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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）存在于
所有动物、高等植物以及微生物的细胞膜中，是细
胞膜磷脂成分之一。人体中的 PS 主要集中于大脑，
约占大脑磷脂总量的 15%。PS 的出现对于由年龄引
起的心智退化和老年性痴呆等疾病有着积极的预防
作用［1］。目前 PS 产品主要是由大豆中提取的磷脂
酰胆碱与丝氨酸经酶催化而来，且此法生产成本较
收稿日期 ：2012-10-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21076159），国家“863” 项目（2011AA100905-4），长江学者和创新团队发展计划项目（IRT1166）
作者简介 ：佟新伟，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail ：tlb2010@126.com
通讯作者 ：路福平，男，博士，教授，研究方向 ：微生物生物活性物质开发级工业微生物育种等 ；E-mail ：lfp@tust.edu.cn
大肠杆菌 sdaA、sdaB、pgpB 基因的敲除及其对磷脂酰
丝氨酸合成的影响
佟新伟  杨泓喆  李玉  路福平
（天津科技大学生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室
天津市工业微生物重点实验室， 天津 300457）
摘 要 ： 利用 Red 同源重组技术敲除大肠杆菌 sdaA、sdaB 和 pgpB 基因，阻断大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成途径中的底物 L-
丝氨酸和磷酸乙醇酸的部分分解代谢，以达到提高磷脂酰丝氨酸在菌体内含量的目的。将出发菌株和重组菌株进行摇瓶发酵，发
酵 1 000 min 后，采用高效液相色谱法分析磷脂酰丝氨酸的产量。试验结果表明 sdaA、sdaB、pgpB 基因敲除后，磷脂酰丝氨酸在
菌体总磷脂中的含量提高了一倍多，说明通过基因工程手段改变大肠杆菌中磷脂酰丝氨酸合成的部分代谢途径，初步获得磷脂酰
丝氨酸产量提高的菌株，具有较好的应用前景。
关键词 ： 大肠杆菌 基因敲除 磷脂酰丝氨酸 Red 重组系统 高效液相色谱
The Effect on Phosphatidylserine Biosynthesis of Gene sdaA，sdaB，
pgpB in Escherichia coli
Tong Xinwei Yang Hongzhe Li Yu Lu Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，
Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，The College of Biotechnology，
Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）
Abstract:  The gene sdaA, sdaB, pgpB were deleted in Escherichia coli by the technology of Red homologous recombination system,
resulting in the cut-off of part of the L-serine and PGP catabolic pathway, then the levels of phosphatidylserine（PS）could be elevated. To
assess the effects of sdaA, sdaB, pgpB deletion on PS accumulation, both the recombinant and recipient strains were cultivated in LB-containing
flasks. Then the samples were taken after 1 000 minutes and quantification of PS performed with HPLC. The results showed that the recombinant E.
coli cells produced PS one fold more than the wild-type strain, suggesting the effectiveness of targeted alteration of the metabolic pathways of PS
for improvement of PS production. Cost-effective large-scale production of PS should find important applications in various industrial fields.
Key words:  Escherichia coli Gene knockout Phosphatidylserine Red homologous recombination system HPLC
高，产品稳定性较差，成为开发 PS 医药价值的瓶
颈。本研究以遗传背景清晰的大肠杆菌为研究对象，
初步探索提高 PS 在菌体中积累量的途径。在大肠杆
菌代谢途径中，PS 是由 L-丝氨酸和胞苷二磷酸甘油
二酯经 PS 合成酶催化合成的。针对底物 L-丝氨酸，
Su 等［2，3］研究表明，大肠杆菌中 sdaA 基因是编码 L-
丝氨酸脱氨酶（L-SerDH）的结构基因，同时 Shao 等［4］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期124
的研究表明大肠杆菌中 sdaB 基因与 sdaA 基因相似，
也是编码 L-SerDH 的结构基因。L-SerDH 能催化 L-
丝氨酸产生丙酮酸，减少 L-丝氨酸流向磷脂酰丝氨
酸的代谢流。此外，磷酸乙醇酸（PGP）能激活 PS
合成酶的活性。Icho 和 Funk 等［5，6］ 的研究表明，
pgpA、pgpB、pgpC 三个基因所分别编码的磷脂酰甘
油、磷酸酯、磷酸酶都可催化 PGP 产生磷酸甘油酸。
但以上分别针对大肠杆菌 sdaA、sdaB、pgpB 基因的
研究均未提及对 PS 合成的影响。Ishinaga 等［7］也只
是通过大肠杆菌细胞膜上的 PS 合成酶来研究磷脂酰
乙醇胺的生物合成，并未研究 PS 在菌体中的积累量。
Hawrott 等［8］研究了通过 psd 基因的突变，改变了催
化 PS 降解的酶的酶学特性，使 PS 在大肠杆菌中积
累，并研究 PS 积累后对菌体生长的影响。同时，针
对 L-丝氨酸和 PGP 分解代谢的调节以研究其对大肠
杆菌 PS 合成的影响也未见报道。
在大肠杆菌中 L-丝氨酸作为合成 PS 的底物，
而 PGP 作为激活 PS 合成酶活性的物质均与 PS 的合
成代谢密切相关。因此为提高 PS 在大肠杆菌中的积
累量，可通过削弱 L-丝氨酸及 PGP 的分解途径，使
更多的底物 L-丝氨酸和更多的激活物质 -PGP 参与
PS 的合成，从而提高 PS 的合成速率，以实现 PS 在
菌体中积累量的提高。本研究通过 Red 同源重组系
统对大肠杆菌的 sdaA、sdaB、pgpB 基因进行敲除，
以削弱 L-丝氨酸及 PGP 的分解途径，并经高效液相
色谱法测定敲除前后 PS 积累量的变化，初步构建
PS 积累量提高的菌株，旨在为今后 PS 的生物合成
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、质粒和培养基 所用菌种 Escherichia
coli K12（△ sdaA），所用质粒 pKD46、pKD3、pCP20
均为本实验室保存。质粒 pKD46 是温度敏感型低拷
贝质粒，42℃不复制，且在此温度下质粒丢失，L-
阿拉伯糖诱导后表达 gam、bet 和 exo 3 种 λ 噬菌体
重组酶。质粒 pKD3 作为 PCR 扩增氯霉素抗性基因
（抗性基因两侧含有 FRT 位点）的模板，提供筛选
标记。质粒 pCP20 在 42℃时诱导 FLP 重组酶表达，
质粒也逐渐丢失，该质粒用于消除 FRT 位点间的氯
霉素抗性基因。所用培养基为 LB 培养基、LA 培养基。
1.1.2 引物 用于扩增氯霉素抗性基因的长度为 70
bp 的引物 ：5 端为目的基因两侧外部 50 bp 的同源
臂（下划线部分），3 端为 20 bp 的用于扩增质粒
pKD3 上氯霉素抗性基因的引物（表 1）。
表 1 引物序列
敲除基因 带同源臂的引物 鉴定引物
sdaB 基因
sdaB-PH15-CGCGCCGCTTTCGGGCGGCGCTTCCTCCGTTTTAACGCG
ATGTATTTCCTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3
sdaB-PH25-GGATGAGAAATCGGGAAGAGGCCTCGCAAAACGAGGC
CTTTGGAGAGCGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3
sdaB-Pout1
5-TCCTGTTCCTGATGCCGATG-3
sdaB-Pout2
5-GGTTGGCTGGCTGTGCATAA-3
pgpB 基因
pgpB-PH15-GAACTGGCGTTTTCAGTTATGATTGTGGGACTTATCAA
AAAGGAGAGGCCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3
pgpB-PH25-CACACGCATTGTTGATGATTTAAGGGCTAAATTCGGAA
AATCAACCAGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3
pgpB -Pout1
5-TTCACGGAATGGCACAAATC-3
pgpB-Pout2
5-GGTCAACTTACCGCAATAGCC-3
1.2 方法
1.2.1 基因的敲除（以 sdaB 基因的敲除为例）［9-12］
使用 Red 同源重组系统（图 1）对 sdaB 基因的敲
除步骤 ：（1）以 pKD3 为模板，用引物 sdaB-PH1 和
sdaB-PH2 扩增氯霉素抗性基因，得到两端带有 FRT
位点和同源臂的抗性基因线性片段，如图 1-a 所示 ；
（2）利用 L-阿拉伯糖诱导菌体内的质粒 pKD46，使
其表达 exo、bet 和 gam 3 个重组酶，并制备成感受
态细胞，将上步得到的线性片段电转进此感受态细
胞中，线性片段上的同源臂与基因组上的同源区域相
识别，如图 1-b 所示 ；（3）带同源臂的线性片段与基
因组上的同源区域发生同源重组，如图 1-c 所示，用
引物 sdaB-Pout1 和 sdaB-Pout2 鉴定发生同源重组的菌株；
（4）将质粒 pCP20 电转入发生同源重组的菌体后，
2013年第4期 125佟新伟等 ：大肠杆菌 sdaA、sdaB、pgpB 基因的敲除及其对磷脂酰丝氨酸合成的影响
42℃诱导其表达 FLP 重组酶，此酶将 FRT 位点间的
序列及一个 FRT 位点切除（图 1-d），用引物 sdaB-
Pout1 和 sdaB-Pout2 鉴定基因组上抗性基因切除的菌株。
物，扩增出两端 50 bp 与 sdaB 基因上下游相邻基因
序列同源，中间为氯霉素抗性基因的 DNA 线性片段。
结果（图 2-A）显示，片段大小约 1 100 bp，与理论
值（1 133 bp）相符，说明两端分别含有 50 bp 同源
臂中间为 1 033 bp 氯霉素抗性基因的线性片段扩增
成功。
2.1.2 同源重组子筛选鉴定 分别以氯霉素平板上
长出的菌落和出发菌株为模板，用引物 sdaB-Pout1 和
sdaB-Pout2 进行菌落 PCR 鉴定。图 2-B 显示，出发菌
株 E. coli K12（△ sdaA）的 PCR 产物大小约为 1 800
bp，发生同源重组的菌株的 PCR 产物略小于 1 500
bp，两片段长度的大小均与理论值相符（理论值分
别为 1 788 bp 和 1 453 bp），说明在同源重组子染色
体上 sdaB 基因已完全被氯霉素抗性基因取代。PCR
产物经测序后，与预期的序列相符。
2.1.3 氯霉素抗性基因切除的验证 取经 42℃诱
导，挑取无抗性的 LA 平板上长出的菌落，用引物
sdaB-Pout1 和 sdaB-Pout2 进行菌落 PCR 鉴定。同源重
组子基因组上的氯霉素抗性基因切除后 PCR 产物的
大小约为 520 bp。如图 2-C 所示，片段长度与预计
值（515 bp）相符，说明氯霉素抗性基因已被完全
切除。PCR 产物经进一步测序后，所得序列与预期
相符，证明在重组菌株染色体上 cat 基因被完全消
除。此菌种为 sdaA、sdaB 基因缺失的菌株 E. coli K12
（△ sdaA △ sdaB）。
带FRT位点的氯
霉素抗性基因
FRT
a
b
c
d
FRT
H1
H1 H2
H2
50 bp
Gene A
FRT
Gene A
Gene A Gene B
Gene B
FRT
FRT
Gene BⴞⲴสഐ
50 bp
a ：同源臂线性片段 ；b ：同源序列的识别 ；c ：同源重组的发生 ；
d ：抗性基因的切除
图 1 本试验中 Red 同源重组系统
1.2.2 sdaA、sdaB、pgpB 基因的敲除对磷脂酰丝氨
酸合成的影响
1.2.2.1 生长曲线的测定 在装有 200 mL LB 培养
基的三角瓶（500 mL）中按 2.5% 的接种量接种，至
OD 值为 0.2，然后每隔 2 h 测定 OD 值，绘制菌株在
200 mL LB 培养基中的生长曲线。
1.2.2.2 总磷脂的提取 取处于稳定期的全部菌液
离心，用生理盐水洗涤 3 次，置于 -70℃冷冻干燥机，
干燥 12 h，获得待测样品。称重并按 mg∶mL ＝ 1∶1
的比例加入提取液（氯仿∶甲醇 =2 mL∶1 mL）震
荡或搅拌 48 h 后，离心，取上清液加入旋蒸仪中，
室温下旋转干燥，干燥后，加入氯仿溶解提取出的
总磷脂，取出置于室温下干燥即得总磷脂待测样品。
1.2.2.3 测定磷脂酰丝氨酸的含量［8，13-16］ 利用高
效液相色谱分析总磷脂中 PS 含量的变化。采用 C18
色谱柱（2500 mm×4.6 mm，5 μm），柱温 31℃，流
量 1.0 mL/min，检测器为蒸发光散射检测器 ；流动
相为醋酸铵∶甲醇∶乙腈 =8∶46∶46。
2 结果
2.1 sdaB基因的敲除
2.1.1 含 有 FRT 位 点 和 同 源 臂 的 线 性 片 段 的 扩
增 以质粒 pKD3 为模板，sdaB-PH1 和 sdaB-PH2 为引
1500
bp bp bp
M 1 M 2 M 43
1000
2000
1500
A B C
750
500
M ：DNA Marker ；1 ：带同源臂的线性片段 ；2 ：出发菌株 ；3 ：同
源重组的菌株 ；4 ：切除抗性基因的菌株
图 2 sdaB 基因的敲除鉴定
2.2 pgpB基因的敲除
2.2.1 含 有 FRT 位 点 和 同 源 臂 的 线 性 片 段 的 扩
增 以质粒 pKD3 为模板，pgpB-PH1 和 pgpB-PH2 为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期126
引物，扩增同源臂线性片段，结果（图 3-A）显示，
片段大小约 1 100 bp，与理论值（1 133 bp）相符，
说明两端分别含有 50 bp 同源臂中间为 1 033 bp 氯
霉素抗性基因的线性片段扩增成功。
2.2.2 同源重组子筛选鉴定 分别以氯霉素平板上
长出的菌落和出发菌株 E. coli K12（△ sdaA △ sdaB）
为 模 板， 用 引 物 pgpB-Pout1 和 pgpB-Pout2 进 行 菌 落
PCR 鉴定。图 3-B 显示，出发菌株的 PCR 产物大小
略低于 1 000 bp，发生同源重组的菌株的 PCR 产物
大小约为 1 300 bp，两片段长度的大小均与理论值
相符（理论值分别为 961 bp 和 1 229 bp），说明在同
源重组子染色体上 pgpB 基因已完全被氯霉素抗性基
因取代。PCR 产物经测序后，与预期的序列相符。
2.2.3 氯霉素抗性基因切除的验证 取经 42℃诱
导，挑取在无抗性的 LA 平板上长出的菌落，用引
物 pgpB-Pout1 和 pgpB-Pout2 进行菌落 PCR 鉴定。同源
重组子基因组上的氯霉素抗性基因切除后 PCR 产物
的大小略大于 250 bp。如图 3-C 所示，片段长度与
预计（291 bp）相符，说明氯霉素抗性基因已被完
全切除。PCR 产物经进一步测序后，所得序列与预
期相符，并获得了 sdaA、sdaB、pgpB 基因缺失的菌
株 E. coli K12（△ sdaA △ sdaB △ pgpB）。
菌体内催化相应代谢的酶量不足，导致菌体生长速
度受到限制。在稳定期时，缺失基因的菌株菌液浓
度明显比出发菌株要低，且较出发菌株提前进入衰
亡期，使其处于稳定期的时间较短。将培养 1 000
min 处于稳定期的菌液离心、洗涤、冷冻干燥后得
到菌体干重 ：出发菌株 0.25 g，敲除后的菌株 0.18 g。
1500
bp bp bp
M 1 M 2 M 43
1000
750
1500
1000
750
A B C
250
500
M ：DNA Marker ；1 ：带同源臂的线性片段 ；2 ：同源重组的菌株 ；
3 ：出发菌株 ；4 ：切除抗性基因的菌株
图 3 pgpB 基因的敲除鉴定
2.3 基因敲除后对生长的影响
图 4 显示，在 400 mL 的 LB 培养基中，当接种
量相同，且起始的 OD 值都为 0.210±0.05 时，开始
生长的前 2 h 里，菌株 E. coli K12（△ sdaA △ sdaB
△ pgpB）较出发菌株生长缓慢。由于缺失 3 个基因，
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600⭏䮯ᰦ䰤˄min˅
O
D
60
0
E.coli K12˄ƸsdaA˅ E.coli K12˄ƸsdaAƸsdaBƸpgpB˅
图 4 生长曲线
2.4 基因敲除对磷脂酰丝氨酸合成的影响
2.4.1 标准曲线的绘制 将 PS 标准品溶于氯仿中配
置成标准溶液 ：0.020 1、0.112 1、0.221 3、0.321 6
和 0.423 4 mg/mL，然后进行液相色谱分析，氯仿的
出峰时间在 1.8 min 左右，PS 的出峰时间在 3.2 min
左右（图 5-A），用浓度对数及峰面积对数做线性得
到 PS 标准曲线（图 5-B）。
y = 3.0053x + 7.5922
0
1
2
3
4
5
6
7
-1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0ḷṧ⎃ᓖⲴሩᮠ٬
ḷṧጠ䶒〟Ⲵሩᮠ٬
300
200
LS
U
100
150
250
50
1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
时间(min)
A
B
2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4
3.
21
4
1.
84
2
0
R2 = 0.9991
A ：PS 的液相色谱检测 ；B ：PS 的标准曲线
图 5 磷脂酰丝氨酸的检测
2013年第4期 127佟新伟等 ：大肠杆菌 sdaA、sdaB、pgpB 基因的敲除及其对磷脂酰丝氨酸合成的影响
2.4.2 总磷脂中磷脂酰丝氨酸的测定 将上述得到
的干菌体样品，经氯仿甲醇提取，得到总磷脂（干重）
为出发菌株 18.22 mg，敲除后菌株 13.86 mg。可以
看出用此方法提取出的总磷脂约占菌体干重的 7%。
将总磷脂溶于纯氯仿中，配成浓度为 0.500 0 mg/mL
的溶液，取 10 μL 进样，经高效液相色谱检测，所
测样品中出发菌株磷脂酰丝氨酸的含量为 0.060 5
mg/mL，敲除成功的菌株的磷脂酰丝氨酸含量 0.121 5
mg/mL。基因敲除成功后，磷脂酰丝氨酸在总磷脂
中的所占的百分比从 12.1% 提高到 24.3%。
3 讨论
大肠杆菌虽然能合成磷脂酰丝氨酸，但其合成
与 L-丝氨酸的代谢和磷脂的代谢密切相关，且受到
严格调控，因此在野生型的菌株总磷脂中，磷脂酰
丝氨酸的含量并不高。本研究以大肠杆菌已有磷脂
酰丝氨酸合成途径为研究对象，依据磷脂酰丝氨酸
合成代谢原理，从分子水平上改造部分 L-丝氨酸代
谢途径和磷脂代谢途径，即分别敲除 sdaA、sdaB 和
pgpB 基因，使更多的代谢流流向磷脂酰丝氨酸。3
个基因成功敲除的菌株和出发菌株进行发酵特性的
对比，结果显示，在同样的接种条件下接种后，在
起始生长的 90 min 内，敲除成功的菌株较出发菌株
生长缓慢，且菌液 OD 值在以后的生长过程中一直
低于出发菌株。这是由于 sdaA、sdaB 基因（都编码
L-丝氨酸脱氨酶）敲除后，只有 tdcG 基因所编码的
L-丝氨酸脱氨酶催化 L-丝氨酸合成丙酮酸，使菌体
内丙酮酸的合成速率受到一定的影响。虽然菌体内
还有其它丙酮酸合成途径，但丙酮酸作为重要的代
谢中间产物参与大量生化反应，菌体内丙酮酸合成
速率的细微变化也会影响到菌体生长速度和细胞分
裂速度。同理，pgpB 基因的缺失，也会影响到菌体
内心磷脂的合成，使细胞膜的合成受到一定的影响。
且敲除后的菌株，在生长稳定期得到的总菌体干重
要比出发菌株 0.1 g 左右，经提取总磷脂检测，磷脂
酰丝氨酸在总磷脂中的含量从 12.1% 提高到 24.3%，
这虽然与 Hawrott 等［8］的研究结果还有一定差距，
但是本试验中 PS 的积累是通过调节 PS 的合成代谢
途径实现的，对 PS 的分解代谢并未给予阻断或者削
弱，这为以后在此菌株的基础上经类似对 psd 基因
的改造，调节 PS 的分解代谢，构建磷脂酰丝氨酸积
累量进一步提高的工程菌株奠定了基础。
4 结论
本 研 究 利 用 Red 同 源 重 组 技 术 获 得 了 一 株
sdaA、sdaB 和 pgpB 3 个基因同时缺失的大肠杆菌，
成功阻断大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成途径中的底物
L-丝氨酸和磷酸乙醇酸的部分分解代谢，将缺陷菌
株和出发菌株进行摇瓶发酵，发酵 2 h 内，缺陷菌
株较出发菌株，生长缓慢，而在稳定期时，缺陷菌
株菌液浓度明显比出发菌株要低，且较出发菌株提
前进入衰亡期。发酵 1 000 min 后，采用高效液相色
谱法分析磷脂酰丝氨酸的产量。试验结果表明 3 个
基因都缺失后，磷脂酰丝氨酸在菌体总磷脂中的含
量从 12.1% 提高到 24.3%，为经微生物发酵法生产
磷脂酰丝氨酸奠定了基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）