全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
收稿日期 : 2014-03-18
基金项目 :天然药物活性组分与药效国家重点实验室(中国药科大学)资助项目(JKGQ201105)
作者简介 :何东洋,男,博士研究生,研究方向 :肿瘤免疫 ;E-mail :hedongyang1983@163.com
通讯作者 :陈依军,男,教授,博士生导师,研究方向 :靶向药物设计与构效关系,生物催化等 ;E-mail :yjchen@cpu.edu.cn
王淑珍,女,副教授,研究方向 :抗肿瘤分子靶向创新药物 ;E-mail :shuzhenwang@cpu.edu.cn
肿瘤是一类多因素恶性疾病,通过多种途径逃
避免疫系统的杀伤作用[1]。因而旨在增强机体自
人源 CD137L 基因在不同表达系统中表达效率的比较
何东洋 马超 高振月 王淑珍 陈依军
(中国药科大学生命科学与技术学院,南京 210009)
摘 要 : 比较分析人源 CD137L 在毕赤酵母、枯草杆菌及大肠杆菌中的表达差异,建立适合 CD137L 的表达系统并检测
CD137L 的生物学活性。设计 PCR 引物,以酵母表达质粒 pPIC9K-CD137L 为模板,扩增 CD137L 片段,分别构建枯草杆菌表达质
粒及大肠杆菌表达质粒,再转化至相应的宿主菌并筛选阳性转化子 ;SDS PAGE 电泳分析 CD137L 的表达情况并比较差异 ;稀释复
性法复性 CD137L 包涵体,用离子交换层析纯化 CD137L ;T 细胞激活试验检测 CD137L 的活性。CD137L 在 3 个表达系统中均可以
表达并且得到质谱鉴定,但是在毕赤酵母、枯草杆菌中的表达量微弱,而在大肠杆菌中 CD137L 以包涵体形式高效表达,平均 1 L
培养液能得到 0.8 g 包涵体沉淀,200 mg 变性蛋白。经复性纯化后得到的 CD137L 能有效激活 T 细胞增殖并且其刺激活性呈现浓度
依赖效应。与毕赤酵母、枯草杆菌相比,大肠杆菌表达系统能高效表达 CD137L 蛋白,并且经稀释复性后 CD137L 保持了刺激小鼠
T 细胞增殖的活性。
关键词 : 毕赤酵母 枯草杆菌 大肠杆菌 CD137L T 细胞增殖
The Comparison of Expression Efficiency of Human CD137L in
Different Expression System
He Dongyang Ma Chao Gao Zhenyue Wang Shuzhen Chen Yijun
(College of Life Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)
Abstract: It was to construct a suitable expression system for CD137L by comparison of expression level of CD137L in Pichia yeast,
Bacillus subtilis, and Escherichia coli and determine the effect of CD137L on T cell proliferation. CD137L was amplified by PCR with designed
primers from yeast expression plasmid pPIC9K-CD137L and subcloned into vector pP43 or pET11a. Then recombinant plasmid pPIC9K-
CD137L, pP43-CD137L and pET11a-CD137L were transformed into GS115, WB800 and BL21, respectively. Positive clones were screened and
expression of CD137L was detected by SDS-PAGE. Then inclusion body of CD137L from Escherichia coli was refolded by dilute refolding and
CD137L was purified by ion exchange chromatography. After that, bioactivity of CD137L was determined by T cell proliferation assay. CD137L
was expressed by all the three expression system and further confirmed by Western blot assay. But expression level of CD137L in GS115 and
WB800 was too weak for further study. In contrast, CD137L was efficiently expressed in BL21 as inclusion body. It was about 0.8 g inclusion
body per 1 L cultured BL21 and 200 mg denatured protein was obtained. Then inclusion body was dissolved in 8 mol/L urea at 50℃or 60℃, and
active protein CD137L was obtained after dilute refolding. Then refolded CD137L was purified by ion exchange chromatography, and purified
CD137L demonstrated significantly costimulatory effect on T cell proliferation in dose-dependent manner. It was demonstrated that CD137L
was efficiently expressed in Escherichia coli expression system compared with Pichia yeast and Bacillus subtilis, and purified CD137L kept
costimulatory activity on T cell proliferation.
Key words: Pichia pastoris Bacillus subtilis Escherichia coli CD137L T cell proliferation
身免疫系统功能的肿瘤免疫治疗研究成为近年的热
点,其中 T 细胞介导的细胞免疫对肿瘤细胞的杀伤
2014年第9期 179何东洋等:人源 CD137L 基因在不同表达系统中表达效率的比较
尤为重要[2]。T 细胞激活主要需要两个信号 :MHC-
抗原肽复合物与 TCR 结合是第一信号,第二信号是
B7 分子与 CD28 的结合[3]。研究表明第二信号的缺
失会导致 T 细胞不应答、死亡以及免疫耐受,其对
T 细胞激活的起始有着决定性作用。同时多种免疫
刺激分子也参与 T 细胞的激活并在免疫效应的维持
过程有重要意义,包括 CD27/CD70、OX40/OX40L、
4-1BB/4-1BBL 等多种肿瘤坏死因子配体 / 肿瘤坏死
因子受体(TNF/TNFR)家族成员[4,5]。
免疫共刺激分子对 CD137/CD137L 是发现较晚
的 TNF/TNFR 家族成员[6]。CD137L 是Ⅱ型跨膜糖
蛋白,广泛表达于多种抗原递呈细胞表面如树突细
胞、B 细胞、巨噬细胞以及肿瘤细胞,而 CD137 是
Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达在活化的 T 细胞表面[7]。
多 项 研 究 显 示 CD137/CD137L 信 号 可 以 辅 助 第 一
信号 MHC/ 抗原复合物、协同但不依赖第二信号
B7/CD28 分子共激活 T 细胞,促进 T 细胞增殖、维
持激活 T 细胞的生存、增强 Th1 型细胞因子 IL-2 与
IFN-γ 的释放[5,8,9]。大量小鼠肿瘤模型试验表明
CD137/CD137L 能有效激活机体细胞免疫反应,抑制
肿瘤的生长。同时该信号分子在抗病毒、治疗自身
免疫性疾病方面也显示出较好的前景[10]。
然而目前有关 CD137/CD137L 的研究成果主要
来源于对抗 CD137 抗体以及改造的能表达 CD137L
的工程细胞的研究。但是临床数据表明抗 CD137 抗
体引起严重的肝脏毒性等副作用,而工程细胞尚
无法应用到临床[11]。虽然有研究利用昆虫细胞或
CHO 细胞重组表达 CD137L 蛋白,但是因为融合了
标签或其它免疫分子、糖基化修饰不均一等因素大
大限制了其潜在的临床应用价值[4,12]。因此重组表
达 CD137L 蛋白是一个亟待解决的命题。
本研究以 CD137L 的胞外区为对象,分别采用
酵母表达系统、枯草杆菌表达系统以及大肠杆菌表
达系统重组表达 CD137L,并进行比较分析,并且
检测表达的 CD137L 能否刺激小鼠 T 细胞增殖,旨
在为肿瘤的临床治疗性研究提供了理论指导与物质
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质 粒 与 菌 株 含 CD137L 胞 外 区 的 质 粒
(pPIC9K-CD137L)、原核表达载体 pET11a 以及毕赤
酵母菌株 GS115 由本实验室保存,pMD18T simple
购自大连宝生物工程有限公司,pP43 质粒与枯草菌
株 WB800 由南京农业大学李顺鹏教授惠赠,大肠杆
菌菌株 DH5α 与 BL21 购买于南京天根生化科技有限
公司。
1.1.2 试剂 1 kb DNA Ladder 购自北京天根生化科
技有限公司 ;限制性内切酶 BamH I、EcoR I、Nde I、
Nhe I、Pst I、Hind III 与 Not I,T4 连接酶,rTaqDNA
聚合酶购于大连宝生物工程有限公司 ;小量质粒提
取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购于杭州 Axygen 生
物工程有限公司 ;琼脂糖购自美国 Promega 公司 ;
蛋白胨、酵母提取物购自英国 OXOID 公司 ;乙醇、
异丙醇、甘油、醋酸钠、氯化钠、氨苄青霉素、卡
那霉素等均为国产分析纯试剂 ;antiCD137L mAb 购
自 Enzo Life Sciences 公司 ;G418 购于美国 Invitrogen
公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR 引 物 的 设 计 由 于 保 存 质 粒 pPIC9K-
CD137L 即 可 在 毕 赤 酵 母 里 表 达, 所 以 采 用 软 件
sequencher4.5 设计合成两套引物分别用于大肠杆菌
表达质粒及枯草杆菌表达质粒的构建,如表 1。
表 1 构建表达载体所用的引物
序列(5-3) 酶切位点
大肠杆菌引物
FP1 :gcatatgGCCGTCTTCCTCGCCTG Nde I
RP1 :cgctagcTCACTATTCCGACCTCGG- Nhe I
TGAAGG
枯草杆菌引物
FP2 :aactgcaggaGCCGTCTTCCTCGCCTG Pst I
RP2 :gaagcttTCATCATCATTCCGACCT- Hind Ⅲ
CGGTGAAGGGAG
1.2.2 人源 CD137L 基因不同表达系统表达载体的
构建及转化
1.2.2.1 大 肠 杆 菌 表 达 载 体 pET11a-CD137L 的 构
建 及 转 化 以 质 粒 pPIC9K-CD137L 为 模 板, 以 引
物 FP1 及 RP1 扩增目的片段 CD137L。将 PCR 产物
进行切胶纯化并用 Nde I/Nhe I 双酶切,同时双酶切
pET11a 并胶纯化。然后将纯化的基因 CD137L 与载
体 pET11a 进行连接反应,经筛选得到重组质粒,并
经酶切、DNA 测序正确后再用热激法转化至 BL21
菌株。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期180
1.2.2.2 枯草杆菌表达载体 pP43-CD137L 的构建及
转化[13] 以质粒 pPIC9K-CD137L 为模板,以引物
FP2 及 RP2 扩增目的片段 CD137L。将 PCR 产物进
行切胶纯化并用 Pst I/Hind Ⅲ双酶切,同时双酶切
pP43 并胶纯化。然后将纯化的基因 CD137L 与载体
pP43 进行连接,经筛选得到重组质粒,并经酶切、
DNA 测序正确后再用化学法转化至 WB800 菌株。
1.2.3 表达重组蛋白 CD137L 的阳性菌的筛选 毕
赤酵母 :参考 Invitrogen 公司毕赤酵母使用手册,筛
选表达目的蛋白 CD137L 的阳性克隆。枯草杆菌 :
挑单菌落小量培养于 Superrich 培养基中 37℃培养过
夜后扩大培养,并于每 24 h 时点取样分析[13]。大
肠杆菌 :挑选单克隆小量培养于 LB 培养基,37℃
过夜后转接并继续培养至 OD600 值达到 0.6-0.8,加
入诱导剂 IPTG,诱导 4 h 后取样分析。
1.2.4 大肠杆菌表达人源 CD137L 蛋白的变性与复
性 扩 大 培 养 表 达 CD137L 的 工 程 菌, 收 集 菌 体
并用超声法破碎细胞收集包涵体,经洗涤缓冲液
A(20 mmol/L Tris-HCL,pH8.5,2 mol/L 尿 素,2%
TritonX-100) 与 B(20 mmol/L Tris-HCL,pH8.5,2
mol/L 尿 素,5 mmol/L EDTA,0.5 mol/L NaCL) 交
替洗涤 4 次后溶解于变性缓冲液(20 mmol/L Tris-
HCL,pH8.5,8 mol/L 尿 素 )。12 000 r/min 离 心 30
min 得到 CD137L 的变性溶液。然后在 4℃下将变
性蛋白逐滴加入复性缓冲液(20 mmol/L Tris-HCL,
pH8.5,2 mol/L 尿素,0.1 mol/L L-Arg,10% 甘油),
调整蛋白终浓度至 20 μg/mL,搅拌 24 h 以上。超滤
浓缩复性蛋白。
1.2.5 阴离子交换层析纯化大肠杆菌表达的人源
CD137L 将阴离子交换柱 Q sepharose 接入 AKTA
purifier 10 UPC 纯化仪,以 5 倍柱体积缓冲液 A(20
mmol/L Tris-HCL,pH8.5)平衡 Q sepharose 交换柱,
至 UV280 nm 监测曲线水平 ;进样品蛋白,再以缓
冲液 A 洗脱不结合的蛋白 ;采用 125 mL 线性梯度
(0-100%)缓冲液洗脱,流速为 1 mL/min ;收集洗
脱液,2 mL/ 管。
1.2.6 大肠杆菌表达的人源 CD137L 的 T 细胞增殖
活 性 分 析 按 照 EasySep® Mouse T Cell Enrichment
Kit 使用说明分离、纯化小鼠 T 细胞,调整细胞浓度
为 106 个 /mL,100 μL/ 孔铺 96 孔板(用抗 5 μg/mL
抗 CD3 抗体预包被),加入终浓度为 2 μg/mL 的抗
CD28 抗体与不同浓度 CD137L 蛋白,37℃培养箱孵
育 96 h 后加 10 μL AlamarBlue/ 孔,继续培养 4 h 后
测定 A570 和 A600。根据如下公式计算细胞增殖率 :㓶㜎໎⇆⦷ 117216×A570 80586×A600
117216×P570 80586×P600
其中,A570 和 A600 为不同浓度 CD137L 蛋白或等量体
积 Buffer 联合抗 CD3 和 CD28 单克隆抗体刺激组在
570 nm 和 600 nm 下的吸光度 ;P570 和 P600 分别为抗
CD3 和 CD28 抗体联合刺激组(CD3+CD28)在 570
nm 和 600 nm 下的吸光度。
2 结果
2.1 人源CD137L基因不同表达系统表达载体的构建
经 PCR 扩 增、 酶 切、 连 接 后 构 建 了 人 源
CD137L 基因在大肠杆菌和枯草杆菌中的表达载体
pET11a-CD137L 和 pP43-CD137L,酶切鉴定结果(图
1)和 DNA 测序结果均表明重组表达载体构建成功。
6000
bp
M
A
1 2
3000
1000
500
6000
bp
M
B
1 2 3 4 5 6
3000
1000
500
A :枯草杆菌表达载体 pP43-CD137L 经 Pst I 酶切图谱,泳道 1、2 分别代表
不同的克隆,阳性克隆经 Pst I 酶切可得到一 500 bp 大小的条带(箭头所指);
B :大肠杆菌表达载体经 Pst I 酶切图谱,泳道 1-6 分别代表不同的克隆,阳
性克隆经 Pst I 酶切可得到一条 1 500 bp 大小的 DNA 片段(箭头所指);M :
DNA 标准分子量
图 1 表达载体的酶切验证
2.2 人源CD137L基因在不同表达系统中的表达
构建完成的表达载体被分别转化至相应的宿主
菌,经表达筛选得到能表达人源 CD137L 蛋白的 3
类工程菌株 :毕赤酵母(图 2),枯草杆菌(图 3),
大肠杆菌(图 4);并且均经质谱鉴定进一步确证。
但是,由图 2 及图 3 可以看出,CD137L 在酵母及枯
草杆菌中的表达量非常低。图 2 所示蛋白样品是经
10 倍浓缩后的酵母培养液上清,其浓度不足 0.1 μg/
mL,并且酵母糖基化修饰 CD137L 蛋白导致 CD137L
2014年第9期 181何东洋等:人源 CD137L 基因在不同表达系统中表达效率的比较
的分子量高于理论值。由图 3 可知,CD137L 在枯草
杆菌中的表达量很低,而且大量杂质蛋白的存在不
利于后续试验。
然而,CD137L 在大肠杆菌中以包涵体形式得
到高效表达,如图 4 所示。平均 1 L 培养液能得到 0.8
g 左右包涵体沉淀,变性溶解后能得到 200 mg 的变
性蛋白。这显著高于前两个表达系统,而且包涵体
能避免大肠杆菌蛋白酶解以及去除大部分杂质蛋白。
所以比较分析发现大肠杆菌更适合作为人源 CD137L
基因的表达宿主。
经超声破碎得到包涵体沉淀。经洗涤、变性溶解
后,得到了如图 5-A 所示含少量杂质的目的蛋白。
然 后 通 过 稀 释 复 性 的 方 法 得 到 复 性 后 的 CD137L
(图 5-B),经阴离子交换纯化得到了 SDS-PAGE 电
泳纯的目的蛋白 CD137L(图 5-C)。
116
kD
M 1 2 3 4
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
M :蛋白标准分子量 ;1-4 :不同克隆的表达上清,箭头标示目的蛋白
图 2 毕赤酵母 GS115 中 CD137L 的表达筛选
116
kD
M 1 2 3 4
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
M :蛋白标准分子量 ;1 :空 WB800 表达上清 ;2-4 :不同克隆的表达上清,
箭头标示目的蛋白
图 3 枯草杆菌 WB800 中 CD137L 的表达筛选
116
kD
M 1
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
M :蛋白标准分子量 ;1 :全菌,箭头标示目的蛋白
图 4 大肠杆菌 BL21 中 CD137L 的表达筛选
116
kD M 1 2 3
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
116
kD M 1
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
A B C
116
kD M 1
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
A :溶解包涵体蛋白 CD137L,1-3 分别表示在不同温度 40℃、50℃、60℃
下溶解的包涵体 ;B :稀释复性后的 CD137L ;C :纯化的 CD137L ;M :蛋
白标准分子量
图 5 包涵体蛋白 CD137L 的变性、复性及纯化
2.4 大肠杆菌表达人源CD137L蛋白的活性分析
前人研究表明 CD137L 能辅助激活 T 细胞,促
进 T 细胞的增殖,延长活化 T 细胞的寿命。因此,
本研究分析复性蛋白 CD137L 对小鼠 T 细胞的刺激
效应。如图 6 所示,CD137L 能有效刺激 T 细胞的增
殖,其增值率达到 1.0,与抗 CD3/CD28 抗体组比较
有显著性差异,并且该激活效应呈现剂量依赖性,
随蛋白浓度增加,T 细胞增殖率也增高。
Pr
ol
lfe
ra
tlo
n
ra
te
1.5
*
1.0
0.5
0.0
0.2A B
1.5
1.0
0.5Pr
ol
lfe
ra
tlo
n
ra
te
0.0
浓度 μg/mL0.25 0.5 1 2 4 6antiCD3/CD28antiCD3/CD28+CD137L
A :在 2 μg/mL 浓度时,CD137L 能显著刺激 T 细胞的增殖,*P < 0.05 表示
显著性差异 ;B :在序列浓度下,CD137L 刺激 T 细胞的增殖
图 6 纯化蛋白 CD137L 对 T 细胞的刺激效应
2.3 大肠杆菌表达人源CD137L蛋白的稀释复性及
纯化
扩 大 培 养 大 肠 杆 菌 阳 性 工 程 菌, 收 集 菌 体,
3 讨论
目前表达外源蛋白的方法包括哺乳动物细胞、
昆虫细胞、酵母、枯草杆菌以及大肠杆菌,而后 3
种表达系统因容易操作、成本低廉被广泛使用[14-16]。
毕赤酵母能高密度快速生长、易操作以及拥有真核
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期182
细胞的翻译后修饰功能等优点被广泛应用于药用生
物分子的表达如人白介素、葡萄糖氧化酶、S 腺苷
甲硫氨酸合成酶等[17-19]。但是外源基因的表达受多
种因素的影响,包括基因的整合效率、表达方式的
选择、密码子的偏爱性等[17,20]。通常分泌表达易于
下游蛋白纯化,因此本研究选择具有分泌信号肽的
pPIC9K 表达载体。但是分泌效率会影响目的蛋白的
得率。在本研究中虽然得到表达 CD137L 的酵母菌
株,但是表达量很低。尽管优化温度、诱导剂诱
导时间 / 剂量、菌种转接量等因素,依然无法提高
CD137L 的产量。整合基因的拷贝数会影响外源基因
的表达,但是本研究中在含 4 mg/mL G418 的平板上
筛选得到的克隆也不能有效表达 CD137L。分析可能
是毕赤酵母无法有效启动人源 CD137L 基因的转录、
翻译,因为胞内也没有目的蛋白滞留。同时,酵母
自身的蛋白酶也会降低 CD137L 的产率。
枯草杆菌是一类非致病性微生物,具有分泌
表达外源蛋白的能力。很多工业用酶被成功表达出
来[15,21]。但是本研究发现目的蛋白 CD137L 的表达
量非常微弱,优化表达条件也无法得到高表达量的
蛋白,而且大量胞外杂质的存在不利于 CD137L 的
纯化。枯草杆菌表达 7 种蛋白酶:中性蛋白酶(npr)、
中性蛋白酶 B(nprB)、金属蛋白酶(mpr)、碱性蛋
白酶(apr)、丝氨酸蛋白酶(epr、bpf、vpr),会大
大降低外源蛋白的得率[22]。尽管本研究使用的菌株
WB800 是蛋白酶缺陷型,可能还有一些蛋白酶目前
尚未被发现。同时,枯草杆菌中质粒不稳定、易丢
失也将导致 CD137L 的产率低。
大肠杆菌 BL21(DE3)菌株被广泛用于外源蛋
白的表达,具有生长快速、遗传背景清楚、蛋白表
达量高等优点[14,23]。在本研究中,CD137L 得到了
高效表达,并且以包涵体形式存在,其优势在于能
避免蛋白酶的降解、易于纯化 ;但是包涵体需要变
性、复性才能恢复生物学活性。目前研究较多的复
性方法是柱层析复性以及稀释复性,其中稀释复性
的平均复性率在 25% 左右[24]。本研究中 CD137L 的
得率在 15%-20%,并且 T 细胞激活试验表明复性的
CD137L 能有效促进 T 细胞的增殖。与酵母表达系统、
枯草杆菌表达系统比较,大肠杆菌表达系统更适合
CD137L 的表达,其产量高、成本低、操作容易,同
时没有真核细胞中翻译后修饰导致的产物不均一的
缺陷。
4 结论
本研究通过比较分析常用的 3 种表达系统对
CD137L 的表达情况发现,大肠杆菌更适合作为人源
CD137L 的表达宿主,其表达量达到 200 mg/L,并且
经后续复性的 CD137L 具有刺激小鼠 T 细胞增殖的
能力。本研究解决了重组人源 CD137L 蛋白获取难、
成本高的难题。同时本研究中 CD137L 没有融合标签,
这为研究天然 CD137L 分子的生物学功能以及临床
治疗研究提供借鉴。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)