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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
马铃薯块茎既是无性繁殖的“种子”，也是产
量构成和营养储藏器官。块茎形成和发育是马铃薯
植株同化产物的利用及地下器官形态建成的复杂过
程，不同品种、不同生态环境条件下，块茎形态、
营养成分等各方面均表现出差异，成熟块茎大小相
收稿日期 ： 2014-04-08
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31060063，31260094），甘肃省自然科学基金项目（0803RJZA0510），甘肃省教育厅高校科研专项（1002-
07），甘肃省财政厅高校基本科研业务费
作者简介 ：平海涛，男，硕士研究生，研究方向 ：作物遗传育种 ；E-mail ：pinghaitaopht@163.com
通讯作者 ：王玉萍，女，副教授，作物遗传育种 ；E-mail ：wangyp@gsau.edu.cn
马铃薯块茎形成相关基因 STI-LIKE 在拟南芥植株
发育中的功能验证
平海涛1，2 王玉萍1，3 王东霞1 周晓洁1，2
（1. 甘肃省作物遗传改良与创新重点实验室 甘肃省干旱生境作物学国家重点实验室培育基地，兰州 730070 ；
2. 甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070 ；3. 甘肃农业大学园艺学院，兰州 730070）
摘 要 ： 马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种“大西洋”为试验材料，采用 RT-PCR
扩增获得马铃薯 STI-LIKE 基因全长片段。RT-PCR 定量分析表明，该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明
STI-LIKE 蛋白具有 3 个 TPR 结构域，在高等植物中具有高同源性，是一个普遍存在的蛋白质。为验证 STI-LIKE 蛋白在拟南芥植
株发育中功能，分别构建该基因强启动子表达载体（pBI121）和干扰载体（pHANNIBAL 和 pART27），转化拟南芥获得了两种载体
的拟南芥转基因植株，同时制备 STI-LIKE 蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明 STI-LIKE 基因可能参与拟南芥株型发
育过程。
关键词 ： 马铃薯 STI-LIKE 基因 TPR 结构域 株型发育
Functions of Potato Tuber Formation-related Gene STI-LIKE in
Phenotype of Arabidopsis thaliana
Ping Haitao1，2 Wang Yuping1，3 Wang Dongxia1 Zhou Xiaojie1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，
Lanzhou 730070 ；2. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ； 3. College of Horticulture,
Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070）
Abstract: A series of gene’s expression and silencing were involved in potato tuber formation. The full length of potato STI-LIKE
gene was cloned by using the RT-PCR（reverse transcription PCR）method from the potato variety “Atlantic”. The expression of STI-LIKE
gene in all potato organs were analyses by real time PCR analysis. The results showed that STI-LIKE gene expressed in all potato organs. The
bioinformatics analysis indicated that STI-LIKE protein contains three TPR domains, and the STI-LIKE gene was homologous recombination
in higher plants. The expression vector（pBI121）and interference vectors（pHANNIBAL and pART27）were constructed and transferred to
Arabidopsis thaliana. The STI-LIKE protein expression level was examined by Western blot with specific antibody. The results indicated that
STI-LIKE gene might be associated with the growth and development of seedling of Arabidopsis.
Key words: Potato STI-LIKE gene TPR domain Phenotype
差可达到 100 倍［1］。马铃薯块茎发育是在内源生长
调节物质和外部环境因素共同影响下相关基因在发
育过程中程序性表达的结果，涉及一系列基因的表
达与关闭［2-5］。研究表明，HSP17.7、CONSTANS 和
CDPK1［6-8］对马铃薯块茎的形成起调控作用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期120
拟南芥 STI-LIKE 蛋白含有 TPR 和 STI1 结构域。
TPR 结构域是一个由 34 个氨基酸重复的串联结构
单元，最初是在研究细胞分裂时发现的［9］。TPR 结
构域包含蛋白参与细胞周期、细胞应激、基因转录、
蛋白折叠和蛋白运输等一系列生理生化反应［10-12］。
一些 TPR 结构域包含蛋白可与 Hsp90 相互作用［13］，
起到信号传导作用。TPR 结构域介导蛋白的相互作
用和蛋白质复合体的组装［14］。STI 结构域是热激蛋
白结合结构域，存在于蛋白质 N 末端或 C 末端，介
导蛋白质和 HSP 蛋白相结合［15］。在高光和热激状
态下，拟南芥 STI 蛋白累积量迅速上升［16，17］。STI-
LIKE 同源蛋白 STI 磷酸化蛋白 2C 与细胞分裂激酶
呈负相关［15］。
在我们前期的研究中发现，STI-LIKE 蛋白在马
铃薯块茎的发育阶段中表达量呈上升趋势，推测其
可能在块茎发育中起关键作用［18］。由于 TPR 结构
域和 STI 结构域的功能及 STI-LIKE 蛋白在细胞周期
调控中的功能，推测 STI-LIKE 基因可能参与植株发
育过程的调控。本研究通过构建 STI-LIKE 干扰载体
和强启动子表达载体转化模式植物拟南芥，验证其
在拟南芥生长发育过程的功能，旨在分析 STI-LIKE
蛋白在植物发育中的功能。
1 材料与方法
1.1 材料
马铃薯普通栽培品种“大西洋”和拟南芥（生
态型 Columbia）由甘肃省作物遗传改良与创新重点
实验室提供。
KOD-Plus 高 保 真 酶、Target Clone-Plus- A 试
剂盒购自东洋纺公司，Trizol RNA 提取试剂盒购自
Invitrogen 公 司， 反 转 录 试 剂 盒 购 自 Thermo 公 司，
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司，T 载体 pMD19-T
购自宝生物工程有限公司，pET28 原核表达载体购
自 Novagen 公司，pHANNIBAL 和 pART 27 为实验室
保存质粒，其他试剂为国产试剂。
1.2 方法
1.2.1 基因的确定 前期在马铃薯块茎发育过程差
异蛋白质组研究中发现 STI-LIKE 蛋白在块茎发育过
程中表达丰度上升，可能参与马铃薯块茎的发育［18］。
根据 NCBI 的 EST 数据库确定了马铃薯 STI-LIKE 基
因的 CDS 序列。
1.2.2 RNA 提取与 cDNA 合成 按照 Trizol 试剂盒
的方法提取马铃薯块茎总 RNA，以总 RNA 为模板
按照 Thermo 反转录试剂盒的方法反转录合成第一链
cDNA。
1.2.3 引物设计与目的基因的克隆
1.2.3.1 引物 利用软件 DNAMAN 设计引物，由上
海生工合成。目的片段扩增引物 35sF 和 35sR ；以
RNAixbaF、RNAibamhR、RNAixhoF 和 RNAikpnR
为 RNAi 片段扩增引物 ；以 antibodyF 和 antibody 为
扩增引物制备抗原。
35sF ：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAGGCCA
AAGG，35sR：ttctcgagTTATCTAACTTGCACAATTCCT
GC ；
RNAixbaF ：aatctagaATGGCCGAAGAAGCTAAG
GCCAAAGG，RNAibamhR：aaggatccCTGTTGCAAATA
ACCCCTTGTACTCG ；
RNAixhoF ：aactcgagATGGCCGAAGAAGCTAAG
GCCAAAGG，RNAikpnR：aaggtaccCTGTTGCAAATAA
CCCCTTGTACTCG ；
AntibodyF：aactcgagAAAGATTGTGACACAGCTG-
TTG，AntibodyR ：aaggatccGAGTTCCTGATTCTGAG-
GATC。
1.2.3.2 STI-LIKE 基因目的片段扩增 以反转录合
成的 cDNA 为模板，利用 PCR 反应合成目的片段。
反应体系 50 μL、模板 2 μL，KOD-plus 0.5 μL、引物
（35sF，35sR）各 1 μL，buffer 5 μL，dNTP 4 μL，水
36.5 μL。反应条件 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性
30 s，55℃复性 15 s，68℃延伸 2.5 min 35 个循环。
RNAi 载体目的片段，抗体目的片段制备 PCR 延伸
时间为 1 min，其余反应体系与目的片段扩增一致。
扩增片段以 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后测序。
1.2.3.3 STI-LIKE 基因生物信息学分析 利用 NCBI
数据库和该网站提供的 blast 工具进行同源蛋白比对
分析（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。蛋白质结构域
由 NCBI 网站预测给出，蛋白质三级结构的预测利
用蛋白专家系统在线工具（http ：//www.expasy.org/）
完成。
1.2.3.4 STI-LIKE 基因过表达载体的构建 切胶回
收全长片段，酶切连接到 pBI121。质粒转化大肠杆
2014年第11期 121平海涛等：马铃薯块茎形成相关基因 STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证
菌 Top 10，挑取白斑克隆 PCR 鉴定，酶切验证。
1.2.3.5 STI-LIKE 基因 RNAi 载体构建 以酶 Xba I、
BamH I 和 Xhol I、Kpn I 分别双酶切目的片段。Xba I、
BamH I 和 Xhol I、Kpn I 分别先后双酶切 pHANNIB-
AL 载体，挑取白斑克隆 PCR 鉴定。将 pHANNIBAL
与 pART27 分 别 用 酶 Spe I 和 Not I 双 酶 切 后 将
pHANNIBAL 酶切片段连接到 pART27，挑取白斑克
隆 PCR 鉴定。
1.2.3.6 STI-LIKE 基因表达定量分析 分别提取马
铃薯块茎、茎、叶、匍匐茎和根的 RNA 并定量，并
使模板浓度一致，进行 RT-PCR 反应。反应体系，
100 ng 模板，上下游引物各 1 μL，buffer 5 μL，dNTP
4 μL，Taq 酶 0.5 μL，水 36.5 μL。反应条件 ：94℃
预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃复性 15 s，72℃
延伸 2.5 min，30 个循环。
1.2.3.7 STI-LIKE 抗原蛋白表达和纯化 对目的蛋
白进行同源比对，预测跨膜结构。选取无跨膜域片
段区作为抗体制备的抗原区段。以引物（Antibody
和 AntibodyR）扩增 cDNA，Xho Ⅰ和 BamH Ⅰ双酶
切目的片段与 pET28，连接并转化大肠杆菌。挑取
白斑克隆 PCR 鉴定提质粒，转化大肠杆菌 DE3，诱
导后蛋白过镍离子亲和交换柱纯化制备抗体。
1.2.4 拟南芥的遗传转化 拟南芥的遗传转化具体
方法参照杜培粉［19］进行，以 1/2MS+L77 培养基重
新悬浮利用花药侵染法侵染花蕾两次，收获的拟南
芥种子播种于含有 50 mg/L 卡那霉素的 1/2 MS 培养
基中，提取 12 d 未黄化的幼苗进行检测。
2 结果
2.1 RNA提取与目的基因克隆
马铃薯“大西洋”总 RNA 提取结果表明 RNA
（28S、18S、5S）完整无降解。合成总 cDNA 后稀释
100 倍，以引物（35sF，35sR）扩增得到目的片段
（图 1）。
2.2 生物信息学分析
同源比对的结果表明 STI-LIKE 只存在于高等植
物中，低等植物中没有同源蛋白（图 2）。同源性分
析还表明在高等植物中 STI-LIKE 保守性很高，并且
具有 3 个 TPR 结构域，其中一个 TPR 结构域靠近 N
末端，其它两个靠近 C 末端（图 3）。
28S
5000
bp bp
3000
2000 174018S
5S
图 1 马铃薯总 RNA 提取及目的基因 RT-PCR
Creinhar dtii
Ppatens
Gmax
Athaliana
Stuberosum
Osativa
Zmays
452
471
460
446
454
453
455
Creinhar dtii
Ppatens
Gmax
Athaliana
Stuberosum
Osativa
Zmays
296
316
305
291
299
298
300
Creinhar dtii
Ppatens
Gmax
Athaliana
Stuberosum
Osativa
Zmays
147
158
154
151
153
155
154
Creinhar dtii
Ppatens
Gmax
Athaliana
Stuberosum
Osativa
Zmays
1
1
1
1
1
1
1
图 2 马铃薯 STI-LIKE 蛋白同源性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期122
2.3 STI-LIKE基因过表达载体的构建
将目的片段连到载体后，挑去白斑克隆，酶切
检测目的片段（1 700 bp）并利用载体通用引物测序，
确定连入的目的片段无错配，转化农杆菌并侵染拟
南芥（图 4）。
最低（图 6）。
TPR_11
TPR_11
TPR superfamilyav
TPR
100 200 300 400 500 5801
Query seq.
Specific hits
Superfamilies
Multi-domains
TPR_12
TPR_11
TPR superfamilyav
TPR
TPR motif
TPR motifbinding surfaceTPR motif
binding surface binding surface
TPR_11
STI1
STI1 super
TPR_11
TPR superfamilyav
TPR
图 3 马铃薯 STI-LIKE 蛋白结构域预测
图 4 pBI121 载体酶切检测
2000
bp
2.4 STI-LIKE基因的RNAi载体的构建
扩 增 获 得 两 条 目 的 片 段（ 图 5-A）， 分 别 连
接 到 pHANNIBAL 载 体。 阳 性 pHANNIBAL 载 体
双酶切后得到大小相近的两个片段（图 5-B）。将
pHANNIBAL 与 pART27 双酶切连接后，挑取白斑克
隆 PCR 鉴定（图 5-C）。测序结果正确无错配。将质
粒转化到农杆菌侵染拟南芥。
500
bp
1A B C2
5000
bp
2000
bp
A ：STI-LIKE 基因 RNAi 干扰片段扩增 ；B ：pHANNIBAL 载体酶切检测 ；
C ：对 RNAi 表达载体 pART27 插入片段扩增检测
图 5 STI-LIKE 基因干扰载体的构建
2.5 STI-LIKE基因在各器官表达定量分析
定量分析表明，STI-LIKE 基因在马铃薯各组织
器官（无花器官）中都有表达，其中在根中表达量
200
bp
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
P N
tubulin
1 ：块茎 ；2 ：茎 ；3 ：叶 ；4 ：匍匐茎 ；5 ：根 ；P ：阳性对照 ；N ：阴性对照
图 6 马铃薯各营养器官 STI-LIKE 基因表达量定量分析
2.6 抗原蛋白表达和纯化
小量诱导（图 7-A）表明，IPTG 诱导 3 h 后浓
度达到峰值。大量诱导（图 7-B）表明，抗原蛋白
主要存在于沉淀中。纯化后 SDS-PAGE（图 7-C）检
测，纯化效果理想，用纯化后蛋白制备抗体。к0 h 0 h 1 h 1 h 3 h 3 h ⊹⏰ ⊹⏰ ⍱ク ṧ1 ṧ2к
A B C
图 7 马铃薯 STI-LIKE 蛋白抗原的小量诱导（A）、大量
表达（B）和纯化检测（C）
2.7 转基因拟南芥表型分析及验证
对生长 3 周的转基因植株观察，结果（图 8）
发现过表达 STI-LIKE 基因植株生长和野生型表型相
同，而干扰表达 STI-LIKE 基因植株明显小于野生型
2014年第11期 123平海涛等：马铃薯块茎形成相关基因 STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证
植株。Western blot（图 9）检测表明野生型植株与
过表达 STI-LIKE 基因植株的 STI-LIKE 蛋白表达量
无显著差异，而干扰表达 STI-LIKE 基因植株中 STI-
LIKE 蛋白表达量显著降低，低于 1/2 野生型植株表
达量。
是高等植物生长发育所必须的。本研究为 STI-LIKE
基因在调节拟南芥植株发育和马铃薯块茎发育的进
一步功能验证奠定了基础。
4 结论
参与马铃薯块茎形成的 STI-LIKE 蛋白具有 3 个
TPR 结构域，在高等植物中具有高同源性和保守性，
表达不存在组织特异性 ；过表达 STI-LIKE 基因对拟
南芥发育无影响，干扰表达 STI-LIKE 基因使拟南芥
植株发育受阻，表明 STI-LIKE 基因为植物发育的必
需基因。
参 考 文 献
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STI-LIKE
1/2WT WT 35S RNAi
tubulin
图 8 转 STI-LIKE 基因拟南芥植株表型分析
图 9 转 STI-LIKE 基因拟南芥植株免疫印迹分析
3 讨论
同源比对的结果表明 STI-LIKE 蛋白在高等植物
中具有高度保守性，同时也说明其可能具有相似的
功能［19］。同时 STI-LIKE 蛋白不具有信号肽并定位
于细胞质。3 个主要 TPR 结构域分布在 N 末端和 C
末端，表明可能是通过与另外两个蛋白形成一个三
亚基复合体蛋白质的形式实现其功能［14］。对马铃薯
的根、叶、茎、匍匐茎和块茎中 STI-LIKE 表达分析
表明该基因并不具有严格组织特异性，在马铃薯各
器官组织中广泛表达［20］。由此推测该基因对马铃薯
块茎发育的影响可能是通过调控共有的代谢通路来
影响马铃薯块茎的发育过程。
对转基因拟南芥植株的表型分析是植物基因功
能验证模式体系，对过表达和干扰表达转 STI-LIKE
基因拟南芥植株表型观察表明，过表达 STI-LIKE 基
因对拟南芥发育无显著影响，而干扰表达 STI-LIKE
基因却能够使拟南芥植株发育过程受阻，又由于
STI-LIKE 蛋白在高等植物中具有高度同源性，推测
STI-LIKE 基因在拟南芥和马铃薯中的功能相同［21］，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期124
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（责任编辑 李楠）