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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):184-190
近年来，随着制药、化工、发酵等工业的迅速
发展，产生了大量含氮含硫废水。氮是导致水体富
营养化的主要原因，而硫化物会损害人体健康，同
时可对金属产生氢脆破坏、也能加速建筑材料和艺
术品等非金属材料的老化［1-3］，须将其去除。一般
来说，生物脱氮除硫需要反硝化细菌和硫细菌两种
微生物来去除，但近年来研究证明，一些微生物能
够以硝酸盐为电子受体将硫化物氧化成单质硫，相
较于传统生物法分别进行脱氮、除硫，同步脱氮除
硫具有节省耗氧量、缩短反应时间、减少占地面积
收稿日期 ：2014-12-08
基金项目 ：江苏省高校自然科学基金项目（13KJB610014），江苏省环境科学与工程重点实验室开放基金项目（Zd131201）， 江苏高校优势学
科建设工程资助项目
作者简介 ：黄俊，男，硕士研究生，研究方向 ：水污染控制与理论 ；E-mail ：hjusts@hotmail.com
通讯作者 ：宋吟吟 , 女，副教授，研究方向 ：环境生物技术领域 ；E-mail ：yinling-song@hotmail.com
同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究
黄俊1  张诗颖1  王翻翻1  李月寒1  吴鹏1  宋吟玲1，2
（1. 苏州科技学院环境科学与工程学院，苏州 215009 ；2. 江苏省环境科学与工程重点实验室，苏州 215009）
摘 要 ： 为促进反硝化脱硫工艺的工程化应用，从稳定运行的反硝化脱硫 UASB 中筛选出 2 株高活性自养反硝化菌 H3
和 H7，并对其进行了鉴定和生长及反硝化特性的研究。结果表明，2 株菌均为革兰氏阴性菌，16S rDNA 序列分析表明，分别与
Pseudomonas stutzeri CONC12 和 Pseudomonas stutzeri 19smn4 相似性为 99.6% 和 98.9%。结合生理生化特性和 16S rDNA 序列分析，
确定两菌株都为 Pseudomonas stutzeri。对两菌株的生长和反硝化特性研究表明，菌株 H3 和 H7 的生长最适起始 pH 为 6.94 和 6.88，
最适反硝化 pH 分别为 6.77 和 6.56。H3 和 H7 的最适生长温度为 30.4℃和 30.6℃，最适反硝化温度分别为 31.4℃和 31.2℃，两株
菌种都为非耐盐菌株。
关键词 ： 脱氮除硫菌 ；16S rDNA ；反硝化特性 ；非耐盐菌株
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.029
Screening，Identification and Characterization of Strains Coupling
Nitrogen Removal with Sulfide Removal
Huang Jun1 Zhang Shiying1 Wang Fanfan1 Li Yuehan1 Wu Peng1 Song Yinling1，2
（1. School of Environmental Science and Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou 215009 ；2. Jiangsu Provincial
Key Lab of Environmental Science and Engineering，Suzhou 215009）
Abstract:  In order to promote the engineering application of denitrification and desulfurization process, 2 highly-active autotrophic
denitrifying bacterial strains H3 and H7 were screened from stable UASB with denitrification and desulfurization, and the strains were identified
and characterized. Two strains were both gram negative bacteria, the 16S rDNA sequence analysis revealed that strain H3 and H7 had a similarity
of 99.6%, 98.9% with Pseudomonas stutzeri CONC12 and P. stutzeri 19smn4 respectively. Combing the morphologic, physiobiochemical
characteristics and the analysis of its 16S rDNA, 2 strains were identified as P. stutzeri. The results of growth and denitrification of 2 strains
demonstrated that the optimal initial pH for H3 and H7 growth were 6.94 and 6.88 respectively, for denitrification were 6.77 and 6.56
respectively. The optimal temperatures for growth were 30.4℃ and 30.6℃, for denitrification were 31.4℃ and 31.2℃ respectively, both of H3
and H7 were non-resistant strains to salt.
Key words:  desulfurization denitrifying bacteria ；16S rDNA ；denitrification characteristic ；non-resistant strain to salt
2015,31(10) 185黄俊等：同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究
以及可以产生单质硫利于回收等优点，对于此类能
够同时利用硝酸盐和硫化物的微生物，将其称为反
硝化脱硫细菌（NR-SOB）［4］。
目前，对同步脱氮除硫菌的研究主要集中在脱
氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）。Subletee 等［5］
使用脱氮硫杆菌对 CSTR 反应器进行接种发现，其
对 H2S 具有较高的去除率，Koenig 等
［6］利用富集得
到的脱氮硫杆菌对以硫磺颗粒为填料的 UASB 进行
接种，结果表明硝酸盐的去除率几乎可达 100%，刘
玲花等［7］以脱氮硫杆菌为工程菌，硫与石灰石为填
料的滤柱去除地下水中的 NO3
-，结果发现去除率可
以达到 98%。车轩［8］、刘宏芳［9］和范立民［10］等对
脱氮硫杆菌的特性研究得到菌株脱氮效果最佳的初
始 pH 为 6.85，温度为 32.8℃，生长最快的初始 pH
为 6.90，温度为 29.5℃。但对于其他同步脱氮除硫
菌的研究还较少，因此本研究拟从实验室稳定运行
的反硝化脱硫 UASB 反应器中富集高效同步脱氮除
硫菌，旨在提高反硝化脱硫过程的效率，优化反硝
化脱硫工艺性能，还可为此工艺提供生产菌种，促
进该工艺的工程化应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 污 泥 来 源 用 于 分 离 菌 株 的 污 泥 来 自 于
实验室稳定运行的 UASB 同步反硝化脱硫反应器
中，污泥的湿密度为 1.038 g/mL，MLSS=12.03 g/L，
MLVSS=7.67 g/L。稳定运行时进水硫化物（以 S 计）、
硝酸盐（以 N 计）和乙酸盐（以 C 计）的质量浓度
分别为 300、132 和 113 mg/L，当水利停留时间为
12 h，进水 pH 在 7.5 左右时，去除率分别为 91.4%、
89.4% 和 87.3%，单质硫产率为 83.1%。
1.1.2 培 养 基 的 制 备 由 于 硫 化 物 易 氧 化 且 不
容 易 控 制 培 养 基 的 pH， 故 培 养 基 中 以 硫 代 硫 酸
盐 代 替 硫 化 物， 富 集 培 养 基 成 分［10］ 如 下 ：0.5%
Na2S2O3·5H2O，0.4% KNO3，0.05% NH4Cl，0.05%
MgCl 2·6H 2O，0.2% KH2PO 4，0.1% NaHCO3，
0.001%FeSO4·7H2O， 用 0.01 mol/L 的 NaOH 调 节
pH 至 7 左右，121℃灭菌 20 min，Na2S2O3·5H2O 滤
膜过滤除菌后待培养基灭菌冷却后另外加入。分离
培养基和穿刺培养基在富集培养基中分别加入 2%
和 0.5% 的琼脂。
脱 氮 除 硫 试 验 培 养 基 为 ：Na2S·9H2O 0.9 g，
KNO3 0.1 g，NaHCO3 1 g，MgCl2·6H2O 0.5 g，KH2PO4 2.0
g，蒸馏水 1 000 mL，pH 调节为 7 左右，硫化钠在
滤膜过滤除菌后待培养基灭菌冷却后加入。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集培养和纯化分离 取 1 g 反应器
内污泥加入到含有 99 mL 无菌水的培养瓶中，并加
入几粒玻璃珠，制成稀释浓度为 10-2 的污泥悬浮液，
然后从浓度为 10-2 的悬浮液中取 1 mL 到含有 9 mL
无菌水的培养瓶中即成 10-3 污泥稀释液，依次重复
稀释到 10-8，将 10-2 到 10-8 污泥稀释悬浮液分别取
1 mL 接入含有 50 mL 富集培养基的培养瓶中，封口
置于 30℃生化培养箱中静置培养 3-7 d。将产气多、
浑浊度大的富集培养物进行平板划线分离，挑出单
菌落进行纯化。
1.2.2 菌株的脱氮除硫实验 将纯化分离出的菌株
进行脱氮除硫试验，即将初筛菌株接种至含有 100
mL 脱氮除硫培养基的灭菌锥形瓶中，做 2 个重复，
同时以未接种的培养基作为空白对照，30℃下培养
2 d。测定培养前后培养液中的 NO3
--N 及 S2--S 含量，
对两个平行实验的结果取平均值，以空白对照的结
果进行校正，然后计算各菌株的 NO3
--N 及 S2- 的去
除率。
1.2.3 菌株的生理生化实验和 16S rDNA 鉴定 菌
株的生理生化实验参照文献［11］进行鉴定，采
用 Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取准
备 鉴 定 菌 株 的 基 因 组 DNA， 以 细 菌 的 通 用 引 物
27F（5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3） 和 1492R
（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3） 进 行 PCR 扩 增，
PCR 扩增反应体系为 DNA 模板（基因组 DNA 20-
50 ng/μL）0.5 μL ；10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL ；
dNTP 混 合 物（ 各 2.5 mmol/L）1 μL ；DNA 聚 合 酶
0.2 μL ；正反引物（10 μmol/L）各 0.5 μL ；加双蒸
水至 25 μL。PCR 扩增条件为 ：94℃ 4 min ；94℃ 45
s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min，
修复延伸 ；最后 4℃终止反应。纯化得到的 PCR 产
物测序委托上海生物工程技术有限公司进行，将
测得的 16S rDNA 序列后将结果输入核糖体数据库
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10186
（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp）进行 BLAST 比对，
利用 DNASTAR 软件中 MegAlign 建立系统发育树。
1.2.4 温度和 pH 值对分离菌株生长和反硝化代谢
的影响 将保存备用的菌株 H3 和 H7 分别进行两次
活化、划线分离至平板表面为均一的菌落，分别用
无菌生理盐水洗下菌苔，在 250 mL 三角瓶中装入
100 mL 培养液和 5% 菌悬液（V/V）NO3
--N 和 S2--S
设定为 40 mg/L 和 100 mg/L，初始 pH 值依次调控至
为 3、4、5、6、7、8 和 9，在 30℃摇床内以 120 r/min
振荡培养，通过培养液的 OD 值（λ=600 nm）的测
定和 NO3
--N 去除率的变化来判断菌体的生长和代谢
情况。
同 样， 在 250 mL 三 角 瓶 中 装 入 100 mL 培 养
液 和 5% 菌 悬 液（V/V），NO3
--N 和 S2--S 设 定 为 40
mg/L 和 100 mg/L，初始 pH 值依次调控 7 左右，温
度 依 次 设 定 为 10、15、20、25、30、35 和 40℃ 摇
床内以 120 r/min 振荡培养，通过测定培养液的 OD
值（λ=600 nm）和 NO3
--N 去除率的变化来判断菌体
的生长和代谢情况。
1.2.5 菌株的耐盐度实验 用无菌去离子水配置盐
度分别为 0%、0.5%、1%、2%、4% 和 8% 的培养基，
30℃培养 24 h 后测定 OD600 值。
1.2.6 分析项目与测定方法 所有水样经离心后取
上清液进行测定，pH 采用雷磁 PHSJ-4A 型 pH 计测
量，NO3
--N 采用紫外分光光度法，NO2
--N 采用 N-（1-
萘基）- 乙二胺光度法，S2--S 采用亚甲蓝法分光光
度法。
2 结果
2.1 脱氮除硫实验结果
从反应器内共定向分离出 7 株产气较多的脱氮
除 硫 菌（ 编 号 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7），
分别进行脱氮除硫试验，30℃培养 2 d 后对 NO3
--N
和 S2--S 去除率进行测定和计算。结果（表 1）表
明，相较于空白灭菌对照的脱氮除硫率，7 株菌株
都具有一定的脱氮除硫率，其中以 H3 和 H7 最为
显著，脱氮除硫率分别达到 71%、47.8% 和 65.2%、
44.8%。因此将 H3 和 H7 作为实验菌株进行进一步
的鉴定。
表 1　初筛株的脱氮除硫试验结果 /（mg·L-1）
菌株号
起始
NO3
--N
2d 后
NO3
--N
校正前
脱氮量
校正后
脱氮量
校正后
脱氮率 /%
起始
S2--S
2 d 后
S2--S
校正前
除硫量
校正后
除硫量
校正后
除硫率 /%
H1 13.8 4.8 9 8.4 60.9 123.2 63.4 59.8 50 40.6
H2 13.8 6.9 6.9 6.3 45.7 123.2 76.8 46.4 36.6 29.7
H3 13.8 3.4 10.4 9.8 71.0 123.2 54.5 68.7 58.9 47.8
H4 13.8 5.8 8 7.4 53.6 123.2 68.2 55 45.2 36.7
H5 13.8 6.2 7.6 7 50.7 123.2 79.2 44 34.2 27.8
H6 13.8 5.8 8 7.4 53.6 123.2 65.6 57.6 47.8 38.8
H7 13.8 4.2 9.6 9 65.2 123.2 58.2 65 55.2 44.8
空白 13.8 13.2 0.6 0 0.0 123.2 113.4 9.8 0 0.0
2.2 筛选菌的生理生化试验与16S rDNA序列测定
H3 和 H7 都为革兰氏染色阴性，在固体琼脂培
养基上生长时菌落呈淡黄色，粘液状。H3 和 H7 的
生理生化实验结果相似，接触酶和氧化酶测定阳性，
不能使明胶液化，可水解淀粉，葡萄糖产酸实验阳性。
图 1 为 H3 和 H7 的 16S rDNA 全 长 PCR 扩 增
结果，用等量的水代替模板作阴性对照无条带出
现，证明 PCR 扩增结果可信，菌株 H3 和菌株 H7
的 16S rDNA 序列长度分别为 1 444 bp 和 1 430 bp，
16S rDNA 序列测定结果表明菌株 H3 与 Pseudomonas
stutzeri CONC12 菌 株 的 序 列 同 源 性 为 99.6%， 与
Pseudomonas sp. Da2 菌株的序列同源性为 98.8%，菌
株 H7 与 Pseudomonas stutzeri CONC12，Pseudomonas
stutzeri ST27MN3 和 Pseudomonas stutzeri 19smn4 的序
列同源性都为 98.9%。
菌株 H3 和 H7 在系统分类中的位置如图 2 和图
3 所示，结合菌株的菌落特征、生理生化特点以及
16S rDNA 基因序列，确定 H3 和 H7 都为施氏假单
2015,31(10) 187黄俊等：同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究
胞菌（Pseudomonas stutzeri）。
2.3 菌株的最适生长pH值和最适反硝化pH值
如图 4 和图 5 所示，起始 pH 由 3.0 增加至 9.0，
H3 和 H7 的生长量都呈现先升后降的趋势，对图进
行非线性拟合，可知 H3 的生长最适起始 pH 为 6.94，
最适反硝化 pH 为 6.77。而 H7 的生长最适起始 pH
为 6.88，最适反硝化 pH 为 6.56。
如图 6 和图 7 所示，温度对菌株 H3 和 H7 的生
长和反硝化活性都有明显的影响，但温度对生长的
影响规律并不同于其对反硝化代谢活性的影响。当
温度从 10℃上升到 30℃时，菌体的生长速率和反硝
化代谢活性是逐渐增大的 ；但当温度继续升高后，
菌体生长速率逐渐降低，而反硝化代谢活性会继续
增加然后降低。可见，菌体 H3 和 H7 的最适反硝化
温度都高于最适生长温度。对图 5 结果进行非线性
拟合，可得菌株 H3 的最适生长温度为 30.4℃，最
适反硝化温度为 31.4℃，而菌株 H7 的最适生长温
度为 30.6℃，最适反硝化温度为 31.2℃。
H3 H7 M
1000
bp
M ：DNA Marker ；H3，H7 ：分别为以菌 H3 和 H7 的基因组 DNA 为模板的
PCR 产物
图 1 H3 和 H7 的 16S rDNA 全长扩增结果
AY509898_Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
DQ682655_Pseudomonas chlororaphis
EU391388_Pseudomonas brassicacearum
GU936597_Pseudomonas deceptionensis
AY787208_Pseudomonas panacis
AF068259_Pseudomonas jessenii
JF749828_Pseudomonas kuykendallii
GQ407271_Pseudomonas stutzeri
EU275358_Pseudomonas stutzeri
FJ422810_Pseudomonas seleniipraecipitans
AY770691_Pseudomonas segetis
EU791281_Pseudomonas cuatrocienegasensis
JX274436_Pseudomonas guangdongensis
HM246142_Pseudomonas linyingensis
JQ277453_Pseudomonas sagittaria
DQ339153_Pseudomonas delhiensis
EU286805_Pseudomonas xinjiangensis
EU143352_Pseudomonas sabulinigri
EU888911_Pseudomonas pelagia
GQ161991_Pseudomonas bauzanensis
JF432053_Pseudomonas formosensis
0.01
95
70
82
99
97
72
100
41
37
22
66 H7
H399
10
87
86
77
77
74
99
图 2 菌株 H3 和 H7 与参考菌株基于 16S rDNA 序列构建的最大似然法系统发育树
2.4 NaCl浓度对生长的影响
由图 8 显示，NaCl 浓度低于 1% 时，对菌株 H3
和 H7 生长的影响不大，但当 NaCl 浓度在 1% 以上时，
菌株 H3 和 H7 的生长受到较严重的影响。结果表明，
菌株 H3 和 H7 都为非耐盐菌株。
3 讨论
同步脱氮除硫是存在于某些菌体内的一种特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10188
99
76
89
79
97
89
51
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71
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99
100
97
83
63
87
AY509898_Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
DQ682655_Pseudomonas chlororaphis
EU391388_Pseudomonas brassicacearum
GU936597_Pseudomonas deceptionensis
AY787208_Pseudomonas panacis
AF068259_Pseudomonas jessenii
JF749828_Pseudomonas kuykendallii
GQ407271_Pseudomonas stutzeri
EU275358_Pseudomonas stutzeri
FJ422810_Pseudomonas seleniipraecipitans
AY770691_Pseudomonas segetis
EU791281_Pseudomonas cuatrocienegasensis
JX274436_Pseudomonas guangdongensis
HM246142_Pseudomonas linyingensis
JQ277453_Pseudomonas sagittaria
DQ339153_Pseudomonas delhiensis
EU286805_Pseudomonas xinjiangensis
EU143352_Pseudomonas sabulinigri
EU888911_Pseudomonas pelagia
GQ161991_Pseudomonas bauzanensis
JF432053_Pseudomonas formosensis
H7
H3
图 3 菌株 H3 和 H7 与参考菌株基于 16S rDNA 序列构建的最大简约法系统发育树
3 5 7
pH
9
0
20
40
60
80
100
0
0.1
0.2
O
D
60
0 㝡≞⦷%0.30.40.50.60.7 OD㝡≞⦷
图 4 pH 对菌株 H3 生长速率和反硝化速率的影响
3 5 7
pH
9
0
20
40
60
80
100
0
0.1
0.2
O
D
60
0 㝡≞⦷%0.30.40.50.60.7 OD㝡≞⦷
图 5 pH 对菌株 H7 生长速率和反硝化速率的影响
10 20 30 40⑙ᓖć 02040
60
80
70
50
30
10
0
0.2
O
D
60
0 㝡≞⦷%0.40.60.81.0 OD㝡≞⦷
图 6 温度对菌株 H3 生长速率和反硝化速率的影响
10 20 30 40⑙ᓖć 02040
60
80
70
50
30
10
0
0.2
O
D
60
0 㝡≞⦷%0.40.60.81.0 OD㝡≞⦷
图 7 温度对菌株 H7 生长速率和反硝化速率的影响
2015,31(10) 189黄俊等：同步脱氮除硫菌的筛选鉴定及其生长特性研究
殊的代谢途径，其原理是以低价硫化合物为电子供
体，以硝酸盐氮为电子受体进行电子传递从而获得
生长所需的能量。本实验从稳定运行的 UASB 工艺
反硝化脱硫反应器中筛选出 2 株同步脱氮除硫菌，
脱 氮 除 硫 率 分 别 可 以 达 到 71%、47.8% 和 65.2%、
44.8%。16S rDNA 序列测定结果显示 H3 与 H7 都与
施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的同源性较高。
目前有一些对施氏假单胞的相关报道，如周国勤
等［12］为了有效控制养殖水体中的氮素污染，研究
了假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的生长特性和反
硝化活性，最适生长 pH 为 7.0-8.0，最适生长温度
为 30-35℃。孔瑛等［13］以二苯并噬吩（DBT）为模
型化合物，筛选到一株石油生物脱硫菌 Pseudomonas
stutzeri，该菌能够在较短时间内将 DBT 降解为可溶
于水的化合物。周晓黎等［14］从缺氧生物滤池筛选
纯化得到一株具有高效反硝化能力的异养菌，经鉴
定为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），且该菌
的亚硝酸盐还原酶能力较强。同样，弓湃等［15］也
曾研究了施氏假单胞菌亚硝酸盐还原酶基因 nirS 的
转录特性，李献等［16］也曾发现 Pseudomonas stutzeri
菌株能够在厌氧条件下具有脱氮除硫作用，但并未
对其生长及反硝化特性进行更深入的研究。本研究
筛选出了同步脱氮除硫功能菌并鉴定其种属，确定
了其生长和反硝化的最佳条件，但其对氮、硫的去
除效果与实际工程应用的要求还有一定的差距，尤
其是除硫方面，应该继续通过反应底物的定量分析
确定其同步脱氮除硫的机理，来推进该菌株在高浓
度含氮含硫废水处理中的应用。
4 结论
通过对稳定运行的 UASB 工艺反硝化脱硫反
应器中的污泥进行反硝化脱硫菌的筛选分析，得到
如下结论 ：（1）初筛了 7 株同步脱氮除硫菌，根据
脱氮除硫实验结果筛选出 2 株脱氮除硫率最高的菌
株 H3 和 H7，经过菌落形态、生理生化实验和 16S
rDNA 基因序列鉴定，确定两株都为施氏假单胞菌
（Pseudomonas stutzeri）， 为 非 耐 盐 菌 株 ；（2） 菌 株
H3 和 H7 的生长最适起始 pH 为 6.94 和 6.88，最适
反硝化 pH 分别为 6.77 和 6.56。H3 和 H7 的最适生
长温度为 30.4℃和 30.6℃，最适反硝化温度分别为
31.4℃和 31.2℃，两株菌种都为非耐盐菌株。
参 考 文 献
［1］ Chen Y, Cheng JJ, Creamer KS. Inhibition of anaerobic digestion
process ：a review［J］. Bioresource Technology, 2008, 99（10）：
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and current biotechnologies for its removal［J］. Journal of Zhejiang
University Science A, 2007, 8（7）：1126-1140.
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［5］Sublette KL, Sylvester ND. Oxidation of hydrogen sulfide by
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0 1 2 3 4 5 6 7 8
NaCl⎃ᓖ%00.20.1OD 600 0.4
0.6
0.5
0.3
0.8
0.7
H3
H7
图 8　NaCl 浓度对菌株 H3 和 H7 生长的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10190
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（责任编辑 马鑫）