGATGGA
引物 P-F 和 P-R，以合成的烟草品种 K326 cDNA 第
一链为模板，进行 PCR 扩增，获得烟草 6PGDH 的
全长 cDNA 序列。
1.2.3 Nt6PGDH 基因的生物信息学分析 应用 ORF
Finder（http ：//www. ncb.i nlm. nih.gov/gorf/gor.f html）
程序确定正确的开放阅读框（ORF）；通过 NCBI 上
的 BLAST（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
进行序列相似性检索 ；利用 ExPASy（http ：//web.
expasy.org/compute_pi/） 预 测 蛋 白 的 分 子 质 量 计 算
值 和 理 论 等 电 点 ；利 用 Smart（http ：//smart.embl-
heidelberg.de/）分析蛋白质结构域 ；信号肽、转运
肽和跨膜结构域分析分别由 SignalP 4.1、TargetP 1.1
2015,31(5) 115林世锋等：烟草胞质 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析
和 TMHMM Server v.2.0 在 线 程 序（http ：//www.cbs.
dtu.dk/services/）进行预测 ；亚细胞定位采用 PSORT
II Prediction（http ：//psort.hgc.jp/form.html） 进 行 分
析 ；用 ClustalX 2.0 和 MEGA4.0 软件 - 邻位相连法
（Neighbor-Joining）构建系统进化树。
1.2.4 Nt6PGDH 的 DNA 序 列 克 隆 采 用 CTAB 法
从新鲜幼嫩的烟草叶片中提取基因组 DNA。利用基
因全长引物进行扩增、克隆和测序。
1.2.5 实时荧光定量 PCR 根据 Nt6PGDH 的 cDNA
序列设计特异引物 P-rF 和 P-rR。选用烟草 Actin 基
因（NTU60495）为内参基因，并设计引物 Actin-rF
和 Actin-rR。利用 Taqman 探针试剂盒（TaKaRa 公
司）在 ABI Stepone Plus 实时荧光定量 PCR 仪上进
行 RT-qPCR 实验，分析 Nt6PGDH 在烟草不同组织
中的相对表达情况。
2 结果
2.1 Nt6PGDH基因的克隆
以烟草品种 K326 cDNA 为模板，用 P-iF 和 P-iR
为引物，进行烟草 6PGDH 基因中间片段的 PCR 扩
增和克隆测序（图 1）。由此设计合成 RACE 引物进
行扩增，获得该基因的 3 端和 5 端。通过测序拼
接，获得该基因的全长序列信息。经 ORF 搜索以及
其他植物来源 6PGDH 基因比对分析，确定该基因具
有完整的 ORF。根据全长基因拼接序列设计引物，
用 RT-PCR 方法，获得全长 cDNA 序列，将其命名
为 Nt6PGDH，GenBank 登录号为 KM211534（图 2）；
同时以烟草基因组 DNA 为模板扩增获得与 RT-PCR
扩增相同大小的序列，说明该基因内部无内含子。
2.2 Nt6PGDH基因的序列分析
Nt6PGDH 基 因 cDNA 全 长 1 932 bp（ 不 包 括
polyA 尾上 31 个连续的碱基 A），由 174 bp 的 5 端
非 翻 译 区（5-UTR）、1 455 bp 编 码 区 和 303 bp 的
3 端非翻译区（3-UTR）组成（图 2）。该序列可
编码 484 个氨基酸的蛋白质，预测蛋白分子质量约
为 53.30 kD，等电点为 5.70。SMART 分析表明，该
蛋白质 4-178 氨基酸位形成 6PGDH 的 NADP 结合
结 构 域（NAD binding domain of 6-phosphogluconate
dehydrogenase），其中氨基酸序列 GMGVSGGEEG 符
合高度保守的 NADP 结合位点序列 GXGXXGXXXG
（ 图 2）；182-476 氨 基 酸 位 为 6PGDH 的 C-末 端 结
构 域（6-phosphogluconate dehydrogenase，C-terminal
domain），其中氨基酸序列 VLDKTGMKGTGKW 与已
知的细菌、哺乳动物的 6PGDH 高度保守的底物结合
位 点 序 列 V/I/L/M-X-D-X-X-G/A-N/Q/S-K-G-T-G-X-W
相符，只是第 263 位氨基酸 M 替代了 N，这一变化
在植物界普遍发生。
2.3 信号肽、跨膜区及亚细胞定位预测分析
利 用 SignalP 4.1 Server 预 测 Nt6PGDH 蛋 白 不
具有信号肽。利用 TargetP 1.1 Server 预测，结果显
示 叶 绿 体 转 运 肽（chloroplast transit peptide，cTP）
为 0.023、 线 粒 体 信 号 肽（mitochondrial targeting
peptide，mTP）为 0.189、分泌通路信号肽（secretory
pathway signal peptide，SP）为 0.449、其他为 0.286。
利 用 TMHMM Server v.2.0 预 测 跨 膜 区， 结 果（ 图
3）显示 Nt6PGDH 蛋白没有跨膜区域。在线工具
PSORT II Prediction 预测该蛋白的亚细胞定位情况，
结果显示 Nt6PGDH 蛋白定位于细胞质中的概率达
52.2%，k 值达到 23。因此，Nt6PGDH 蛋白最可能
436
bp
M1 1
650
bp
M1 2
1180
bp
M1 3
1932
bp
M2 4
M1 ：TaKaRa DL2000 marker ；M2 ：TaKaRa DL5000 marker ；1 ：中间片段扩
增产物 ；2 ：3RACE 扩增产物 ；3 ：5RACE 扩增产物 ；4 ：全长 cDNA 扩增
产物
图 1 烟草 Nt6PGDH 基因的 PCR 扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5116
定位于细胞质中。
2.4 烟草与其他植物的6PGDH蛋白的同源性比较
经氨基酸序列同源检索，发现 Nt6PGDH 与已
知其他高等植物胞质 6PGDH 氨基酸序列一致性为
76%-95%， 其 中 与 番 茄（XP_004237068） 和 马 铃
薯（XP_006363551）基因一致性最高为 95%。进一
步利用 ClustalX 2.0 软件进行多重序列比对，并采
用 MEGA 4.1 软件构建系统进化树。结果（图 4）显
示，6PGDH 蛋白是一个比较古老的蛋白，在单子叶
植物和双子叶植物分化之前已经出现，并在单子叶
植物与双子叶植物形成过程中发生了分化。此外，
6PGDH 蛋白在番茄、马铃薯、黄瓜等植物中均以多
种形式存在，其中菠菜质体 6PGDH（AF295670）在
进化树中并未形成一个独立的分支，而与黄瓜、番
茄、马铃薯等胞质 6PGDH 聚在一起，这支持胞质和
质体 6PGDH 并非独立起源的观点。
1 DFFJFJWWWJDFDDDDJJJJDWWDJDFFJJWFWWFWDDDWWWJWWFWFWFFDWWFWFJDDJWDJWFWFDFWWFDDDFDJFFWWDJWWJDW
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1891 FFWWWJWWWWJFDDWDWJDDWFWDWJDWJDWJWJFDFWWFWFDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD
5 和 3 端非翻译区以小写字母表示，编码区以大写字母表示（上面为核苷酸序列，下面为氨基酸序列），终
止密码子以星号标识，阴影部分依次表示 NADP 结合位点和底物结合位点
图 2 烟草 Nt6PGDH 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸
0
50
transmembrane inside outside
100 150 250 350 450400300200
0.2
0.4
0.6
pr
ob
al
ity
0.8
1.0
1.2 仌㢢ḷ䇶㿱⭥ᆀ⡸
图 3 预测的 Nt6PGDH 蛋白的跨膜区
2015,31(5) 117林世锋等：烟草胞质 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆及表达分析
2.5 Nt6PGDH基因的时空表达模式分析
采用荧光定量 RT-PCR 法，对 Nt6PGDH 基因在
烟草不同发育时期的根、茎、叶中的表达进行相对
定量分析。图 5 显示，Nt6PGDH 在苗期和旺长期的
各组织中均有表达，以根的表达量为最高，旺长期
各组织的表达量均比苗期相同组织的表达量高。
通过氨基酸序列同源检索，结果显示烟草 Nt6PGDH
与已知其他高等植物 6PGDH 一致性都在 76% 以上 ；
系统进化树分析结果表明，烟草 Nt6PGDH 最先与
番茄、马铃薯等茄科植物 6PGDH 聚类，其次与大
豆、黄瓜等物种 6PGDH 聚类合并 ；用 SMART 软件
分析 Nt6PGDH 具有典型的 6PGDH 特征 ：含有一个
NADP 结合结构域和一个 C-末端结构域。上述分析
结果都表明 Nt6PGDH 为烟草 6PGDH 基因。植物中
6PGDH 存在两种形式，一种为存在于胞质中的胞质
6PGDH（cytosolic 6PGDH）；另一种为存在于质体基
质中的质体 6PGDH（plastidic 6PGDH），其中后者氨
基酸的 N 端显著长于前者，编码一个转运肽（transit
peptide）序列［6，7］。本研究克隆的 Nt6PGDH 编码
的氨基酸序列与菠菜胞质 6PGDH（AAK51690）、菠
菜质体 6PGDH（AF295670）的氨基酸一致性分别
为 90% 和 77%（资料未列出），而且与其他物种的
胞质 6PGDH 相类似氨基酸 N 端都缺少一段长度约
为 40 aa 的转运肽［16，17］，因此推测本研究克隆的
Nt6PGDH 编码的 6PGDH 为胞质 6PGDH。
戊糖磷酸途径是植物中重要的代谢途径，在植
⮚㤴XP_004237068傜䫳㯟XP_006363551
Nt6PGDH⮚㤴XP_004238989傜䫳㯟XP_006348606哴⬌XP_004141482བྷ䉶NP_001236726㨐㨌AAK51690≤にNP_001056586䉧ᆀXP_004971196⦹㊣NP_001104910䉧ᆀXP_004979278⦹㊣AFW60760≤にAAP33506㨐㨌AF295670⮚㤴XP_004252580傜䫳㯟XP_006360699བྷ䉶XP_003525354哴⬌XP_004149760哴⬌ACM6892783100
100
100
86
99
51
52
87
100
100
100
99
57
73
91
100
0.05
各种植物 CPI 序列均来自 GenBank 数据库，采用 Mega 4.0 软件（Neighbor-Joining 法）构建，图中各分支数值代表置信度（%）
图 4 植物胞质 6PGDH 的系统进化树
0
2
4
6
8
10
12
14
16 ṩ 㤾㓴㓷 ਦ⴨ሩ㺘䗮䟿% 㤇ᵏᰪ䮯ᵏ
图 5 Nt6PGDH 基因的时空表达特性
3 讨论
本研究首次报道了烟草 Nt6PGDH 基因的克隆。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5118
物的生长发育中起着非常重要的作用，不仅为生物
合成提供还原力 NADPH，为核酸的合成提供五碳
糖，还涉及到多种环境胁迫引起的植物应答反应，
其中 6PGDH 的活性或基因表达水平与各种逆境胁
迫以及淀粉的生物合成等过程有关［7-12］。Fahrendorf
等［18］在苜蓿中比较了胞质 6PGDH 基因在各个组
织中的表达，结果发现根中的表达量要高于叶，而
且胞质 6PGDH 在叶中的表达几乎无法检测。在大
豆根瘤中，存在高活性的 6PGDH 可能与嘧啶的合
成、酰脲的产生和氮的固定有关［19，20］。因此，胞质
6PGDH 在根中的大量转录表达可能与氮的吸收利用
有关。经表达谱分析发现，本实验克隆的 Nt6PGDH
在旺长期根、茎、叶的表达量均比苗期相同组织的
表达量高，其中在旺长期的根中表达量最高，这可
能是因为旺长期牵涉到大量的细胞分裂与生物合
成，而戊糖磷酸途径正为生物合成提供必要的还原
力 NADPH 和 供 DNA/RNA 合 成 所 必 须 的 五 碳 糖 ；
而根中的表达高于叶，也进一步验证本研究克隆的
Nt6PGDH 编码胞质 6PGDH。
4 结论
从 烟 草 中 克 隆 到 一 个 胞 质 6-磷 酸 葡 萄 糖 酸
脱 氢 酶 基 因， 命 名 为 Nt6PGDH， 基 因 登 录 号 为
KM211534。基因全长 1 932 bp，开放阅读框为 1 455
bp，编码 484 个氨基酸。Nt6PGDH 氨基酸序列不存
在信号肽和转运肽，无跨膜结构域，定位于细胞质。
Nt6PGDH 基因在烟草苗期和旺长期的根、茎、叶中
均有表达，其中在旺长期各组织中的表达量均高于
苗期，并且在同一发育时期，烟草根中表达量最强，
茎次之，叶片最弱。
参 考 文 献
［1］ Wood T. Distribution of the pentose phosphate pathway in living
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（责任编辑 李楠）