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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):165-169
收稿日期 ：2014-10-29
基金项目 ：甘肃省草食畜牧业发展行动（GNKJ-2009-11）
作者简介 ：李积友，男，硕士，研究员，研究方向 ：动物遗传育种 ；E-mail ：youjili@sina.com
通讯作者 ：杜晓华，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：基础兽医学和动物发育生物学 ；E-mail ：duxh@gsau.edu.cn
甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子
多态性分析
李积友1，4 梁春花2  刘霞1，3  孙雪婧2  杜晓华1，2 
（1. 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070 ；2. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 ；3. 甘肃农业大学生命科学技术学院，
兰州 730070 ；4. 甘肃省畜牧业产业管理局，兰州 730030）
摘 要 ： 采用 PCR-SSCP 方法检测 50 头甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子的遗传多态性，并对群体内各等位
基因进行测序，旨为探讨西门塔尔牛 MSTN 基因与肉质性状关联等方面的研究提供理论依据。结果显示，甘肃西门塔尔牛甘州类
群 MSTN 基因 3 个外显子中，外显子 2 受 B、C 等位基因控制，形成 BB、CC 和 BC 3 种基因型，基因型频率分别为 0.22（11/50）、
0.64（32/50）、0.14（7/50）；外显子 1 和外显子 3 分别受 A 等位基因与 D 等位基因控制，形成 AA 和 DD 基因型，基因型频率均为
1（50/50）。序列分析表明，甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子中，外显子 2 在第 41 bp 处发生了 C → T 的突变，但
并没有导致氨基酸发生改变，属于同义突变 ；外显子 1 和 3 均无突变。统计结果表明，甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个
外显子中，外显子 2 为中度多态，其余均无变化。
关键词 ： MSTN 基因 ；外显子 ；遗传多态性 ；西门塔尔牛
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.026
Polymorphism Analysis of MSTN Gene Exons of Ganzhou Simmental
Cattle in Gansu Province
Li Jiyou1，4 Liang Chunhua2 Liu Xia1，3 Sun Xuejing2 Du Xiaohua1，2
（1. Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070 ；2. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural
University，Lanzhou 730070 ；3. College of Life Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；4 Gansu
Provincial Bureau of Animal Husbandry Industry Management，Lanzhou 730030）
Abstract: PCR-SSCP（single-strand conformational polymorphism）was used to detect the genetic polymorphism in 3 exons of myostatin
（MSTN）gene in 50 individuals of Ganzhou Simmental cattle in Gansu. The alleles in a population were verified by sequencing, which provided
the theoretical evidences for investigating the correlation between MSTN gene of Simmental cattle and meat quality. The results showed that the
polymorphism in the exon 2 was controlled by B and C alleles, which formed 3 genotypes of BB, CC and BC with the frequencies at 0. 22（11/50）,
0. 64（32/50）and 0. 14（7/50）respectively. The polymorphism in the exon 1 and exon 3 was controlled by A and D allele respectively, which
formed AA and DD genotypes with frequencies at 1（50/50）. Sequence analysis indicated that there was one single nucleotide mutation of C
to T at 41st nucleotide in the exon 2 of Ganzhou Simmental cattle ；however this did not lead to the amino acid changed, so it was a synonymous
mutation. There were no mutations in the exon 1 and exon 3. The statistical results showed that the exon 2 of MSTN gene in 50 individuals of
Ganzhou Simmental cattle had a moderate level of polymorphism, and the exon 1 and exon 3 had no polymorphism.
Key words: MSTN gene ；exon ；genetic polymorphism ；Simmental cattle
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6166
肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）属于转化
生长因子超家族的一员，对动物肌肉的分化和生长
具有重要的负调控功能［1］。研究发现，该基因不同
位点的单一变异均可能导致其活性的降低或丧失，
从而表现出“双肌”性状［2］，在肉用家畜的品种选
育方面有重要作用。截至目前，已有学者对猪、绵
羊、普通牛和牦牛等家畜 MSTN 基因多态性进行了
相关的研究报道［3-8］。本研究采用 PCR-SSCP 方法对
甘肃甘州地区西门塔尔牛 MSTN 基因 3 个外显子进
行多态性分析，探讨西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基
因的分子遗传特征，旨为丰富西门塔尔牛 MSTN 基
因的遗传数据以及甘肃西门塔尔牛品种选育提供理
论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验随机选取甘肃省张掖市甘州区的 50 头西
门塔尔牛，每头牛颈静脉采血 10 mL，ACD（酸性
柠檬酸葡萄糖）抗凝，用常规苯酚 - 氯仿法从血样
中提取甘州西门塔尔基因组 DNA，-20℃冻存。
蛋白酶 K、Tris 平衡酚购自大连宝生物工程有
限公司 ；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）
购自 Amersco 公司 ；过硫酸铵购自烟台市双双化工
有限公司；去离子甲酰胺、TEMED 购自 Sigma 公司；
甲叉购自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power
Taq PCR Master Mix 购自北京百泰克生物技术公司 ；
DNA marker 购自上海捷瑞生物工程有限公司 ；其他
常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。
梯度 PCR 仪 ：美国 ABI 公司生产 ；PROTEAN
Ⅱ xi Cell 双垂直电泳槽、PowerPac Universal 电泳仪：
美国 Bio-Rad 公司生产 ；F32 加热／制冷循环仪 ：德
国 Julabo 公司生产。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与 PCR 扩增 参考 GenBank 中的牛
（AC_000159）MSTN 基因序列，用 Primer 3.0 软件设
计 3 个外显子引物，其引物序列及预扩增片段的长
度详见表 1，引物由北京六合华大基因科技股份有
限公司合成。
PCR 反应体系为 20 μL ：其中 ddH2O 7.4 μL，引
物 F 和 R 各 0.4 μL， 预 混 酶 11 μL， 模 板 DNA0.8
μL，反应条件 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性 30 s，
退火 30 s，外显子 1、2、3 的退火温度分别是 57℃、
56℃、58℃，72℃ 延 伸 30 s， 共 35 个 循 环， 最 后
72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR 产物用 1% 的琼脂
糖凝胶电泳检测。
1.2.2 SSCP 检 测 取 2 μL 的 PCR 产 物 加 入 8 μL
的变性上样缓冲液（980 mL/L 去离子甲酰胺，0.25
g/L 溴 酚 蓝，0.25 g/L 二 甲 苯 青，pH8.0、0.01 mol/L
EDTA），105℃变性 10 min，立即冰浴 10 min。外显
子 1、2、3 均用交联度 39∶1、浓度 14% 的非变性
聚丙烯酰胺凝胶，150 V 电泳 24 h，温度分别 4℃、
10℃、10℃，银染法显色后拍照。
1.2.3 序列分析 PCR 产物送北京六合华大基因科
技股份有限公司进行测序。利用 DNAStar 软件包中
的 EditSeq 和 MegAlign 程序进行 DNA 序列的剪切校
对、比对和翻译，碱基组成一致的序列判定为同种
等位基因。
1.2.4 数据统计分析 基因型频率、基因频率统计
和 χ2 检验，基因杂合度（Heterozygosity，He）及有
效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）检测
利用 POPGENE（版本 1.32）软件完成，多态信息
含 量（Polymorphism information content，PIC） 利 用
PIC_Calc（版本 0.6）软件进行分析。
2 结果
2.1 PCR扩增
甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显
子用琼脂糖凝胶电泳检测（图 1），扩增产物与预期
扩增片段的长度相符，且条带清晰明亮无杂带，可
直接用于 SSCP 分析。
2.2 SSCP检测
SSCP 分析结果显示，所检测的 50 头西门塔尔
表 1 西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子的引物
序列及预扩增片段长度
扩增片段长度 引物序列（5-3）
外显子 1（396 bp）
F ：CCATGCAAAAACTGCAAATC
R ：TGCACCAGCAGGACTACTCA
外显子 2（382 bp）
F ：CTGATCTTCTAACGCAAGTGGA
R ：TCACTTACCAGTCCATCTTCTCC
外显子 3（404 bp）
F ：TTCTTTCCTTTCCATACAGACTCC
R ：GACCTCATGAACACCCACAGCGAT
2015,31(6) 167李积友等：甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN基因外显子多态性分析
牛甘州类群中外显子 1 仅发现了 AA 一种基因型，
外显子 3 只发现了 CC 一种基因型，二者均无多态
性（图 2、图 4）；外显子 2 共发现了 BB、CC、BC
3 种基因型，受 B 和 C 等位基因控制（图 3）。
列一致 ；外显子 3 只发现了 DD 一种基因型，且 DD
型与普通牛的相应序列一致，外显子 1 和 3 均无多
态性 ；外显子 2 发现了 BB、CC、BC 三种基因型，
受 B 和 C 等位基因控制，且 BB 等位基因与普通牛
的相应序列一致。外显子 2 的 C 等位基因与 B 等位
基因相比，在 41 bp 处发生 C → T 突变（图 5），但
未引起氨基酸序列的变化，为同义突变。
2.4 遗传多态性分析
对 50 头甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3
个外显子等位基因的基因型频率和基因频率进行了
统计，结果显示，外显子 1 仅存在 AA 一种基因型，
外显子 3 只存在 CC 一种基因型，外显子 1 和 3 的
基因型频率均为 1（50/50）；外显子 2 具有 BB、CC、
BC 三种基因型，其基因型频率分别为 0.22（11/50）、
0.64（32/50）、0.14（7/50），其中 CC 基因型为优势
基因型。B、C 两个等位基因的基因频率频率分别
为 0.29、0.71，C 等位基因是甘肃西门塔尔牛甘州类
群的优势等位基因。χ2 检测结果显示，MSTN 基因 3
个外显子的 3 种基因型在甘肃西门塔尔牛甘州类群
中处于 Hardy-Weinberg 平衡状态（P > 0.05）。甘肃
西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 2 突变位点
的杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）及多态信息
含量（PIC）的值分别为 0.1400、1.7001 和 0.32706，
表现为中度多态。
3 讨论
MSTN 基因对骨骼肌的生长具有负调节作用，
该基因虽然在进化过程中很保守，但也存在一定的
多态性。目前研究结果证实，MSTN 基因突变可以
导致牛具有双肌性状，表型特征是臀部、大腿、上
臂、胸及起支撑作用的中前端肌肉群异常发达，皮
下脂肪少，而有更多的脂肪沉积于肌纤维之间，皮
600
bp
M M1 2 3 4 5 6
500
400
300
200
100
M ：Accurate Run 100bp-I DNA ladder ；1，2 ：外显子 1 产物 ；3，4 ：外显子
2 产物 ；5，6 ：外显子 3 产物
图 1 西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子的 PCR
扩增
AA AA AA AA AA
图 2 西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 1 的 PCR-
SSCP 检测
BB BB CC CC BC BC
图 3 西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 2 的 PCR-
SSCP 检测
DD DD DD DD DD DD
图 4 西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 3 PCR-SSCP
检测
2.3 序列分析
对具有多态性的 PCR 产物进行克隆测序，得
到甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子
的核苷酸序列。将测序结果与 GenBank 中普通牛
（AC_000159）的序列进行比较分析，外显子 1 只发
现了 AA 一种基因型，且 AA 型与普通牛的相应序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6168
肤薄［9］。迄今为止，已经在 14 种牛中发现了双肌
现象。在肉牛中，MSTN 基因的 3 个外显子上已发
现 9 个影响氨基酸序列的变异，其中 6 个可导致“双
肌”。Lee 等［10］在皮埃蒙特牛 MSTN 基因中发现某
些单核苷酸替换导致了 MSTN 蛋白质功能的丧失。
Kambadur 等［11］和 Miranda 等［12］在研究比利时蓝牛
“双肌”性状时发现，其 MSTN 基因第 3 外显子处一
个 11 bp 的缺失是造成比利时蓝牛产生“双肌”性
状的原因。Grobet 等［13］检测了 10 个欧洲牛品种的
32 头双肌牛，结果发现了 7 个 DNA 多态性，其中 5
个推测造成了蛋白质功能的改变，1 个为保守氨基
酸替换，另一个为沉默 DNA 突变 ；在内含子中检出
了 4 个 DNA 多态型。冀德君等［14］研究了中国普通
牛、瘤牛、大额牛和牦牛 4 个牛属该基因外显子
区核苷酸序列的变异，结果显示，4 个中国牛种的
MSTN 基因发现 7 个核苷酸多态位点。
本研究利用 PCR-SSCP 方法分析了甘肃西门塔
尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外显子的多态性，结
果显示，外显子 1 仅检测出 A 等位基因，形成一种
AA 基因型 ；外显子 2 在其第 41 bp 处存在单碱基的
突变，有 B、C 两个等位基因，其中 C 等位基因为
优势等位基因，形成 BB、BC 和 CC 三种基因型 ；
外显子 3 只检测到 D 等位基因，形成一种 DD 基因型；
在对 50 头甘肃西门塔尔牛甘州类群群体基因型的检
测中，外显子 1 仅发现 1 例 AA 型突变纯合体，外
显子 3 也只检测到 1 例 DD 型突变纯合体，外显子 1
和 3 均未检测到杂合基因型，这一结果与吕文发等［15］
报道的中国西门塔尔群体中外显子 1 发现了 AC、
CC 两种基因型的结果不一致。原因可能是本实验的
研究对象为 50 头甘州地区的西门塔尔牛类群，其样
本数量不够多、样本来源比较集中、地理条件差异、
气候温度等有关，也可能是由于引进西门塔尔牛的
代数不长或是随着西门塔尔牛与甘州当地的黄牛杂
交代数的增加，经过自然淘汰或人工选择其基因型
趋于稳定状态，外显子 1 的 AA 型和外显子 3 的 DD
型被保留了下来，具体原因有待进一步的实验证实。
外显子 2 只发现 7 个 BC 基因型，其基因型频率远
低于 BB 和 CC 型，同时纯合体 CC 基因型频率也远
高于 BB 和 BC 型，结果表明 C 等位基因在长期的人
工选育过程中受到正向选择，处于优势地位。在甘
肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 2 中发现
1 处突变位点即第 41 bp 处 C → T 碱基的颠换，但
并没有导致西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因氨基酸
的改变，其是否会对整个 MSTN 的蛋白功能产生一
定的影响，有待进一步的实验研究。
多态信息含量（PIC）和杂合度（He）都是群
体内遗传变异的测度，其值的高低反映了群体内
个体的均质度，遗传变异大，数值就高。Botstein
等［17］提出了确定位点多态性的标准 ：PIC > 0.5 为
高度多态，PIC < 0.25 为低度多态，0.25 < PIC < 0.5
则为中度多态。本研究中，甘肃西门塔尔牛甘州
类群 MSTN 基因外显子 2 基因座的多态信息含量是
0.327 0，呈现中度多态，外显子 1 和 3 均无多态。
通过对甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因 3 个外
显子的遗传多态性分析发现，甘肃西门塔尔牛甘州
类群处于 Hardy-Weinberg 平衡状态。这可能是由于
甘肃西门塔尔牛甘州类群选择压力不强，因此在人
工选择、迁徙和遗传漂变等各种因素的作用下该基
T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T TCCCCG G G G G G
BBර BCර CCර
图 5 BB、BC 和 CC 基因型位于 41 bp 处突变的测序峰图
2015,31(6) 169李积友等：甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN基因外显子多态性分析
因座处于动态平衡中。说明甘肃西门塔尔牛甘州类
群群体内遗传比较稳定，这可能与甘肃西门塔尔牛
甘州类群的本品种选育有关。
目前，对于 MSTN 的研究相当广泛。MSTN 突
变的动物不仅骨骼肌群分布广泛，且肉质性状优良，
MSTN 基因已成为畜禽肉质性状的最主要标记基因，
因此在畜牧业上，可以筛选 MSTN 基因突变的个体，
通过育种培育出产肉率高的优良畜禽品种。
4 结论
甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基因外显子 1
由 A 等位基因控制，外显子 3 由 D 等位基因控制，
外显子 1 和 3 分别形成 AA 基因型和 DD 基因型 ；外
显子 2 由 B、C 两个等位基因控制，存在 BB、CC 和
BC 三种基因型，基因型频率分别为 0.22，0.64，0.14。
与其他牛相比，甘肃西门塔尔牛甘州类群 MSTN 基
因仅外显子 2 在 41 bp 处发生了 C → T 的突变，外
显子 1 和 3 均无多态，外显子 2 基因座的 PIC 值为
0.3270，呈中度多态。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）