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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-16
基金项目 : 甘肃省农牧厅生物技术研究与开发项目（GNSW-2009-06）, 甘肃省高等学校研究生导师科研项目（1002-04）
作者简介 : 罗秀刚 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物免疫与抗病性 ; E-mail: a2005203745@126.com
通讯作者 : 马小军 , 男 , 博士 , 副教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 动物免疫与抗病性 ; E-mail: maxj712@163.com
主要组织相容性复合体（ major histocompatibility
complex，MHC） 存在于所有较高等脊椎动物中［1，2］，
决定着动物的免疫排斥反应，同时也与动物的抗病
性密切相关［3］。MHC 在机体免疫应答调控和免疫识
别过程中发挥着重要作用，作为疾病抗性和易感性
基因，对 MHC 组成结构及其与疾病之间关系的研究
成为抗病育种研究的一个重要部分［4，5］。具有高度
多态的 MHC 基因由Ⅰ类、Ⅱ类基因组成，Ⅱ类基因
是 MHC 重要的功能区域，包括 DQ、DO、DR 等亚区，
且多态性很丰富，成为 MHC 研究的热点［6-8］。
不同物种的 MHC 的命名不同，山羊的 MHC 称
为山羊的白细胞抗原［9，10］（goat lymphocyte antigen，
GOLA） 。山羊 MHC 的结构和功能与牛、绵羊 MHC
比较相似，同源性较高，山羊 MHC 的研究是在牛
和绵羊 MHC 的研究基础上进行的，起步稍晚［11］。
DRB3 基因是Ⅱ类基因中最重要的功能区域，且多
河西绒山羊 DRB3基因外显子 2多态性分析
罗秀刚1 马小军1，2 张小丽1 岳燕1 李富强1 姜力飞1
（1 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 ；2 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）
摘 要： 研究采用 PCR-SSCP方法检测 1 046只河西绒山羊 DRB3基因第 2外显子的多态性，并克隆、测序群体内变异产生
的各等位基因，分析各等位基因间的遗传关系和进化意义。结果表明，河西绒山羊 DRB3基因第 2外显子表现了 18个等位基因
（LG001-LG018）控制的 31个基因型，LG005为优势等位基因，LG005*005为优势基因型，18个单倍型序列分析发现 44个核苷酸
多态位点、29个氨基酸多态位点；与 GenBank下载序列比对分析结果表明，16个 DRB3的等位基因是本研究首次发现；DRB3基
因遗传多态指数中，观察杂合度为 0.269 6，多态信息含量为 0.869 9，有效等位基因数为 1.369 1 ；经 χ2适合性检验，该群体偏离
了 Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）；18个 DRB3基因外显子 2的单倍型序列 NJ系统发育树呈 2支分化趋势。研究认为河西绒
山羊 DRB3基因第 2外显子具有丰富的遗传多态性；河西绒山羊 DRB3基因最初由 2个等位基因突变分化成两大类等位基因。
关键词： DRB3基因 多态性 PCR-SSCP 河西绒山羊
Polymorphism of the DRB3 Gene Exon 2 in Hexi Cashmere Goats
Luo Xiugang1 Ma Xiaojun1，2 Zhang Xiaoli1 Yue Yan1 Li Fuqiang1 Jiang Lifei1
（1 College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070； 2 Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal
Biotechnology，Lanzhou 730070）
Abstract: Variation in the 1 046 cashmere goats DRB3 gene extron 2 was investigated by PCR-SSCP method, followed by cloning and
DNA sequencing, then analysis the genetic relationship and evolutionary significance of the alleles. The results showed that there were 31
genotypes, included 18 alleles（LG001-LG018）. Allele LG005 and genotype LG005*005 were predominant. 44 nucleotide polymorphism
sites or 29 amino acids polymorphic locis were identified in 18 DRB3 gene haplotypes. 16 novel DRB3 exon 2 alleles were found comparison
with GenBank sequences. In the genetic polymorphism parameters of DRB3 gene, the searched heterozygosity were 0.269 6, polymorphism
information content were 0.869 9 and the effective number of alleles were 1.369 1. Chi-square test indicated that the polymorphic locus in
cashmere goats were out of Hardy-Weinberg equilibrium （ P<0.05 ）. The phylogenetic tree results showed that the 18 haplotypes of DRB3 gene
exon 2 can divide into two clusters. It is showed that cashmere goats DRB3 gene exon 2 has high level of sequence polymorphism, cashmere goats
DRB3 gene were differentiated into two major categories alleles from 2 mutant alleles at first.
Key words: DRB3 gene Polymorphism Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism Hexi cashmere goat
2012年第9期 81罗秀刚等 ：河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 多态性分析
态性最丰富。对山羊 DRB3 基因的研究比较少，且
大多采用 PCR-RFLP 方法。Amills 等［12］利用 PCR-
RFLP 方法对西班牙部分山羊群体 DRB3 基因外显
子 2 的多态性进行了分析，共发现了 7 个等位基
因。孙东晓等［13］于 2004 年对蒙古山羊和哈萨克山
羊 DRB3 基因外显子 2 进行了 PCR-RFLP 多态性分
析，发现多态性较高，得到的 7 个等位基因，且与
Amills 等的报道完全一致，只是控制的基因型更多。
杨易等［14］用同样的方法对四川 4 个山羊品种进行
多态性分析，发现了 10 个等位基因，在 122、154、
168、220 和 241 位点为多碱基突变。但 PCR-RFLP
方法无法确定酶识别序列以外的变异，导致等位基
因的漏检，近年来发展起来的 PCR-SSCP 技术能够
准确有效地检测单核苷酸变异和等位基因数。2010
年，成述儒等［15］利用 PCR-SSCP 技术检测了 500 只
藏绵羊 DRB3 外显子 2 的多态性，结果发现了 35 个
等位基因，82 个核苷酸多态位点。证明 PCR-SSCP
技术大大提高了核苷酸多态位点及等位基因的检出
率。本研究采用快速检测 SNPs 的简易方法 PCR-
SSCP 法及克隆测序技术对河西绒山羊 DRB3 基因外
显子 2 的遗传多态性进行检测与分析，旨在确定河
西绒山羊 DRB3 基因的等位基因数和多态位点，分
析各等位基因间的遗传关系和进化意义，同时为山
羊抗病育种分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采集河西绒山羊 1 046 份血样。采样地点为
甘肃省肃北蒙古族自治县石包城乡，颈静脉采血 6
mL，加 ACD 抗凝剂 1 mL，-20℃冻存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 基因组 DNA 的提取采
用苯酚 -氯仿抽提法［16］，-20℃冻存。
1.2.2 引物设计、PCR 扩增及 SSCP 检测 参考文
献［12］和［17］以及 GenBank 数据库绵羊 MHC-
DRB 基因 Z11520 序列设计一对引物 ：
上游 ：5-TCCTCATTAGCCTCTCCCCA-3 ；
下游：5-TGGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3。
目的片段 309 bp。PCR 扩增体系 ：总体积为 20
μL，其中 10×PCR Buffer（15 mmol/L Mg2+）2.5 μL，
dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，上下游引物各为（10
pmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，
基因组 DNA（50 ng/μL）0.8 μL，超纯水 15 μL。反
应程序 ：预变性 94℃ 3 min ；变性 94℃ 1 min，退
火 57℃ 30 s，延伸 72℃ 50 s，35 个循环 ；最后延伸
72℃ 10 min，4℃保存。PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶
电泳检测。
取 2 μL 的 PCR 产物加入 8 μL 的变性上样缓冲
液中，98℃变性 10 min，冰浴 10 min。14% 的非变
性聚丙烯酰胺凝胶（Arc Bis= 37.5 1）220 V，15℃
电泳 22 h，银染法显色并扫描辨型。
1.2.3 克隆及测序 经 SSCP 分析辨型后，利用琼
脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收不同基因型个体 PCR
产物。回收后的 DNA 片段用 pGEM-T Easy 载体连
接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌（Escherichia
coli）DH5α 菌株，挑选 10 个优质菌落培养，菌液经
过 PCR 扩增和 14% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc：
Bis= 37.5 1）电泳（220 V，15℃，22 h），与纯合个
体进行比对鉴定后送北京六合华大基因科技股份有
限公司测序。
1.2.4 数据分析 Dnasp 4.0 用于核苷酸变异位点、
氨基酸变异位点和单倍型分析［18］；用 Clustal X 软件
进行核苷酸及氨基酸同源序列比对分析［19］；MEGA
3.0 用于系统发育分析［20］；SPSS 17.0 用于 Hardy-
Weinberg 平衡状态分析。
2 结果
2.1 PCR的扩增结果
PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测得到
一条清晰且特异性较好条带（图 1），可以进行下一
步的 SSCP 分析。
M.DL600 Marker ；1-7. 基因组 DNA PCR 产物
图 1 基因第 2外显子 PCR扩增产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期82
2.2 PCR-SSCP检测结果
对 PCR 扩增产物进行 SSCP 检测辨型后，对不
同杂合基因型个体的 PCR 产物纯化并克隆。杂合个
体菌液 PCR 产物与纯合个体基因组 PCR 产物同时
进行 SSCP 分析，以确定测序菌落。图 2-A 中 1-18
泳道为纯合个体基因组 PCR 产物 SSCP 检测结果，
图 2-B、图 2-C 中 1-16 泳道为菌液 PCR 产物 SSCP
检测结果，并与图 2-A 中 1-16 泳道纯合个体基因组
PCR 产物 SSCP 检测结果一一对应，其他泳道为杂
合个体基因组 PCR 产物 SSCP 检测结果。杂合个体
基因组 PCR 产物 SSCP 检测的条带均可与菌液 PCR
产物 SSCP 检测的条带对应。确定图 2-A 中的 18 个
纯合基因型对应单倍型 LG001-LG018 为测序等位基
因，控制 31 个基因型。
显子 2 的等位基因，分别定义为 LG001-LG018。除
去引物序列，对 18 个 DRB3 第 2 外显子 267 bp 单
倍型序列进行比对分析（图 3），共发现 44 个变异
位点，占分析位点的 16.48%。其中转换位点 16 个，
占变异位点的 36.36%，包括 G/A 的转换位点 10 个，
T/C 的转换位点 6 个。颠换位点 19 个，占变异位
点的 43.18%。9 个位点既有转换也有颠换，占变异
位点的 20.46%。由此看来，DRB3 第 2 外显子的变
异中颠换占较大比例。研究获得的 18 个单倍型序
列与 GenBank 下载的 2 个 DRB3 单倍型序列（登录
号 ：AY496061，AF376809）比对，发现等位基因
LG017、LG018 的序列与之相同，有 16 个 DRB3 基
因的等位基因为本研究首次发现（LG001-LG016）。
2.4 氨基酸序列差异分析
河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 的氨基酸序列
分析（图 4）显示，共发现 18 个氨基酸序列，在 18
个序列中共存在 89 个氨基酸位点，共有 29 个变异
位点，占 32.58%（29/89）。
2.5 基因型频率、基因频率统计及χ2适合性检验
对 1 046 只河西绒山羊的 DRB3 基因外显子 2
检测后分型，统计各基因型的个体数，计算基因型
和等位基因频率，见表 1。结果表明，LG005 等位
基因为优势基因，就基因型而言，LG005*005 基因
型频率最大。经 χ2 适合性检验，河西绒该位点偏离
了 Hardy-Weinberg 平衡状态（P<0.05）。
2.6 遗传多态指数
DRB3 基因外显子 2 在群体中的观察杂合度
（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、
有效等位基因数（Ne），见表 2。
2.7 系统发育分析
为了分析河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 各等
位基因间的遗传关系，构建 NJ 树（图 5）。所用序
列包括本研究获得的所有 18 个单倍型序列，其中
单倍型序列 LG017、LG018 与 GenBank 基因库下载
的 2 个 DRB3 等位基因序列（登录号 ：AY496061，
AF376809）相同。图 5 显示，河西绒山羊 DRB3 基
因第 2 外显子序列系统树呈现两支分化趋势。在Ⅰ
支中有 14 个 DRB3 等位基因序列，在Ⅱ支中有 4 个
DRB3 等位基因序列。
1-16. 菌液 PCR-SSCP 检测结果 ； 17-22. 基因组 DNA PCR-SSCP 检测结果
图 2 DRB3基因第 2外显子的 PCR-SSCP检测
2.3 等位基因核苷酸多态位点及差异分析
经 PCR-SSCP 检测辨型，克隆测序和序列比对
分析，共有 18 个 DRB3 基因外显子 2 单倍型被确定，
即 1 046 只河西绒山羊共检测到 18 个 DRB3 基因外
2012年第9期 83罗秀刚等 ：河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 多态性分析
图 3 DRB3基因第 2外显子等位基因核苷酸比对结果
图 4 DRB3 基因第 2外显子等位基因氨基酸序列比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期84
3 讨论
河西绒山羊是中国三个固有地方绒山羊品种之
一，产于甘肃省河西走廊的肃北蒙古族自治县和肃
南裕固族自治县，分布于酒泉、武威、张掖市的各
县，群体总量 70 万只左右。该品种是在当地自然条
件下，通过产区蒙古族和裕固族人民长期选育而形
成的，是以产绒为主的地方山羊品种。河西绒山羊
产绒量 280 g 左右，净绒率 50.0%，成年羊屠宰率为
43.6%-44.3%。母羊不仅产绒毛、产羔，而且还生
产羊奶（人工挤奶 150 d，每只母羊可挤奶 60 kg 左
右）。该品种在甘肃、青海和宁夏等地具有较大影响。
3.1 河西绒山羊DRB3基因第2外显子多态性
本研究对河西绒山羊 DRB3 基因第 2 外显子进
行了多态性分析，结果显示河西绒山羊在该基因位
点具有丰富的多态性。对该多态性片段序列测定分
析，发现 44 个突变位点，占分析位点的 16.48%，
且很多位点存在多碱基突变。通过氨基酸序列比对，
进一步发现这些位点的核苷酸突变大多引起了相应
氨基酸的突变。这一结果与 Amills 等［12］的研究相比，
是一个新的突破，充分说明了河西绒山羊生活环境
的复杂多变性，同时也暴露了 PCR-RFLP 方法存在
的不足。检测所得 DRB3 基因第 2 外显子突变位点
表 1 河西绒山羊 DRB3基因外显子 2的基因型频率和等位基因频率
基因型 个体数 基因型频率 基因型 个体数 基因型频率 等位基因 等位基因频率
LG001*001
LG002*002
LG003*003
LG004*004
LG005*005
LG006*006
LG007*007
LG008*008
LG009*009
LG010*010
LG011*011
LG012*012
LG013*013
LG014*014
LG015*015
LG016*016
LG017*017
LG018*018
162
28
62
36
180
16
28
36
26
48
16
12
8
32
16
16
16
26
0.1549
0.0268
0.0593
0.0344
0.1721
0.0153
0.0268
0.0344
0.0249
0.0459
0.0153
0.0115
0.0076
0.0306
0.0153
0.0153
0.0153
0.0249
LG001*004
LG001*008
LG001*014
LG003*005
LG003*013
LG004*010
LG005*009
LG005*010
LG005*012
LG005*014
LG005*015
LG005*016
LG009*015
12
28
32
20
22
16
8
30
20
24
20
24
26
0.0115
0.0268
0.0306
0.0191
0.0210
0.0153
0.0076
0.0286
0.0191
0.0229
0.0191
0.0229
0.0249
LG001
LG002
LG003
LG004
LG005
LG006
LG007
LG008
LG009
LG010
LG011
LG012
LG013
LG014
LG015
LG016
LG017
LG018
0.1893
0.0268
0.0793
0.0478
0.2419
0.0153
0.0268
0.0478
0.0411
0.0677
0.0153
0.0210
0.0182
0.0574
0.0373
0.0268
0.0153
0.0249
表 2 河西绒山羊 DRB3基因多态指数
种群 观察杂合度（Ho） 期望杂合度（He） 有效等位基因数（Ne） 多态信息含量（PIC）
河西绒山羊 0.269 6 0.879 6 1.369 1 0.869 9
图 5 DRB3基因第 2 外显子核苷酸序列的 NJ树
2012年第9期 85罗秀刚等 ：河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 多态性分析
的产生是否对该基因在河西绒山羊这一物种上的表
达调控、DRB3 结构等具有影响，进而对疾病的抗
性产生作用，有待开展分子标记与疾病抗性相关指
标进行深入分析研究。
3.2 河西绒山羊DRB3基因的遗传特性
本研究利用 PCR-SSCP 分析了 1 046 只河西绒
山羊 DRB3 基因第 2 外显子的遗传特性，结果显示，
共发现 18 个等位基因控制的 31 个基因型，且主要
以纯合型存在。无论是等位基因数，还是基因型数
都比孙东晓等［13］的报道要多，说明 PCR-SSCP 技术
大大提高了等位基因的检出率。经 χ2 适合性检验，
该群体偏离了 Hardy-Weinberg 平衡状态（P<0.05），
说明经过长期进化和选择，该群体形成了适应其生
存环境的遗传特性。在该多态位点的遗传多态指数
分析中，多态信息含量 PIC>0.5，说明该位点多态性
极丰富，而有效等位基因数仅为 1.369 1，表明河西
绒山羊杂合程度相对较低，遗传变异小，适应高原
恶劣环境的能力较强。
3.3 河西绒山羊系统发育特点
河西绒山羊 DRB3 基因外显子 2 序列的聚类分
析呈两支分化趋势，这表明河西绒山羊 DRB3 基因
在进化过程中，最初可能是由 2 个等位基因突变分
化成两大类等位基因的。在Ⅰ支中的等位基因数（14
个）明显高于Ⅱ支中的等位基因数（4 个），且遗传
关系较近。因此，Ⅱ支等位基因也可能由Ⅰ支等位
基因突变产生。
总之，以上所有问题以及河西绒山羊 DRB3 基
因外显子 2 是否还存在其他多态位点及等位基因，
有待于排除采样过程的限制因素和增加样本量进行
进一步的研究验证。
4 结论
本研究通过对 1 046 只河西绒山羊 DRB3 基因
第 2 外显子多态性的研究，共发现 18 个等位基因，
且存在 44 个核苷酸多态位点，29 个氨基酸多态位
点，说明该基因位点多态性丰富，适应其不断变化
的生存环境 ；河西绒山羊 DRB3 基因第 2 外显子系
统发育树呈两支分化趋势，推断其各等位基因最
初可能是由 2 个等位基因突变分化成两大类等位基
因的。
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（责任编辑 狄艳红）
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关的临床医学各学科，注重生物医学工程学在临床医学中的应用研究和新技术、新经验、新成果的推广。以生物医学工程
高起点为目标，以突出临床医学为特色，内容涉及医疗仪器、生物力学、生物材料、人工器官、生物控制、生物医学信息
测量与处理等领域的研究，以及临床工程等方面。临床内容包括影像、超声、介入医学、电生理、骨科、腔镜、临床检验、
放射（射频）治疗、人工器官和血液净化、医疗器械及普外、神经微创、干细胞治疗等。《生物医学工程与临床》在《中国
生物医学文献数据库》、《中文生物医学期刊文献数据库》、《中文科技期刊数据库》中可以检索到，在《万方数据——数字
化期刊群》、《中国知网》、《维普资讯网》等网上都能搜索到。
杂志为大 16 开，96 页，双月刊（每年单月 25 日出版），国内外公开发行。中国标准刊号 ：ISSN 1009-7090，CN
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