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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):174-179
吩 嗪 -1- 甲 酰 胺（Phenazine-1-carboxamide，
PCN）是一种天然的吩嗪类化合物，具有广谱的抗
真菌活性，主要由假单胞菌属合成［1-3］。与已经获
得的农药药证的第一代吩嗪类生物农药——申嗪霉
素［4，5］相比，该抗生素具有更好的安全性、稳定
性及对植物病原真菌的抑菌活性［6，7］，在防治水
稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价
值［8］。据报道，目前能合成 PCN 的微生物菌株有
绿针假单胞菌 PCL1391［2］，铜绿假单胞菌 PAO1［9］，
PUPa3［10］，PUP6［11］，MML221［8］ 等， 但 由 于 PCN
产率较低，尚未能大规模推广应用。
由清华大学和北京思清源生物科技公司合作
研 发 的 常 压 室 温 等 离 子 体（Atmospheric and room
temperature plasma，ARTP） 诱 变 育 种 系 统 利 用 了
收稿日期 ： 2015-05-08
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270084），国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA022107），国家重点基础研究发展计
划 （“973”计划） （2012CB721005）
作者简介 ：谭剑，男，硕士，研究方向 ：天然产物的生物合成与调控 ；E-mail ：kevintan_2014@163.com
通讯作者 ：彭华松，男，博士，副教授，研究方向 ：微生物代谢调控 ；E-mail ：hspeng@sjtu.edu.cn
ARTP 技术选育吩嗪 -1- 甲酰胺高产菌株及发酵优化
谭剑 熊欣 梁万利 彭华松 张雪洪
（上海交通大学 微生物代谢国家重点实验室，上海 200240）
摘 要 ： 从一株高产吩嗪 -1- 甲酰胺（PCN）的绿针假单胞菌 P3 株出发，利用常压室温等离子体诱变技术进行诱变育种，
从初筛的 20 株突变株中获得了一株 PCN 产量达到 2 093 mg/L 的突变株 P3-9，为出发菌株的 125%。随后通过单因素实验考察了
各种营养因子对该高产菌株合成 PCN 的影响，结果表明发酵培养基的最佳碳源、氮源分别为甘油和蛋白胨，外源添加 Fe3+ 或 Fe2+
对于积累 PCN 有显著促进作用，而添加苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸对 PCN 产量无明显影响。优化后，该突变株的 PCN 产量高达
2 810 mg/L，是目前国际上通过诱变育种获得的较高 PCN 产量。
关键词 ： 吩嗪 -1- 甲酰胺 ；常压室温等离子体 ；培养基优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.029
Breeding of a Phenazine-1-carboxamid-producing Strain by ARTP
Mutation and Its Optimization of Fermentation
TAN Jian XIONG Xin LIANG Wan-li PENG Hua-song ZHANG Xue-hong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai
200240）
Abstract: Using an atmospheric and room temperature plasma（ARTP）jet to mutagenize a phenazine-1-carboxamide-producting
strain Pseudomonas Chlororaphis P3, the mutant strain P3-9 with the highest phenazine-1-carboxamide（PCN）yield of more than 2 093 mg/L
was obtained from the primary-screened 20 mutant ones, and it was 125% that by the original strain. Furthermore, single factor experiment was
used to investigate the effects of varied nutrient factors on the PCN synthesis of P3-9. The results showed that the best carbon source and nitrogen
source were glycerol and tryptone respectively. Adding Fe3+ or Fe2+ had a significant effect on PCN production, and no measurable effect while
adding aromatic amino acids of phenylalanine, tryptophan and tyrosine. After the optimization, the PCN yield of strain P3-9 reached 2 810 mg/L,
which was the highest yield of PCN by mutation breeding in the world so far.
Key words: phenazine-1-carboxamide ；atmospheric and room temperature plasma ；medium optimization
2016,32(1) 175谭剑等：ARTP 技术选育吩嗪 -1- 甲酰胺高产菌株及发酵优化
ARTP 在放电时产生的各种电子流对微生物基因进
行损伤从而诱导其进行诱变，能在常压室温下操作，
具有成本低、安全性高、操作简便等优越性，取得
了良好的实际应用效果［12，13］。绿针假单胞菌 HT66
为本实验室从水稻根际分离的一株可以天然合成吩
嗪 -1- 甲酰胺（PCN）的野生型菌株，PCN 产量可
达 425 mg/L，是目前国际上报道的吩嗪化合物产量
最高的野生菌株 ；张平原［14］从绿针假单胞菌 HT66
出发，经过多轮的紫外线和亚硝基胍处理，获得了
高产突变株 P3，PCN 产量为野生株的 3.9 倍。为了
避免长期使用相同诱变技术导致菌株出现钝化现象，
本研究以 P3 为出发菌株，尝试以一种新型的 ARTP
技术进行诱变育种［15，16］，并对突变株的发酵条件进
行初步的优化，进一步提高 PCN 产量。
1 材料与方法
1.1 材料
出 发 菌 株 ：绿 针 假 单 胞 菌 P3（Pseudomonas
Chlororaphis P3），由实验室保存。
King’s B 固体培养基［17，18］（g/L）：蛋白胨 20，
甘油 18.915，K2HPO4 0.514，MgSO4 0.732，琼脂 20，
pH 7.5。
种子培养基（g/L）：成分除无琼脂外同 King’s
B 固体培养基，60 mL 装于 250 mL 凹槽三角瓶中。
发酵培养基（g/L）：基础成分同种子培养基，
具体成分实验中优化。
1.2 方法
1.2.1 PCN 检测方法 取 24 h 发酵液 0.4 mL，加入
20 μL 6 mol/L 盐酸酸化后，用 3.6 mL 乙酸乙酯震荡
萃取 5 min，取 0.4 mL 萃取液吹干后加入 1 mL 乙腈
溶解，以 HPLC 检测。
HPLC 检测条件：色谱柱为 WondaSil-WR 反相柱，
流动相为乙腈 -25 mmol/L 乙酸铵，流动相比例 ：0-2
min，8% 乙 腈 -92% 25 mmol/L 乙 酸 铵 ；2-20 min，
乙腈浓度由 8% 升至 60%，乙酸铵浓度由 92% 下降
至 40% ；20-21 min，8% 乙腈 -92% 乙酸铵。检测波
长 254 nm，柱温 30℃，流速 1.0 mL/min。
1.2.2 ARTP 诱变 本实验以 PCN 高产突变株 P3 作
为出发菌，利用 ARTP 技术对菌株进行诱变处理。
取对数期的 P3 菌悬液（OD600 值为 0.6 左右），用
0.01 mol/L PBS 缓冲液洗涤 3 次后取 10 μL 的菌液均
匀涂抹于金属载片。设置仪器功率为 100 W，气流
量 10 SLM，照射距离 2 mm。实验中以时间为变量，
各组处理时间分别为 0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、
90 s、120 s，制作致死率曲线。根据致死率，以 20
s 照射时长为最佳诱变条件重复等离子体的照射诱
变，以获得最佳诱变效果。将诱变菌液稀释后涂布
King’s B 平板，观察菌株在平板上的生长情况，根
据菌落产生 PCN 晶体的时间和大小初步筛选出高产
突变株，最后进行摇瓶发酵，HPLC 检测 PCN 产量。
1.2.3 不同营养因子对 PCN 发酵的影响
1.2.3.1 碳源的影响 在 King’s B 培养基中，以等
摩尔数的碳原子为基准分别添加甘油、麦芽糖、葡
萄糖、蔗糖作为碳源，28℃，180 r/min，摇床培养
24 h 后检测 PCN 产量，每组设 3 个平行实验。
1.2.3.2 氮源的影响 根据不同氮源的含氮量，往
King’s B 培养基中分别添加相同摩尔量的有机氮源
（蛋白胨、玉米浆、牛肉膏）和无机氮源（硫酸铵）
作为氮源，其他条件同上。
1.2.3.3 微量元素的影响 根据植物根际中矿物质
成分分布，分别添加 Cu2+、Fe3+、Mn2+ 和 Zn2+ 四种
阳离子为考察对象，阳离子最终浓度为 1 mmol/L，
保持阴离子为 Cl-，其他条件同上。
1.2.3.4 氨基酸的影响 分别添加等摩尔浓度（1
mmol/L 或 5 mmol/L）的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸
到 King’s B 培养基中，并设空白对照组，其他条件
同上。
2 结果
2.1 诱变菌株的筛选
2.1.1 ARTP 诱变致死率曲线 根据致死率公式制
作绿针假单胞菌 P3 株的诱变致死率曲线，如图 1
所示。
ሩ➗㓴Ⲵ㧼㩭ᮠሩ➗㓴Ⲵ㧼㩭ᮠᇎ傼㓴Ⲵ㧼㩭ᮠ ×100%㠤↫⦷ % =
由图 1-A 可知，等离子体照射与 P3 株的致死
率存在着明显的剂量效应关系。照射时间 20 s 时，
致死率为 77.54% ；照射时间 45-90 s 时，致死率在
98% 以上 ；照射时间为 120 s 时，菌株被完全杀死。
为保证较高的正突变率，可使致死率保持在 75% 左
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1176
右，因此本实验选择 20 s 为最适宜的照射时长，并
进行多次诱变实验，结果如图 1-B 所示。
2.1.2 诱变株筛选与 PCN 产量测定 经过 ARTP 诱
变处理，根据固体平板培养基上单菌落产生绿色结
晶（PCN）时间的先后和晶体量筛选出 20 株突变株，
进行在 King’s B 培养基中摇瓶培养，并通过 HPLC
检测 PCN 产量，如图 2 所示。大部分初筛的诱变菌
株 PCN 产量与出发菌株 P3 相比均有提高，只有少
量菌株产量降低（图 2-A) ；其中，诱变株 P3-9 产量
最高，为 P3 株的 125% 左右，达到 2 093 mg/L，说
明 ARTP 诱变对于提高菌株 PCN 产量有着良好的
效果，并选择突变株 P3-9 进行后续实验。图 2-B
为突变株 P3-9 的 HPLC 检测图，PCN 保留时间为
17.199 min。
2.2 发酵优化
2.2.1 碳源对 PCN 合成的影响 考察 5 种发酵常用
碳源对 PCN 产量的影响，结果（图 3）表明不同的
碳源对 PCN 产量影响差异很大。其中，以甘油为碳
源的培养基中 PCN 产量最高，为 2 100 mg/L 左右，
而以麦芽糖作为碳源 PCN 产量仅为不到 100 mg/L，
120
100
80
60
40
20
0
㠤↫⦷%
0 20 30 45➗ሴᰦ䰤S60 75 90 120A
B
左 ：对照组，右 ：20 s 照射诱变组
图 1 绿针假单胞菌 P3 株的 ARTP 致死率曲线（A）和平
板培养菌落图（B）
140
120
100
80
60
40
20
0
1
ケਈṚPCNӗ䟿∄%
2 3 4 5 6 7 8 9 10㧼Ṛਧ11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 P3A
mAU
800
600
400
200
0
2.5 7.5 12.5 17.515105 20
19
.5
44
17
.1
99
3.
85
5
2.
59
9
3.
38
7
3.
28
2
3.
66
0
min
B
图 2 ARTP 诱变初筛菌株与出发菌株 P3 的 PCN 产量比
（A）和菌株 P3-9 的 HPLC 检测图（B）
2500
2000
1500
1000
500
0
PC
N
ӗ䟿/ mg·L-1 オⲭ ⭈⋩ 哖㣭㌆ 㪑㨴㌆ 㭇㌆
图 3 碳源对 PCN 合成的影响
以葡萄糖及蔗糖为碳源时的 PCN 产量稍高于空白组，
分别为 161 mg/L 和 234 mg/L。
2.2.2 氮源对 PCN 合成的影响 分别以有机氮源蛋
白胨、牛肉膏、玉米浆和无机氮源硫酸铵、硝酸钾
为对象，考察不同氮源对 PCN 产量的影响，结果见
图 4。由图 4 可知，以蛋白胨为氮源进行发酵 PCN
产量最高，达 2 031 mg/L，而添加工业常用的玉米
浆和无机氮源硫酸铵、硝酸钾几乎无 PCN 产生。以
牛肉膏为氮源 PCN 的产率与蛋白胨相比相对较低，
2016,32(1) 177谭剑等：ARTP 技术选育吩嗪 -1- 甲酰胺高产菌株及发酵优化
Fe2+ 和 Fe3+ 对于促进 PCN 积累均有显著效果。在同
种阳离子条件下，阴离子种类对于 PCN 产量的影响
不明显，进一步验证了铁离子对于 PCN 产量的影响。
此外，与添加 Fe3+ 相比，添加 Fe2+ 的 PCN 产量略低
20-30 mg/L，且 Fe2+ 不稳定，高温下易被氧化，故
可考虑在培养基中添加适量 FeCl3 溶液，提高 PCN
产量。
2500
2000
1500
1000
500
0
PC
N
ӗ䟿/ mg·L-1 オⲭ 㳻ⲭ㜘 ⺛䞨䬥 ⺍䞨䫮 ⢋㚹㞿 ⦹㊣⍶
图 4 不同氮源对 PCN 合成的影响
仅为 231 mg/L。
2.2.3 微量元素对产 PCN 的影响 本实验以 Cu2+、
Fe3+、Mn2+ 和 Zn2+ 四种阳离子为考察对象，添加各
种阳离子（浓度为 1 mmol/L）到 King’s B 培养基中，
阴离子均为 Cl-，发酵 24 h 后检测 PCN 产量，结果（图
5）表明，与空白对照组相比，加入 Cu2+ 的实验组
中 PCN 产量反而降低，加入 Mn2+ 和 Zn2+ 对于 PCN
产量无明显影响 ；而加入 Fe3+ 对于 PCN 的积累有明
显促进作用，比空白对照组高出约 760 mg/L，高达
2 810 mg/L。
2500
3000
2000
1500
1000
500
0
PC
N
ӗ䟿/ mg·L-1 オⲭ 䬌 䫱 䭠 䬼
图 5 不同微量元素对 PCN 产量的影响
2500
3000
2000
1500
1000
500
0
PC
N
ӗ䟿/ mg·L-1 オⲭ ≟ॆӊ䫱 ≟ॆ䫱 ⺛䞨ӊ䫱 ⺛䞨䫱
图 6 添加 Fe2+ 和 Fe3+ 对 PCN 产量的影响
2.2.4 氨基酸对 PCN 合成的影响 外源添加浓度为
1 mmol/L 和 5 mmol/L 氨基酸，研究苯丙氨酸、酪氨
酸和色氨酸对 PCN 合成的影响。由结果（图 7）可知，
与空白对照组相比，添加色氨酸后 PCN 产量略微降
低，由此推测可能高浓度的色氨酸对合成途径存在
一定的反馈抑制作用。添加 1 mmol/L 的苯丙氨酸和
酪氨酸对于 PCN 产量无明显影响，而当添加浓度为
5 mmol/L 时，苯丙氨酸和酪氨酸对于 PCN 的积累有
轻微的促进作用。
为了进一步验证铁离子对 PCN 产量的促进作
用，并探究不同价态铁离子和不同阴离子对 PCN 合
成的影响，本实验分别考察了 2 mmol/L 浓度的氯化
亚铁、氯化铁、硫酸亚铁和硫酸铁对 PCN 合成的影响。
结果（图 6）显示，空白对照组中 PCN 产量为 2 073
mg/L，而添加了 Fe2+ 和 Fe3+ 的实验组的 PCN 产量普
遍保持在 2 800 mg/L 左右，产量提高了 35%，说明
2500
2000
1500
1000
500
0
PC
N
ӗ䟿/ mg·L-1 オⲭ 1 2 3 4 5 6
1 ：1 mmol/L Phe ；2 ：5 mmol/L Phe ；3 ：1 mmol/L Trp ；4 ：5 mmol/L Trp ；5 ：
1 mmol/L Tyr ；6 ：5 mmol/L Tyr
图 7 不同氨基酸对 PCN 产量的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1178
3 讨论
假单胞菌产生吩嗪类抗生素吩嗪 -1- 甲酰胺具
有广谱的抑菌性，具有良好的应用前景［1-3］，但大
部分研究仍处于实验室阶段，与工业化生产仍有较
大差距［8-11］。本研究利用 ARTP 诱变育种方法对 P3
株进行处理，并筛选到一株产量为 P3 株 125% 的
高产突变株 P3-9，并对菌株 P3-9 的发酵培养基进
行了优化。单因素实验结果显示，生物柴油合成工
业的副产物甘油及常作为发酵氮源的蛋白胨均有利
于 P3-9 株在发酵过程中 PCN 的的积累。微量元素
作为生物活性物质的组成成分或新陈代谢过程中生
理活性作用的调节因子，对绿针假单胞菌 PCL1391
中 PCN 的合成［19］和铜绿假单胞菌 M18 中吩嗪 -1-
羧酸（PCA）的合成［20］有着重要的影响。本研究
中，外源添加 Fe3+ 可有效促进菌株 PCN 的合成，与
Tjeerd van Rij 等［19］的结果一致，推测 Fe3+ 可能是
特定酶的辅助因子或者参与了吩嗪化合物的氧化还
原反应，从而明显地促进了次级代谢产物的合成，
具体的作用机理有待进一步研究［21］。在假单胞菌
的代谢网络中，吩嗪化合物与芳香族氨基酸共用部
分合成途径［19］。但本研究中外源添加低浓度的苯
丙氨酸、酪氨酸和色氨酸对于 PCN 产量效果并未像
PCL1391 中所报道的 PCN 产量提高数倍的情况［19］，
分析可能由于培养基中的复杂氮源已经包含少量氨
基酸类物质所造成。后续可通过响应面［22］等方法
研究不同营养因素对绿针假单胞菌中的 PCN 合成的
影响，并确定最优培养基组分。另外，发酵条件如
温度、溶氧量及 pH 值也是影响次级代谢产物积累
的重要因素，通过对发酵条件进行优化可进一步为
实现工业化生产提供可能。
4 结论
（1）通过 ARTP 诱变实验，制定致死率曲线并
确定了最佳诱变时间 20 s，并通过初筛获得了 20 株
诱变突变株，其中突变株 P3-9 的 PCN 产量最高，
为出发菌株 P3 株的 125% 左右。由此可知，ARTP
诱变育种是一种提高绿针假单胞菌 PCN 产量的有效
手段。
（2）初步探索了培养基中各营养因子对诱变高
产株合成 PCN 的影响，确定了用于发酵积累 PCN
的最佳碳源和氮源分别为甘油和蛋白胨，外源添加
Fe3+ 和 Fe2+ 对于积累 PCN 有显著的促进作用。外源
添加少量苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸对于 PCN 产量
无显著影响。
（3）由于工业育种技术的不断发展和假单胞菌
自身对环境的敏感性，诱变育种及发酵优化可以作
为有效的手段来提高吩嗪类抗生素的产量。
参 考 文 献
［1］Jane BL, John N. Phenazine natural products ：biosynthesis,
synthetic analogues, and biological aActivity［J］. Chem. Rev,
2004, 104 ：1663-1685.
［2］Chin-A-Woeng TFC, Thomas-Oates JE, Lugtenberg BJJ, et al.
Introduction of the phzH gene of Pseudomonas chlororaphis PCL1391
extends the range of biocontrol ability of phenazine-1-carboxylic
acid-producing Pseudomonas spp. strains［J］. Mol Plant-Microbe
Interact, 2001, 14 ：1006-1015.
［3］Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV, Mulders IHM, et al. Root
colonization by phenazine-1-carboxamide-producing bacterium
Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of
tomato foot and root rot［J］. Mol Plant-Microbe Interact, 2000,
13 ：1340-1345.
［4］许煜泉 . 绿色微生物源抗菌剂申嗪霉素（M18）［J］. 精细与专
用化学品 , 2004， 12（20）：8-17.
［5］沈丽娟 . 高效、广谱、安全生物杀菌剂——申嗪霉素［J］. 世
界农药 , 2011, 33（3）：58.
［6］申慧峰 . 在铜绿假单胞菌根际株 M18 中高效转化吩嗪 -1- 羧酸
为吩嗪 -1- 甲酰胺［D］. 上海 ：上海交通大学 , 2012.
［7］Chin-A-Woeng TFC, Bloemberg GV, van der Bij AJ, et al. Biocontrol
by phenazine-1-carboxamide-producing Pseudomonas chlororaphis
PCL1391 of tomato root rot caused by Fusarium oxysporum f. sp.
radicis-lycopersici［J］. Mol Plant-Microbe Interact, 1998, 11 ：
1069-1077.
［8］Shanmugaiah V, Mathivanan N, Varghese B. Purification, crystal
structure and antimicrobial activity of phenazine-1-carboxamide
produced by a growth-promoting biocontrol bacterium, Pseudomonas
aeruginosa MML2212［J］. Journal of Applied Microbiology, 2010,
108（2）：703-711.
［9］Mavrodi DV, Bonsall RF, Delaney SM, et al. Functional analysis of
genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide
2016,32(1) 179谭剑等：ARTP 技术选育吩嗪 -1- 甲酰胺高产菌株及发酵优化
from Pseudomonas aeruginosa PAO1［J］. Journal of Bacteriology,
2001, 183（21）：6454-6465.
［10］Kumar RS, Ayyadurai N, Pandiaraja P, et al. Characterization
of antifungal metabolite produced by a new strain Pseudomonas
aeruginosa PUPa3 that exhibits broad-spectrum antifungal activity
and biofertilizing traits［J］. Journal of Applied Microbiology,
2005, 98（1）：145-154.
［11］Naik PR, Sakthivel N. Functional characterization of a novel
hydrocarbonoclastic Pseudomonas sp. strain PUP6 with plant-
growth-promoting traits and antifungal potential［J］. Research in
Microbiology, 2006, 157（6）：538-546.
［12］王光耀 . 高产率生产 L- 乳酸拟干酪乳杆菌的高通量选育方法
建立及应用［D］. 上海 ：华东理工大学 , 2013.
［13］施跃峰 , 桑金隆 , 竺莉红 , 等 . 等离子体处理选育之江菌素产
生菌［J］. 核农学报 , 2002, 16（4）：208-211.
［14］张平原 . 一株高产吩嗪 -1- 甲酰胺绿针假单胞菌 HT66 的鉴定
与改造［D］. 上海 ：上海交通大学 , 2014.
［15］金丽华 , 方明月 , 张翀 , 等 . 常压室温等离子体快速诱变产油
酵母的条件及其突变株的特性［J］. 生物工程学报 , 2011, 27
（3）：461-467.
［16］蔡友华 , 李文锋 , 卢伟宁 , 等 . 新型常压室温等离子体（ARTP）
快速诱变高产苏氨酸的突变株［J］. 现代食品科技 , 2013, 29
（8）：1888-1892.
［17］Shtark O, Shaposhnikov AI, Kravchenko LV. The production of
antifungal metabolites by Pseudomonas chlororaphis grown on
different nutrient sources［J］. Mikrobiologiia, 2003, 72 ：645-
650.
［18］陈鸿锐 , 陈碧瑶 , 陈玲玲 . 吩嗪 -1- 羧酸发酵培养基配方的初
步确定［J］. 生物技术世界 , 2012（3）：21.
［19］van Rij ET, Wesselink M, Chin-A-Woeng TFC, et al. Influence
of environmental conditions on the production of phenazine-1-
carboxamide by Pseudomonas chlororaphis PCL1391［J］. MPMI,
2004, 17（5）：557-566.
［20］李雅乾 . 假单胞菌株 M18 吩嗪合成基因簇表达调控及其产物
发酵优化研究［D］. 上海 ：上海交通大学 , 2009.
［21］Wang Y, Wilks JC, Danhorn T, et al. Phenazine-1-carboxylic
acid promotes bacterial biofilm development via ferrous iron
acquisition［J］. J Bacteriol, 2011, 193（14）：3606-3617.
［22］Du X, Li Y, Zhou W, et al. Phenazine-1-carboxylic acid production
in a chromosomally non-scar triple-deleted mutant Pseudomonas
aeruginosa using statistical experimental designs to optimize
yield［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97 ：7767-7778.
（责任编辑 李楠）