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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是嗜热好氧、
内生芽孢的 G+ 细菌，其生长速度快、营养要求简单、
对人畜无害、环境兼容性好、可以抑制多种植物病害，
是目前具有广阔应用前景的理想生防菌［1-4］，国内
外均已将一些枯草芽孢杆菌菌株成功应用于防治植
物病害的生产中［5］。
枯草芽孢杆菌产生抗菌物质的途径分为核糖
体和非核糖体合成两种。核糖体合成途径可以产生
细菌素、酶类和活性蛋白类抗菌素 ；非核糖体合成
途径可以产生脂肽类、多肽类和磷脂类、多烯类等
其他类别物质。国内外均有一些成功的生防产品
得到开发和广泛应用，如枯草芽孢杆菌生防菌株
QST713、GBO3、MBI600 和 B. subtilis var. amylol-
iquefaciens菌株 FZB24 已经得到了美国环保署（EPA）
商品化或有限商品化生产应用许可［6］。
本研究组以往的研究表明，枯草芽孢杆菌 B-332
收稿日期 : 2011-12-30
基金项目 : 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2009ZX07103-002，2008ZX07425-002）,“十一五”国家科技支撑计划项目（2009BADC-
2B00-02）
作者简介 : 刘雪 , 女 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向 : 环境微生物学 ; E-mail: liuxue@caas.net.cn
通讯作者 : 朱昌雄 , 男 , 研究员 , 研究方向 : 环境科学 ; E-mail: zhucx120@163.com
枯草芽孢杆菌 B-332产抗稻瘟病菌的活性物质分析
刘雪1 田云龙1 闫丽2 郭萍1 朱昌雄1
（1 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081 ；2 首都博物馆，北京 100045）
摘 要： 枯草芽孢杆菌 B-332能够产生具有稻瘟病菌拮抗活性的物质。通过等电点法提取该抗菌液粗提物，并利用高效液
相色谱 -质联用仪对粗提物进行分离纯化，共得到 5个组分，它们的质荷比（m/z）分别为 1 045.0、1 057.8、1 072.3、1 017.5和
1 031.1，是 Bacillomycin D（C14-C17）的同系物（质荷比（m/z）为 1 017.5的除外），它们结构间相差 1个或几个 -CH2-基团；各
组分均对稻瘟病菌有抑制作用，其中质荷比（m/z）为 1 045.0、1 057.8、1 072.3组分的抑菌效果最强。致畸作用试验表明，这 3
种组分的致畸作用均为使稻瘟病菌的附着孢膨大破裂，与 B-332菌株的致畸作用相同，证实了这 3种组分是 B-332菌株产生具有
抑制稻瘟病菌作用的主要活性成分。
关键词： 枯草芽孢杆菌 稻瘟病菌 分离纯化 抑菌活性 组分
Separation and Purification of the Substances with
Anti-Magnaporthe grisea Activity from Bacillus subtilis B-332
Liu Xue1 Tian Yunlong1 Yan Li2 Guo Ping1 Zhu Changxiong1
（1Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，CAAS，Beijing 100081；2Capital Museum，Beijing 100045）
Abstract: Bacillus subtilis B-332 could produce substances which showed antifungal activity against Magnaporthe grisea. The crude
extracts of B-332 were separated by isoelectric point method, and the crude extracts were primary separated and purified using high performance
liquid chromatography-mass spectrometer. The results showed that five components were achieved according to the order of the peak time, and
their charge-mass ratio （m/z） were 1 045.0, 1 057.8, 1 072.3, 1 017.5 and 1 031.1, respectively. The structures of 4 components except for the
charge-mass ratio （m/z） 1 017.5 were determined as Bacillomycin D （C14-C17）. The components with charge-mass ratio （m/z） 1 045.0,
1 057.8, 1 072.3 showed strongest inhibitory effect. Teratogenicity experiments showed that this three components has the same teratogenic effects
with B-332 strain, which suggested that components with charge-mass ratio （m/z） 1 045.0, 1 057.8, 1 072.3 were the main active ingredient.
Key words: Bacillus subtilis Magnaporthe grisea Separation and purification Antifungal activity Component
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期190
菌株对稻瘟病菌普遍抑制作用［7］，芽孢菌体悬浮
液及发酵上清液对稻瘟病均表现出较好的防治效果
（50% 以上），且其菌液与上清液混合后其防治效果
有加和作用［8］。因此，本研究以枯草芽孢杆菌 B-332
产生代谢物质为切入点，通过分离纯化粗提物中的
组分，确定其抑菌作用的主要成分及抑菌效果，旨
在揭示该菌株对稻瘟病菌防治的机理，为完善该菌
株的研究体系提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌 B-332 菌株（Bacillus
subtilis），由中国农业科学院农业环境与可持续发展
研究所环境修复实验室保存；稻瘟病菌（Magnaporthe
grisea）为 91-17-2 生理小种，由中国农业科学院作
物科学研究所稻瘟病害实验室提供。
1.1.2 发酵培养基及发酵条件 发酵培养基 ：豆饼
粉 6.0%、蔗糖 2.5%、硫酸铵 0.7%、柠檬酸三钠 0.3%；
培养条件 ：种龄为 18 h、接种量为 10%，装液量 80
mL/500 mL、温度 30℃、转速 180 r/min。发酵周期
终点为 72 h。
1.2 方法
1.2.1 抗菌物质粗提液的制备 将 B-332 菌株发酵
液于 10 000 r/min 4℃离心 10 min，去菌体，得上清。
测定上清液初始 pH，用 HCl（10 mol/L）缓慢将上
清 pH 值调至 4.0，静置 1 h，再于 10 000 r/min 4℃
离心 10 min，得到抗菌粗提物。用 NaOH（1 mol/L）
将抗菌粗提物溶解，调至初始 pH 值，即得到抗菌
粗提物溶液。
1.2.2 抗菌活性测定方法 采用双向培养测定法［8］，
将稻瘟病菌 91-17-2 在铺有 PDA 培养基的平板上培
养 4 d，培养温度为 27℃，菌落边缘打成半径为 4.6
mm 的菌饼，备用。将 15 mL PDA 培养基倒入直径
为 9 cm 的培养皿中，冷却后，将菌饼接种于中央，
在距离中央 20 mm 处打孔（半径 =4.6 mm），并将 5、
10、20、40 和 80 mg/mL 的抗菌粗提物 2 mL 注入孔中，
每个浓度重复 5 皿，培养第 3 天测定抑菌带宽的平
均值。
抑菌带宽（mm）= 自然生长的稻瘟病菌饼半径
（mm）- 被抑制的稻瘟病菌菌饼半径（mm）
1.2.3 抗菌物质的分离和纯化
1.2.3.1 上样 A. 将抗菌粗提物用 NaOH 溶液（1
mol/L）稀释为 10 mg/mL，将其置于 1.5 mL EP 管中；
B. 打开气阀，进样量约 3 μL ；自动进样。
1.2.3.2 色 谱 条 件 流 动 相 A ：水（0.5% 冰 乙
酸），流动相 B ：乙腈（0.5% 冰乙酸）；检测波长 ：
210-500 nm ；流速 0.3 mL/min。
1.2.3.3 质谱条件 锥电压条件 ：35 ev，扫描分子
量范围 ：100-1 400 Da，扫描时间 ：0-40 min，0.7
ms，扫描间隔时间 ：0.1 ms。
1.2.4 分离组分对稻瘟病菌的平板拮抗作用 收集
半制备色谱中分离的各组分。测定抑菌带的方法同
1.2.2，同一平板的孔中注入相同组分，用纯化水做
对照，分别于培养至第 3、4 天测定抑菌带宽。在光
学显微镜下观察各组分对稻瘟病菌（4 d）萌发附着
胞的致畸作用，并与前期研究得到的 B-332 对萌发
附着胞致畸作用比较，观察其相似性。
2 结果
2.1 B-332菌株抗菌物质的分离纯化
高效液相色谱是一种高效、快速的分离技术，
具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方
便等优点。通过对粗体物进行的高效液相色谱分离，
结果（图 1）显示，应用这个条件分离出 5 个组分
物质，分别在分离的第 16.40、17.12、18.20、25.98、
27.44 min 时得到。
应用质谱方法获得这 5 个组分的分子量信息，
分别为 1 017.5、1 031.1、1 045.0、1 057.8、1 072.3，
标记为 E、D、C、A、B，它们之间分子量的差值为
14 Da，恰好是相差一个和几个 -CH2- 基团的同种化
合物的变异体，图 2 是这 5 种组分的质谱图。
2.2 分离各组分对稻瘟病菌的拮抗效果
测定拮抗活性时（图 3），平板上标记的是半
制备色谱的出峰时间，由于半制备色谱的出峰时间
比分析色谱早 2 min，所以半制备色谱的出峰时间
14.50、15.25、16.38、23 和 25 min 分别与分离时间
16.40、17.12、18.20、25.98 和 27.44 min 相对应。
图 3 显示了各组分对稻瘟病菌的拮抗效果。与
对照 CK 比较抑菌带宽，5 个组分均能够抑制稻瘟病
菌的生长，C、A 两种组分对稻瘟病菌的抑制效果最
2012年第8期 191刘雪等 ：枯草芽孢杆菌 B-332 产抗稻瘟病菌的活性物质分析
显著 ；培养至第 3 天，对照 CK 菌体半径的宽度为
14.0 mm，对照 C、A 的抑菌带宽比 B、E、D 的抑菌
带宽大 40% 以上。由表 1 可见，第 4 天与第 3 天相
比，5 个组分的抑菌带宽增长量都小于 0.1 mm，并
以 C 和 A 组分的抑制效果最强，在第 5 天达到最大
抑菌效果。
图 1 有效抗菌物质的分析色谱图
图 2 五种组分的质谱图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期192
2.3 分离各组分对附着胞的致畸作用
对稻瘟病菌抑制结果（图 4）表明，效果最强
烈的 C、A、B 组分可以使稻瘟病菌的附着胞产生球
畸形，畸形逐渐膨大、细胞质溢出、菌丝体崩溃，
与图 5 中 B-332 菌株对稻瘟病菌附着胞的致畸作用
结果相同，即 C、A、B 组分是枯草芽孢杆菌 B-332
菌株产生抗稻瘟病菌作用的主要组分。
3 讨论
枯草芽孢杆菌非核糖体合成途径产生的抗菌物
质有 Itunin、Surfactin 和 Fengycin［9］，其中，Iturin 和
Fengycin 是两种脂肽类抗真菌素［10， 11］，Bacillomycin
D（杆菌霉素 D）属于 Iturin 家族中的一种，分子式
是 C37H51N10O15R［12］，是一类小分子环脂肽类物质，
有 7 个氨基酸和 1 个 β-氨基脂肪酸［13］。由于 Baci-
llomycin D（C14-C17）均具有抗真菌的作用，而且
分子量之间恰好相差一个或几个-CH2-基团，分别与
E、D、C、A、B 这 5 种组分的分子量及结构差异相同。
因此，推测 A 为 Bacillomycin D（50%-iso-C16）或
Bacillomycin D（50%-n-C16），B 为 Bacillomycin D
（ante-iso-C17），C 为 Bacillomycin D（iso-C15），D 为
Bacillomycin D （n-C14），分析 E 也是一种脂肽类化
合物，但是在目前报道中并未检索到相似分子量的
脂肽类物质，可能是一种新物质，有待进一步验证
分析。
对脂肽类抗真菌素的研究一直是生防的热点，
Lee 等［14］筛选得到一株枯草芽孢杆菌，分离纯化发
现该菌株能产生 Bacillomycin F（C14-C16）同系物，
对真菌具有很强的抑制作用。枯草芽孢杆菌 AU195
能够产生 Bacillomycin D，对黄曲霉霉 Aspergillus
flavus具有抑制作用［15］。大多数单株枯草芽孢杆菌
表 1 分离各组分对稻瘟病菌的抑制效果
样品 分子量（Da） 分离时间（min） 半制备时间（min） 抑菌带宽（mm） 抑菌带宽差值（mm） 3 d 4 d
C 1 045.0 16.40 14.50 0.297 0.317 0.020
A 1 057.8 17.12 15.25 0.159 0.237 0.078
B 1 072.3 18.20 16.38 0.094 0.135 0.041
E 1 017.5 25.98 23.00 0.096 0.159 0.063
D 1 031.1 27.44 25.00 0.038 0.120 0.082
图 3 各组分对稻瘟病菌的拮抗效果图（培养第 3 天）
图 4 C、A、B组分对附着胞的致畸作用图
2012年第8期 193刘雪等 ：枯草芽孢杆菌 B-332 产抗稻瘟病菌的活性物质分析
只产生一类脂肽类抗菌素［1， 16］，最近发现一个菌
株也能够产生多种脂肽类化合物，如枯草芽孢杆菌
UMAF6614 发酵液中可以提取到 Iturin、Surfactin、
Fengycin 3 种脂肽类物质，它们协同作用能够提高抗
菌效果［17］，产生更大的生物防治价值。
本研究下一步将对 5 种有效组分采用二级质谱
等方法解析其结构，并针对不同稻瘟病菌生理小种
进行抑菌效果试验，还将探讨分离提纯物质与原菌
体的联合施用增强生防效果的方法，对研发防治稻
瘟病菌剂有十分重要的科学意义。
4 结论
本研究采用液相色谱和质谱联用的方法，分离
得到枯草芽孢杆菌 B-332 产生抗稻瘟病菌作用的 5
种组分及分子量，并验证其中 3 种组分与枯草芽孢
杆菌 B-332 对稻瘟病菌附着胞的致畸作用相同，是
该菌株产生抗稻瘟病菌作用的主要组分。
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（责任编辑 马鑫）
图 5 B-332菌株对附着胞的致畸作用图
A. 正常附着胞 ；B. 畸形附着胞