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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
热休克转录因子 HSFY（heat shock transcription
factor，Y chromosome） 是 哺 乳 动 物 4 种 热 休 克 因
子（HSF1、HSF2、HSF4 和 HSFY） 之 一， 控 制 热
休 克 蛋 白 表 达［1］。HSFY 与 其 它 HSFs（HSF1 和
HSF2） 具 有 不 同 的 功 能［2］。Tessari 等［3］ 将 HSFY
收稿日期 ：2013-03-07
基金项目 ： 国家科技支撑计划课题（2012BAD13B06），西南民族大学研究生创新科研项目（CX2013SZ65），中央高校基本科研业务费专项
资金项目（11NZYTH03）
作者简介 ：曾贤彬，男，硕士，研究方向 ：基因组与生物信息学 ；E-mail ：zxbgood@foxmail.com
通讯作者 ：钟金城，男，教授，研究方向 ：动物遗传学 ；E-mail ：zhongjincheng518@126.com
牦牛 HSFY 基因的克隆及其结构分析
曾贤彬1  王永1  刘仲娜1  马志杰2  海汀1  钟金城1
（1. 西南民族大学 动物遗传育种学国家民委——教育部重点实验室，成都 610041 ；2. 青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016）
摘 要 ： Y 染色体上的热休克转录因子（HSFY）是精子发生障碍的候选基因之一。通过克隆牦牛 HSFY 基因，并与普通牛
Y 染色体上的 84 条 HSFY 序列比对。结果表明 ：牦牛 HSFY 基因由 2 个外显子和 1 个内含子组成，与普通牛基因组中的相应序列
的一致性高达 99.54%。牦牛、普通牛的该基因具有 4 处插入 / 缺失，且序列与其相邻序列极为相似。在 1 012-1 020 bp（Ⅰ）处有
AAAGAAGA/TG 等 9 个核苷酸缺失，位于内含子内 ；在 1 071-1 073 bp（Ⅱ）、1 249-1 251 bp（Ⅲ）处分别有 AAG、CCA/C 等 3 个
核苷酸缺失，位于第二外显子内，分别导致赖氨酸和组氨酸的缺失 ；在 1 708-1 710 bp（Ⅳ）处有 CAA 3 个核苷酸缺失，位于 3
末端非编码区。在普通牛的 84 条 HSFY 基因序列中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入 / 缺失分别有 29、3、2、1 次。未发现Ⅱ、Ⅲ同时缺失的
拷贝，但Ⅱ、Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失，且导致了蛋白三维结构的变化。牦牛 HSFY 是在睾丸中表达的多拷贝基因，经密码子偏好性分析，
该基因编码的蛋白质偏好使用以 A 或 T 结尾的密码子。
关键词 ： 牦牛 HSFY 插入 / 缺失 精子发生
Yak HSFY Gene Cloning and Structure Anlysis
Zeng Xianbin1 Wang Yong1 Liu Zhongna1 Ma Zhijie2 Hai Ting1 Zhong Jincheng1
（1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Southwest University for
Nationalities，Chengdu 610041 ；2. Animal Husbandry and Veterinary College，Qinghai University，Xining 810016）
Abstract:  Heat shock transcription factor linked Y chromosome is one of the candidate genes for spermatogenesis obstacle. In this
study, sequences of HSFY genes of yak were obtained by cloning and alignmented with 84 HSFY sequences on the Y chromosome of the cow.
The results show that ：The nucleotide homology of yak, HSFY genes which are composed with two exons and one intron with the corresponding
sequences in the genome of the cow is high up to 99.54%. We found four insertion/deletion sequences. Between the 1 012-1 020 bp（Ⅰ）, it
lacks 9 nucleotides（AAAGAAGA/TG）which is located in the intron. While between the 1 071-1 073 bp（Ⅱ）and 1 249-1 251 bp（Ⅲ）
lack AAG and CCA/C respectively, which are located in the second extron and that lack lysine and histidine respectively in the amino acid
sequence. Between the 1 708-1 710 bp（Ⅳ）, there is a 3 nucleotides deletion（CAA）, which is located in 3-URT. In the 84 HSFY genes of
the cow, the frequency of the insertions/deletion is 29，3，2，1 for Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ , respectively. It is not found one with both Ⅱ and Ⅲ
deletion. But all Ⅱ or Ⅲ deletion are accompany with Ⅰ deletion. Ⅱ and Ⅲ deletions change three-dimensional structure of HSFY protein. Yak
HSFY which is a multicopy gene prefers using codes that are ended with A or T.
Key words:  Yak HSFY Insertion/deletion Spermatogenesis
作为人精子发生障碍的候选基因之一。Giovanna［4］、
Shinka［2］、Ferlin［5］等报道 HSFY 基因缺失与无精子、
少精子症紧密相关。
Tessari［3］、Christine ［6］等对人、恒河猴、普通牛、
家猫、挪威鼠的 HSFY 蛋白质序列进行了多序列比
2013年第7期 83曾贤彬等 ：牦牛 HSFY 基因的克隆及其结构分析
对，结果显示，普通牛与家猫亲缘关系最近，两物
种间的该基因编码区和与 DNA 结合的结构域的序
列一致性分别为 58% 和 81%。目前认为，HSFY 基
因是 Y 染色体上的多拷贝基因。人有 6 个拷贝，其
中两个功能拷贝 ；家猫有 8 个功能拷贝，拷贝数未
知；普通牛约有 73 个拷贝，功能基因数未知［3，6，7］。
人、普通牛的 HSFY 主要在睾丸中特异表达［3，8］，
即 HSFY 仅在支持细胞和精母细胞中表达［2］，其
mRNA 表达水平与精原细胞和精母细胞标记（UCHL1
和 TRPC2）mRNA 表达水平显著相关（P<0.000 1）［6］。
用抗 HSFY 抗体证实，正常精子生成时，HSFY 在曲
细精管的生殖细胞和支持细胞中表达。精原细胞期、
精母细胞细线期均无 HSFY 表达信号 ；偶线期染色
质周围有强 HSFY 表达信号，但在精子成熟后 HSFY
蛋白量减少［9］，表明其与精子生成有关，但其生物
学功能尚待研究［2-4，10］。
有关牦牛 HSFY 基因的研究尚未见报道，本研
究对牦牛的 HSFY 基因进行克隆测序、结构和密码
子偏好性分析以及与普通牛等其他物种相应基因进
行比对研究，以期为进一步研究牦牛 HSFY 基因的
结构和功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
在四川省龙日种畜场选取健康成年公牦牛两头，
采取耳组织，置于 75% 乙醇中带回实验室，保存
于 -20℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 按试剂盒（天根公司）
操作说明提取基因组 DNA。
1.2.2 牦牛 HSFY 基因克隆测序 根据普通牛 HSFY2
序列（NC_016145.1）设计引物，上下游引物分别为
F ：5-TCACAGCCTTTTGACTTTG-3、R ：5-CTCTT-
TTCCCTTGCTTCTC-3 ；引 物 由 上 海 Invitrogen 公 司
合成。
25 μL PCR 反应体系 ：基因组 DNA 1 μL、上下
游引物各 1 μL、ddH2O 9.5 μL 和 2×long Taq 酶（博
奥维新公司）12.5 μL 。PCR 反应程序 ：95℃预变性
3 min ；95℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 1.5
min，共 30 个循环 ；72℃终延伸 10 min，4℃保存。
经胶回收试剂盒回收 PCR 产物，与 pMD19-T
（购自 TaKaRa 公司）于 16℃过夜连接，其产物转化
大肠杆菌（DH5α）感受态细胞，涂布于含 50 μg/mL
氨苄青霉素、200 mg/mL IPTG 及 20 mg/mL X-Gal 的
LB 平板，过夜培养。经 PCR 筛选阳性克隆进行测序。
1.2.3 序 列 分 析 测 序 结 果 用 DNAMAN4.0、
DNAssist1.0 等生物信息学软件进行拼接、比对分析，
用 GENSCAN（http ：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）
预测蛋白的氨基酸序列，并与普通牛（NP_001070-
474）、瘤牛（AFV09891）、人（hHSFY1 ：NP_1490-
99.2 ；hHSFY2 ：NP_714927.1）、挪威鼠（NP_00101-
2132.1）、家短尾负鼠（ACT35160）、恒河猴（ACL-
51668.1）、 家 猫（NP_001035212.1） 等 的 HSFY 蛋
白的序列用 Clustal W［11］ 进行多序列比对［6］，用
MEGA5 软件构建系统进化树。在 UCSC 基因组浏览
器（http ：//genome.ucsc.edu/） 的 普 通 牛 基 因 组 中，
以 HSFY 引物对搜索，选取位于 Y 染色体上的 HSFY
相似序列。GENSCAN 预测外显子区域，condon W
（http ：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms ：：
codonw）分析其密码子偏好性和有效密码子数等。
用 SWISS-MODEL（http ：//swissmodel.expasy.org/）
同源建模构建 HSFY 蛋白三维结构。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
经 PCR 扩增，电泳检测为一清晰条带（图 1）。
结合普通牛 HSFY2 序列（NC_016145.1），通过 DNA
分子量标准和测序结果分析得知，牦牛 HSFY 基因
PCR 产物大小为 2 000 bp 左右，与预期结果一致。
2000
bp
M 1 2
1000
M ：200 bp DNA ladder ；1，2 ：两头牦牛的 PCR 产物
图 1 牦牛 HSFY 基因的 PCR 扩增电泳图
2.2 牦牛HSFY基因的核苷酸序列及其比对
本研究得到的牦牛 HSFY 基因由 2 个外显子和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期84
1 个内含子组成，与普通牛基因组中的相应序列进
行比对，其一致性高达 99.54%。第一外显子未出现
插入 / 缺失，但在 1 012-1 020 bp（Ⅰ）处有 AAAG-
AAGA/TG 等 9 个核苷酸缺失，位于内含子内 ；在
1 071-1 073 bp（Ⅱ）、1 249-1 251 bp（Ⅲ）处分别有
AAG、CCA/C 等 3 个核苷酸缺失，位于第二外显子内，
分别导致赖氨酸和组氨酸的缺失 ；在 1 708-1 710 bp
（Ⅳ）处有 CAA 3 个核苷酸缺失，位于 3-URT。在普
通牛 HSFY 基因的 84 条序列中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ插入 / 缺
失分别有 29、3、2、1 次，未发现Ⅱ、Ⅲ同时缺失
的拷贝，但Ⅱ、Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ插入 / 缺失的序列与其相邻序列极为相似（图 2）。
yak 1
yak 2
cattle 1
cattle 2
cattle 3
cattle 4
cattle 5
cattle 6
cattle 7
cattle 8
cattle 9
cattle 10
cattle 11
cattle 12
cattle 13
cattle 14
yak 1
yak 2
cattle 1
cattle 2
cattle 3
cattle 4
cattle 5
cattle 6
cattle 7
cattle 8
cattle 9
cattle 10
cattle 11
cattle 12
cattle 13
cattle 14
yak 1
yak 2
cattle 1
cattle 2
cattle 3
cattle 4
cattle 5
cattle 6
cattle 7
cattle 8
cattle 9
cattle 10
cattle 11
cattle 12
cattle 13
cattle 14
普通牛 Y 染色体上有 84 条 HSFY 序列，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ缺失分别有 29、3、2、1 次，图中包括 2 条牦牛序列，含Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ缺失的Ⅰ缺失的 5 条序列，
24 条只有Ⅰ缺失中的 5 条序列，55 条完整序列中的 4 条序列。N、M 代表 100、50 个碱基数
图 2 两条牦牛 HSFY 基因序列与普通牛部分相应序列的比对
2013年第7期 85曾贤彬等 ：牦牛 HSFY 基因的克隆及其结构分析
人（hHSFY1：NP_149099.2；hHSFY2：NP_714927.1）、恒河猴（ACL51668.1）、
普通牛（NP_001070474）、瘤牛（AFV09891）、家猫（NP_001035212.1）、挪
威鼠（NP_001012132.1）、家短尾负鼠（ACT35160）
图 3 牦牛与普通牛等物种 HSFY 的系统进化关系
Პ䙊⢋
ⱔ⢋
⢖⢋
ᇦ⸝ቮ䍏啐
ᇦ⥛
Ӫ
ᚂ⋣⥤
ᥚေ啐
0.1
100
65
100
98
39
A B
DC
A ：Ⅱ、Ⅲ均插入 ；B ：Ⅱ缺失、Ⅲ插入 ；C ：Ⅱ插入、Ⅲ缺失 ；
D ：Ⅱ、Ⅲ均缺失
图 4 牦牛 HSFY 蛋白质的Ⅱ、Ⅲ插入 / 缺失的三维结构
HSFY 基因在许多物种中为多拷贝基因，但在
物种内序列的相似性极高，人的两个功能拷贝的氨
基酸序列相似性达 100%。本研究得到的牦牛 HSFY
序列 1 仅有Ⅲ缺失，且预测的基因剪切方式也与普
通牛中具有功能的 HSFY 基因剪切方式一致。相对
序列 2 含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3 处缺失，序列 1 预测的氨
基酸序列更能反映牦牛 HSFY 蛋白质信息。其与人、
恒河猴、普通牛、瘤牛、家猫、挪威鼠、家短尾负
鼠的 HSFY 蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，构
建系统进化树（图 3）。牦牛与普通牛、瘤牛首先聚
为一类，再相继与家猫、家短尾负鼠、人等聚类，
聚类结果与动物学分类结果基本一致。
2.3 牦牛HSFY蛋白质的三维结构
以牦牛序列 1 的氨基酸序列为基础序列，研究
HSFY Ⅱ、Ⅲ插入 / 缺失与蛋白的三维结构变化情况。
结果（图 4）表明，Ⅱ与Ⅲ的单独缺失与Ⅱ和Ⅲ均
缺失的三维结构基本一致，但与Ⅱ、Ⅲ均未缺失的
结构差异较大。Ⅱ、Ⅲ插入 / 缺失对应的带正电荷
的赖氨酸、组氨酸比较倾向于位于蛋白表面，通过
静电作用等维持 HSFY 蛋白的立体结构，Ⅱ、Ⅲ任
一缺失均使 HSFY 蛋白的立体结构塌陷。Ⅱ、Ⅲ插
入 / 缺失可能会使 HSFY 蛋白的功能发生变化进而
影响精子发生。
2.4 牦牛HSFY基因的密码子偏好性
以牦牛 HSFY 序列 1 作为密码子偏好性分析，
GENSCAN 预测得到长 1 131 bp 的蛋白编码区。A、T、
C 和 G 分别占 33.24%、29.27%、20.34% 和 17.15%，
A3s、T3s、G3s 和 C3s 分别为 30.77%、37.93%、15.91%
和 15.38%，其中 G+C、G3s+C3s 含量分别为 37.19%
和 31.30%。有效密码子数为 46.82。可见，HSFY 基
因偏好使用 A、T 和以 A、T 结尾的密码子，UUU、
UUG、CUU、AUU、GUG、UAU、CAU、CAA、GAA、
GAU、UCU、UCA、CCU、CCA、ACU、ACA、GCU、
GCA、UGU、AGA、AGG、GGC 和 GGA 等 23 个 密
码子 RSCU（相对密码子使用度）均大于 1，为牦
牛 HSFY 偏好性密码子 ；Asn、Lys、Arg、Ser 4 个氨
基酸没有密码子偏好现象 ；除编码 Leu、Val、Arg、
Gly 的 UUG、GUG、AGG、GGC 外，避免密码子后
两位以 G 或 C 结尾，尤其以 CG 结尾如 CCG、ACG、
GCG 的 RSCU 为 0（表 1）。
3 讨论
3.1 关于牦牛HSFY基因的拷贝数
在人体中，研究发现 Yq11 区存在与精子发生
相关的基因，这些基因或基因家族又称为无精子
症 因 子（azoospermia facter，AZF）， 目 前 已 经 确 定
AZF 由相互叠加的 4 个区域组成，即 AZFa、AZFb、
AZFc、AZFd［12，13］。HSFY 是位于 AZFb 区无精子症
因子候选因子之一。在许多物种中发现是由多拷贝
组成的基因，人有 6 个拷贝，家猫有 8 个功能拷贝，
普通牛约有 73 个拷贝［3，6，7］。以往的研究表明，牦
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期86
牛与普通牛具有较近的亲缘关系，在许多基因组成
和基因结构上都有相似性，本研究得到的 2 条牦牛
HSFY 基因序列虽在核苷酸组成上有一些差异，但相
似性很高。因此认为牦牛的 HSFY 基因是一个多拷
贝基因。
3.2 关于牦牛HSFY基因的结构与遗传变异
Hamilton 等［6］研究普通牛 HSFY 基因的拷贝数
在 67-84 范围波动，基因表达和 56 天 NRR 系数（反
映受精比率）均无显著性差异。与 Shaw-Smith［14］、
Inoue［15］、Lupski［16］等研究表明的基因微量删除和
重复严重影响生物学功能现象不一致，推测是由多
拷贝和基因调控序列区域变化两种调节机制确保进
行精子发生。该机制可能受到严格的自然选择。本
研究得到 2 条牦牛的 HSFY 序列，并搜索得到普通
牛的 HSFY 序列 84 条，与 Hamilton［6］ 研究结果基
本一致，表明引物结合处比较保守，可以用于检测
HSFY 基因缺失状态。比对发现牦牛、普通牛有 4
处插入 / 缺失，其序列均分别与其相邻序列极为相
似，可能由染色体内同源重组导致缺失的发生［17］。
Ⅰ、Ⅳ缺失虽然不引起蛋白结构的变化，但估计起
转录调控作用，以便精细调节细胞中 HSFY 蛋白浓
度变化弥补个别基因因突变或缺失造成的功能缺失。
Ⅱ、Ⅲ插入 / 缺失对应的赖氨酸和组氨酸的零深度
相对倾向因子分别为 30.850、15.312［18］，使均带正
电荷的赖氨酸、组氨酸倾向于位于蛋白表面，HSFY
蛋白的立体结构塌陷。Ⅱ、Ⅲ插入 / 缺失可能会使
HSFY 蛋白的功能发生变化进而影响精子发生。普
通牛中Ⅱ和Ⅲ缺失均伴有Ⅰ缺失，很可能Ⅰ插入 / 缺
失参与该基因的精确表达调控，但是使得该基因更
易发生缺失突变。当然作者的这些推测还有待于进
一步的生物试验证实。
3.3 关于牦牛HSFY蛋白的结构与功能
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是指所
有生物细胞在应激原刺激后，发生热休克反应时产
生的一类细胞伴侣蛋白的总称。该类蛋白在细胞生
命过程中可参与蛋白的折叠、装配及运输等活动，
对调控细胞的生长、存活及分化起着重要作用。在
哺乳动物中，HSP 家族参与精子发生、精子获能及
受精等一系列活动，与雄性生殖过程密切相关［19］。
研究表明，人和猫 Y 染色体上多拷贝基因都在睾
丸组织中表达并行使功能［8，20-22］，则进一步推测
牦牛 HSFY 在睾丸中表达和行使生物学功能。HSF
成员 HSF1、HSF2 在精子发生中也起到了重要作
用［23， 24］。Ahn 等［25］报道，HSFY 和其它 HSFs（HSF1、
HSF2、HSF4）的结构不同，后者的中心螺旋型是由 α-
螺旋 2 和 3 组成，α-螺旋 3 是识别的 DNA 的螺旋结构，
然而 HSFY 有类似 HSFs 的 DNA 结合区，但没有 α-
螺旋 2 和 3。推测在精子发生活动中，HSFY 可能具
有与其它 HSFs 不同的调控 HSP 表达途径。
蛋白质序列变化［26］与其生物学功能变化密切
相关。本研究中，牦牛、普通牛 HSFY 基因未发现
表 1 牦牛 HSFY 序列 1 的 RSCU
氨基酸 密码子 数目 RSCU 氨基酸 密码子 数目 RSCU
Phe UUU 15 1.67 Ser UCU 16 1.92
UUC 3 0.33 UCC 4 0.48
Leu UUA 5 1.00 UCA 13 1.56
UUG 7 1.40 UCG 2 0.24
CUU 8 1.60 Pro AGU 8 0.96
CUC 3 0.60 AGC 7 0.84
CUA 4 0.80 CCU 13 2.26
CUG 3 0.60 CCC 1 0.17
Ile AUU 14 1.68 Thr CCA 9 1.57
AUC 4 0.48 CCG 0 0.00
AUA 7 0.84 ACU 12 1.66
Val GUU 5 1.00 ACC 5 0.69
GUC 5 1.00 Ala ACA 12 1.66
GUA 4 0.80 ACG 0 0.00
GUG 6 1.20 GCU 6 2.00
Tyr UAU 8 1.60 GCC 2 0.67
UAC 2 0.40 Cys GCA 4 1.33
His CAU 9 1.80 GCG 0 0.00
CAC 1 0.20 Arg UGU 4 1.60
Gln CAA 12 1.26 UGC 1 0.40
CAG 7 0.74 CGU 1 0.43
Asn AAU 11 1.00 CGC 0 0.00
AAC 11 1.00 CGA 2 0.86
Lys AAA 10 1.00 CGG 0 0.00
AAG 10 1.00 Gly AGA 8 3.43
Asp GAU 13 1.44 AGG 3 1.29
GAC 5 0.56 GGU 0 0.00
Glu GAA 23 1.53 GGC 4 2.29
GAG 7 0.47 GGA 2 1.14
Trp UGG 5 1.00 GGG 1 0.57
不含起始和终止密码子
2013年第7期 87曾贤彬等 ：牦牛 HSFY 基因的克隆及其结构分析
Ⅱ、Ⅲ同时缺失，且Ⅱ、Ⅲ任意一处缺失与均缺失
的三维结构基本一致且有 5 个序列，占 5.95%，可
能与精子发生受阻相关。因缺失的比例较小和调控
其它正常基因，确保了生物体精子发生正常。可通
过Ⅱ、Ⅲ两端的保守序列设计引物进一步研究其数
量变化与生物活动变化之间的规律。值得一提的是
基因密码子的使用与基因表达的生理功能有密切联
系［27， 28］。其不仅调控基因表达［29］，而且与翻译的
准确性和效率有关［30］。本研究以牦牛序列 1 预测的
编码区偏好使用 A、T 和以 A、T 结尾的密码子。考
虑到该基因在小鼠精子发生过程中有瞬时高表达现
象，估计牦牛 HSFY 翻译比较低的准确度，更有利
于瞬时高表达行使功能。但其生物学机制需要进一
步研究。
4 结论
牦牛 HSFY 基因由 2 个外显子和 1 个内含子组
成，是在睾丸中表达的多拷贝基因，与普通牛基因
组中的相应序列的一致性较高，属于同源性的基因。
牦牛、普通牛的该基因具有 4 处插入 / 缺失，
且序列与其相邻序列极为相似。牦牛 HSFY 基因编
码的蛋白质偏好使用以 A 或 T 结尾的密码子。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）