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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):119-124
干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫是影响作
物生长发育和产量的重要限制因子。为了维持整个
植株细胞活动的完整性，植物通过各种各样的机制
来适应不良胁迫［1］。迄今为止，人们已经从各种植
物中分离和鉴定了许多胁迫应答相关的基因，如锌
指蛋白、转录因子和离子通道等［2］。
其中，具有“手指状”结构域的锌指蛋白（Zinc
finger protein），是一类在调节植物防卫基因表达和
抗性反应上起关键作用的蛋白［3］。该蛋白在真核
生物基因组中十分丰富，根据半胱氨酸（Ｃ）和组
氨酸（Ｈ）残基的数目和位置，可将锌指结构分为
C2H2、C4 和 C6 三 个 亚 类［4］。 其 中 C2H2 型 锌 指
蛋白是真核生物中最大的转录因子，同时也是研究
得最为清楚的一类，广泛参与植物的发育过程和非
生物响应过程［5］。在一些研究中，过量表达 C2H2
型锌指蛋白不仅可以提高耐盐、干旱、冷胁迫，还
可以改变胁迫响应过程中下游基因的表达及信号传
导［6，7］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过量表
达锌指蛋白基因 AZF1和 AZF3，可提高植物的耐
盐性和耐冷性［6］，表明它们参与到植物的耐盐和耐
收稿日期 ：2014-12-01
基金项目 ：国家自然科学基金项目（U1303302），国家大学生创新性项目（201410759017）
作者简介 ：王崎崎，男，研究方向 ：植物遗传与基因组学 ；E-mail ：1378717616@qq.com
通讯作者 ：黄先忠，男，教授，研究方向 ：植物遗传与基因组学 ；E-mail ：xianzhongh@shzu.edu.cn
无苞芥锌指蛋白基因 OpZFP 提高烟草耐盐性的研究
王崎崎  郭丹丽  吴晓庆  费春艳  黄先忠
（石河子大学生命科学学院 农业生物技术重点实验室，石河子 832003）
摘 要 ： 旨在研究 C2H2 型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个
单锌指基因 OpZFP，利用叶盘法将 OpZFP 基因转入普通烟草中。半定量 RT-PCR 表明，在转基因植株中 OpZFP 基因能够高效表达。
烟草耐盐性分析显示，在高盐胁迫下，转基因植株的根长要长于野生型植株，且转基因烟草丙二醛（MDA）的含量要明显低于野
生型植株 ；并且高盐胁迫处理，野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明，过量表达 OpZFP 的转基因植
株可以提高植物对盐胁迫的抗性。
关键词 ： 无苞芥 ；锌指蛋白 ；耐盐 ；烟草
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.020
A Study on OpZFP Increasing Salt Tolerance of Nicotiana tabacum
Wang Qiqi Guo Danli Wu Xiaoqing Fei Chunyan Huang Xianzhong
（Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi 832003）
Abstract:  To research the role of C2H2 zinc finger protein in signal transduction under abiotic stresses and the developmental processes
of plant, an OpZFP was cloned from Olimarabidopsis pumila in Xinjiang. An OpZFP was the single C2H2 gene cloned from Olimarabidopsis
pumila in Xinjiang. Analysis of semi-quantitative RT-PCR indicated that OpZFP was successfully expressed in the transgenic tobacco.
Interestingly, the overexpressed transgenic plants showed more tolerance to salt stress compared with the wild plants. Under high salt stress, the
root lengths of transgenic plants were longer, and they contained lower MDA contents than the wild type. Further experiments revealed that the
transgenic plants had a lower degree of bleaching than the wide type ones. These results indicated that the OpZFP-overexpressing transgenic
plants could enhance plant resistance to salt stress.
Key words:  Olimarabidopsis pumila ；zinc finger protein ；salt tolerance ；Nicotiana tabacum
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10120
冷反应过程 ；矮牵牛（Petunia）中的 C2H2 型锌指
蛋白 ZPT2-2 在胁迫诱导后表达量上调，过量表达
ZPT2-2 可增强矮牵牛的耐旱性［8］；大豆（Glyycine
soja）C2H2 型锌指蛋白 GsZFP1 在拟南芥中过量表
达，可增加拟南芥耐冷耐旱反应过程［9］；在苜蓿中
异位表达可增加苜蓿的耐盐耐旱性［10］。尽管对锌指
蛋白的研究很多，但是在大多数植物中 C2H2 型锌
指蛋白的生理和生化功能还不清楚。
无苞芥俗称新疆小拟南芥，具有比拟南芥更
耐高盐胁迫的生理特性［11］。前期从无苞芥中克隆
到了 C2H2 型锌脂蛋白基因 OpZFP，该基因全长为
684 bp，编码 174 个氨基酸。表达分析表明 OpZFP
基因受高盐、干旱和低温等胁迫的诱导表达，分析
OpZFP 基因启动子序列，发现该基因启动子上有多
个与胁迫相关的顺式作用元件［12］，暗示着 OpZFP
基因可能参与到无苞芥的耐逆胁迫反应过程。本研
究构建过量表达载体，通过叶盘法转化烟草［13］，对
转基因烟草进行耐盐分析，旨在为进一步研究该基
因的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
烟草（Nicotiana tobacum）种子为本实验室保存，
种子的灭菌和室内培养参照文献［14］的方法进行。
大肠杆菌菌株 DH5α、质粒 pCAMBIA2300-CaMV35S
由本实验保存；质粒 pMD18-T vector、限制性内切酶、
Ex Taq、IPTG、X-Gal 购自 TaKaRa 公司 ；凝胶回收
试剂盒购自 Promega 公司。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 构建过量表达载体 将前期得到的测序正确
的质粒 pMD18-T ：OpZFP［12］用 Kpn Ⅰ和 BamH Ⅰ酶
切回收目的片段，同时用同样的酶对 pCAMBIA2300-
CaMV35S-OCS 载体进行双酶切，回收质粒大片段，
经 T4 连接酶（TaKaRa）连接。将连接产物 p35S ：
OpZFP 经热激法转化 DH5α 感受态细胞，挑取单克
隆进行菌落 PCR 鉴定，提取质粒，进行酶切鉴定。
1.2.2 转基因烟草的鉴定 将鉴定正确的质粒，通
过冻融法转化农杆菌 GV3101 菌株，用叶盘法［13］转
化烟草，将获得的烟草再生苗移植到恒温培养室中
进行培养。用 CTAB 法提取烟草再生苗 DNA，用引
物 KpnⅠ-OpZFP-F 和 BamHⅠ-OpZFP-R（ 表 1） 进
行 PCR 鉴定，PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 3 min ；
94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30
个循环 ；72℃延伸 10 min。用 1% 的琼脂糖凝胶电
泳鉴定。将鉴定正确的烟草植株，通过半定量 RT-
PCR 分 析 烟 草 过 量 表 达 植 株 中 OpZFP 基 因 的 表
达情况，以烟草的 Actin1 基因序列设计内参引物
NtActin-F 和 NtActin-R（表 1）。
1.2.3 转 基 因 烟 草 的 耐 盐 性 分 析 对 经 筛 选 确
定 为 纯 系 的 T3 代 种 子 进 行 消 毒， 将 种 子 平 铺 在
0.5×MS 培养基上，其成分含有 1% 的 Glucose，2.2
g/L Murashige & Skoog Medium（Duchefa Biochemie，
Netherland），0.05% 的 MES（Amersham，America），0.8
% Agar，pH5.8。4℃春化 3 d 后，移入 22℃（16 h 光照 /8
h 黑暗）培养箱中。培养 10 d 后，分别将生长状况
一致的幼苗转入含有 100 mmol/L 和 300 mmol/L NaCl
的 0.5×MS 培养基中，以不加 NaCl 的 0.5×MS 培养
基作为对照组，培养 5 d 后，观察表型并测量盐胁
迫后的根长。胁迫后采用 TCA-TBA 法［15］测定丙二
醛（MDA）质量摩尔浓度。称取烟草幼苗，加 0.05
g/mL 的 TCA 5 mL，研磨后所得匀浆于 3 000 r/min 离
心 10 min。取上清 2 mL，加 0.000 67 g/mL 硫代巴比
妥酸 2 mL，混合后于 100℃水浴煮沸 30 min，冷却
后再以 3 000 r/min 离心 10 min。分别测定上清液在
450、532 和 600 nm 的 吸 光 度 值 A450、A532 和 A600，
然后计算 MDA 浓度（μmol/L）及 MDA 质量摩尔浓
度（μmol/g）。MDA 浓度计算公式：MDA 浓度＝ 6.45×
（A532-A600）-0.56×A450。MDA 摩 尔 浓 度 =（MDA 浓
度 ×4×5/2）/ 样品质量。
1.2.4 转基因烟草离体叶片耐盐分析 分析方法参
照文献［16］的方法进行。取同样大小的普通烟草
和转基因烟草，在烟草的第 5 片叶子上打孔（直径
为 1 cm）， 分 别 放 入 0、100 和 200 mmol/L 的 NaCl
溶液中，叶片正面朝上，处理 3 d，观察表型。
2 结果
2.1 烟草的转化及抗性植株的鉴定
用叶盘法转化烟草经卡那霉素筛选获得了 12 株
再生苗。提取野生型和烟草再生苗基因组 DNA，经
PCR 反应（图 1），在 12 株转基因烟草植株中扩增
2015,31(10) 121王崎崎等：无苞芥锌指蛋白基因 OpZFP提高烟草耐盐性的研究
出与阳性对照一致的 684 bp 的特异性条带，而野生
型的对照植株未出现阳性条带。说明 OpZFP 基因已
转到烟草中。
长的影响 为研究转基因植株幼苗期耐盐性，分别
用不同浓度 NaCl 溶液处理野生型和转基因烟草株系
L9 和 L11。结果表明，随着盐胁迫处理浓度的增加，
野生型植株和转 OpZFP 植株的根长均减少，生长发
育延缓，说明盐胁迫对烟草的生长有抑制作用。在
未胁迫处理和 100 mmol/L NaCl 处理下，转基因植株
和野生型植株相差不大。但在 300 mmol/L NaCl 胁迫
处理后，转基因植株和野生型植株出现了明显的区
别 ：野生型的叶片变黄，而转基因两个株系在胁迫
处理条件下，叶片颜色受抑制程度较小（图 3-A）。
分析盐胁迫前后烟草的根长发现，在 300 mmol/L
NaCl 处理下，L11 的根长要明显长于野生型植株
（图 3-B），说明 OpZFP 可提高烟草的耐盐性。
2.3.2 转基因烟草的 MDA 含量测定 测定盐处理后
OpZFP 转基因烟草的 MDA 含量，发现随着胁迫浓
度的增大，MDA 的含量也增大。未胁迫处理下，野
生型和转基因烟草的 MDA 含量没有明显的差别，但
在 100 mmol/L 和 300 mmol/L NaCl 胁迫下，转基因
和野生型烟草中 MDA 的含量明显升高，但转基因烟
草 MDA 的含量要比野生型少，说明转基因烟草较野
生型来说细胞膜受到的伤害程度低（图 4）。进一步
说明 OpZFP 可提高烟草的耐盐性。
2.3.3 转基因烟草离体叶片的抗盐能力 将野生型
烟草和转 OpZFP 烟草离体叶片用不同浓度 NaCl 处
理 3 d，结果（图 5）显示，盐处理后转基因及野生
型烟草的离体叶片均表现出伤害症状，且症状随着
盐浓度的升高更加明显。在相同浓度盐胁迫下，转
基因烟草受伤害程度明显低于野生型。100 mmol/L
NaCl 处理下野生型叶片整体变黄发白，而转基因的
两个 line 中只有 L9 叶片变黄，L11 的叶片颜色与未
处理条件下叶片颜色相同。对处理后叶片的叶绿素
表 1 本研究所用的引物名称
引物名称 引物序列（5-3） 功能
Kpn Ⅰ -OpZFP-F GGGGTACCATGGATTCGTCCATCAAAGGAGATC 载体构建
BamH Ⅰ -OpZFP-R CGGGATCCTCATAGCTTAAGAGTCAAGTCAAT
OpZFP-RTF TCAGCAAGAACATTTGGCAG 基因表达
OpZFP-RTR ACGTTGACCTGTTATTCGCC
NtActin-F AAGGGATGCGAGGATGGA 内参基因
NtActin-R CAAGGAAATCACCGCTTTGG
注 ：下划线为 Kpn Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位点
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
M ：分子量 Marker DL2000 ；1 ：p35S ：OpZFP 质粒 ；2 ：野生型烟草对照 ；
3-14 ：转基因烟草 L1-L12 ；15 ：阴性对照
图 1 转基因烟草的鉴定
OpZFP
NtActin
WT L9 L11
图 2 半定量分析转基因烟草中 OpZFP 基因的表达量
2.3 OpZFP过量表达株系的耐盐性分析
为研究 OpZFP 过量表达株系的耐盐能力，选
取 OpZFP 高表达量株系 L9 和 L11 进行耐盐性分析。
将转化株自交收获 T2 代种子，并通过卡那霉素抗性
筛选得到稳定遗传的 T3 代纯合种子。
2.3.1 盐胁迫条件下 OpZFP 基因过量表达对烟草生
2.2 转基因烟草中OpZFP表达量的研究
为了检测转基因烟草中 OpZFP 基因 mRNA 的
转录水平，以野生型烟草为对照，NtActin 为内参基
因，用半定量 RT-PCR 方法检测了转基因烟草株系
L9 和 L11 中 OpZFP 基因的表达情况，结果（图 2）
表明 OpZFP 基因在两个转基因植株中都有很高的
表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10122
进行测定，发现 100 mmol/L 盐处理后两个转基因叶
片的叶绿素的含量要高于野生型含量（图 6）。200
mmol/L NaCl 处理下野生型烟草边缘泛白，且叶片中
间出现黄化现象，而转基因烟草叶片发黄。并且转
基因叶片的叶绿素含量要高于野生型烟草（图 6），
说明转基因烟草的抗盐性相对较强。
0 mmol/L
A
2.5
2.0
1.0
WTṩ䮯/cm
0
0 100 300
NaCl浓度/mmol·L-10.51.5
L9
L11
B
WT L9 L11
100 mmol/L
300 mmol/L
A ：不同浓度盐胁迫下 OpZFP 转基因植株（L9 和 L11）和野生型植株（WT）
的表型变化 ；B ：不同浓度盐胁迫下 OpZFP 转基因植株（L9 和 L11）和野
生型植株（WT）的根长变化。其中，* 表示 P<0.05，差异显著 ；** 表示
P<0.01，差异极显著，下同
图 3 OpZFP 转基因植株耐盐性表型（A）及根长（B）变
化分析
WT
L9
L11
20
16
8
M
D
A
ਜ਼䟿/μmol·g-1 
0
0 100 300
4
12
** **
**
**
NaCl浓度/mmol·L-1
图 4 野生型和 OpZFP 转基因植株盐胁迫后 MDA 的含量
的测定
0 mmol/L
WT
L9
L11
100 mmol/L 300 mmol/L
图 5 离体烟草叶片不同盐浓度处理后比较
WT
L9
L11
3.5
2.8 ** **
1.4
C
hl
or
op
hy
II
/mg·g-1 
0
0 100 300
0.7
2.1
NaCl浓度mmol·L-1
图 6 烟草离体叶片在不同盐浓度处理下叶绿素的测定
3 讨论
C2H2 型锌指蛋白广泛存在于高等植物中，在
植物生长发育和胁迫应答等生命活动过程中具有重
要作用。因此更多的 C2H2 型锌脂蛋白的克隆及其
生物学功能研究有助于进一步阐明植物生长发育、
胁迫应答等生命过程的分子机制［5］。前期研究表明
2015,31(10) 123王崎崎等：无苞芥锌指蛋白基因 OpZFP提高烟草耐盐性的研究
无苞芥锌指蛋白 OpZFP 是一个 C2H2 型转录因子，
具有典型的“QALGGH”保守序列和一个 EAR 结构
域。在结构上，无苞芥锌指蛋白 OpZFP 同拟南芥
AtZFP1 的相似性最高［12］。本研究发现，在烟草中
过量表达 OpZFP 基因可提高烟草的耐盐能力，并且
转基因植株在盐胁迫处理后 MDA 含量显著低于野
生型烟草，叶绿素的含量要高于野生型烟草，这同
与角果碱蓬耐盐基因盐液泡质子焦磷酸酶 ScVP 基
因［17］、无苞芥耐盐基因液泡质子焦磷酸酶 OpVP 基
因［18］类似。表明 OpZFP 基因可降低烟草对盐胁迫
的敏感性，增加烟草的耐盐性，暗示着 OpZFP 基因
在植物的耐盐响应过程中具有重要作用。我们发现
将烟草幼苗盐胁迫处理后，虽然从烟草的生理指标
中可以看出转基因比野生型耐盐，但转基因烟草同
野生型烟草植株大小、株型没有明显差别。只有在
高盐胁迫下（300 mmol/L NaCl）转基因烟草在形态
上才与野生型稍有不同，转化体叶片颜色浅绿而野
生型叶片则较黄，且只有一个转化体（L11）的根长
要显著长于野生型。以上结果表明 OpZFP 基因可能
只通过生理调节提高烟草耐盐能力，对烟草的形态
建成具有较小的影响。
前期研究发现 C2H2 型锌指蛋白不但参与到植
物的耐逆过程，在植物的生理发育过程也具有重要
的作用。如大豆 GmZFP1 参与到大豆种子的后期发
育过程中［19］；拟南芥 TTL 基因是胚乳发育中不可或
缺的一个基因［20］；拟南芥另一个 C2H2 型锌指蛋白
SUPERMAN 基因在雄蕊发育、花发育及果实发育过
程中具有重要作用［21］；与 OpZFP 结构最相似的锌
指蛋白 AtZFP1 则参与到枝条的发育过程中［22］。表
明无苞芥 OpZFP 基因可能还参与到其他生理发育过
程。OpZFP 基因是否具有调节生理发育功能如促进
植物开花，促进种子发育等仍需进一步研究。
4 结论
叶盘法转化获得转 OpZFP 基因烟草，半定量
qRT-PCR 表明，OpZFP 基因可在烟草中高表达。用
不同盐浓度处理烟草幼苗，转基因烟草根长长于野
生型幼苗，且 MDA 含量低于野生型。高盐处理烟
草离体叶片使非转基因烟草叶绿素降解严重，表明
OpZFP 具有耐盐性。
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（责任编辑 马鑫）