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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):122-128
花是被子植物特有的生殖结构［1］。利用分子生
物学和遗传学对拟南芥、金鱼草、矮牵牛花等模式
植物研究发现，花的形成是受许多基因和代谢途径
所调控的复杂网络［2］。该网络中许多基因编码转录
因子，通过结合其他基因的调控区，激活或抑制他
们的表达［3］。在参与花发育的过程中，大多数属于
MADS-box 基因。
MADS-box 基因是一个含有 56-60 个氨基酸的
高度保守的 MADS 盒子的一类重要的真核生物转录
调控因子基因家族，在真核生物的发育过程中，与
靶基因的顺式作用元件结合，通过调控生物的生长
发育和信号传导来发挥作用。首先是通过对拟南芥
和金鱼草的研究中发现其具有调控花器官发育方面
的功能［4］，后来的研究报告中显示其在果实发育、
胚胎发育和营养器官的发育中也起着重要作用［5］，
说明 MADS-box 基因是一个具有多种功能的超基因
家族。
MADS-box 基 因 编 码 的 与 DNA 结 合 的 转 录 因
收稿日期 ：2014-10-26
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270371，31200178），国家科技支撑计划项目（2011BAI0301-02），吉林省科技成果转化项目（20125068）
作者简介 ：郭双双，男，硕士生研究生，研究方向 ：微生物及分子生物学 ；E-mail ：1530811226@qq.com
通讯作者 ：杨利民，男，博士，教授，研究方向 ：中药资源生态与药材质量调控研究 ；E-mail ：ylmh777@126.com
人参 euFUL 基因的克隆与生物信息学分析
郭双双  刘翠晶  韩梅  杨利民
（吉林农业大学中药材学院 吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室，长春 130118）
摘 要 ： 旨在研究人参（Panax ginseng C.A.Meyer）花的形成，根据 GenBank 数据库中基因片段设计特异引物，利用 cDNA
快速末端扩增方法（RACE），克隆了人参花中一个 5 端部分缺失 euFUL（命名为 PgFuL）的编码区序列。获得的 PgFUL 基因由
867 个核苷酸组成，编码 212 个氨基酸。生物信息学分析结果显示，PgFUL 编码蛋白分子质量为 24.64 kD，等电点 pI5.80，不含
信号肽，无跨膜区。二级结构中 α-螺旋结构占 60.19%、延伸链占 5.21%、无规则卷曲占 34.60%。序列比对和系统进化分析表明，
PgFUL 人参 PgMADS protein3（BAK20018.1）的序列同源性为 100%，与加拿大蝙蝠葛（AGX01589.1）相似度达 95%，属于 A 功能
基因中的 euFUL 进化系。
关键词 ： euFUL 基因 ；生物信息学分析 ；基因克隆 ；人参
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.019
Cloning and Bioinformatics Analysis of euFUL Gene in Panax ginseng
Guo Shuangshuang Liu Cuijing Han Mei Yang Limin
（State Key Laboratory for Ecological Restoration and Ecosystem Management of JLP-MOST Collective Construct-KLUER，College of Herbal
Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract: To study the flower development of Panax ginseng, designing specific primers according to gene fragments in the GenBank
data, and the 5 end deletion coding sequence of a euFUL（named PgFUL）gene in ginseng flower was cloned by the rapid amplification of
cDNA ends（RACE）. PgFUL consists of 867 nucleotides, and encoding a protein of 212 amino acids. The bioinformatics analysis shows that
PgFUL-encoding protein has isoelectric point（pI）of 5.80 and a calculated molecular weight about 24.64 kD without transmembrane region
and signal peptide. In the secondary structure, the percentage of α-helix, extended strand and random coil are 60.19%, 5.21% and 34.60%,
respectively. The homologous analysis by sequence alignment and phylogenetic indicates that PgFUL is in 100% similarity with ginseng PgMADS
protein3（BAK20018.1）and 95% with Menispermum canadense（AGX01589.1）, which belongs to evolutionary euFUL in functional gene A.
Key words: euFUL gene ；bioinformatics analysis ；gene cloning ；Panax ginseng
2015,31(6) 123郭双双等：人参 euFUL基因的克隆与生物信息学分析
子蛋白在植物、动物和真菌的基因组中均已被鉴
定［6］，在过去的几年中，有许多 MADS-box 基因从
不同的植物种类中被分离。在植物从真菌和动物中
分化之前发生了基因复制事件，产生了两个主要的
MADS-box 基因类型，即 I 型和 II 型［7］。I 型和 II 型
MADS-box 基因在动物和真菌负责各种途径的转录
与调控，包括生长发育的调控。在植物中，Type Ⅰ
型功能不是很清楚，所有已知功能的 MADS-box 基
因均属于 Type Ⅱ型，II 型 MADS-box 基因可以进一
步被分为 MIKC* 和 MIKCc 型，这两种类型 MADS-
box 基因的主要区别表现在 I 区和 K 区序列结构的
差异［8］。大多数 MIKCc 型基因能编码 MADS-box 蛋
白，由 4 个具有特定功能的结构域组成，即 MADS-
I-K-C domain。 植 物 MIKCc 型 MADS-box 基 因 由 于
其在花发育过程中的重要作用而受到生物学家的关
注［9］，通过对拟南芥（Arabidopsis thaliana）和金鱼
草（Antirrhinum majus）等模式植物花器官发育的研
究，提出阐释被子植物花发育的简单的 ABC 模型和
ABCDE 模型，将控制花发育的同源异型基因分为 A、
B、C、D、E 五类基因。它们共同控制着萼片、花瓣、
雄蕊、心皮及胚珠的形成和发育。
ABCDE 模 型 中 除 了 AP2 不 属 于 MADS-box 基
因家族成员外，其余均是 MADS-box 基因不同亚家
族成员。通过对处于系统进化不同地位的被子植物
各类群中分离得到大量的 MADS-box 基因进行系统
发育重建，将它们分为 12 个主要的亚家族［10］。在
拟南芥植物中大多数的 MADS-box 基因只在花中表
达，而 FUL 却在植物发育的不同特异阶段表达。拟
南 芥 中 FRUITFULL（FUL） 基 因 属 于 花 同 源 异 型
基因中的 A 类基因，位于第 5 条染色体。FUL 和
APETALA1（AP1）序列具有很高的相似性，属于
AP1/SQUA 基因亚家族。在 AP1/SQUA 亚家族的进
化过程中至少发生了 4 次基因重复事件。在核心真
双子叶植物（core eudicots）中发生了两次基因重复
事件，结果产生了 euAP1、euFUL 和 FUL-like 3 个
进化系［11］。目前，从拟南芥中克隆出的 3 个 A 类基
因，AP1、FUL、CAL 3 个基因在控制花分生组织
特异性发育的功能方面具有冗余性［12］，与 AP1 和
CAL 相比，FUL 基因则具有广泛的功能 ：它既能在
花发育早期促进花序分生组织的形成，又能在花发
育的晚期在心皮及角果中行使功能，同时该基因还
影响叶片的发育［13］。
本研究根据 GenBank 已登录的其他被子植物
MADS-box 基因保守区序列设计引物，利用 cDNA 快
速末端扩增（RACE）技术克隆人参 A 功能 MADS-
box 基因 3 端 cDNA 序列，命名为 pgFUL 基因，运
用生物信息学软件对该基因序列结构进行分析，通
过 MEGA5.0 构建系统发育进化树分析它们的进化地
位，旨在探究人参花发育的分子遗传机理，为今后
深入研究该基因功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 五年生栽培人参（Panax ginseng）
于 2014 年 6 月初采自吉林省抚松县抚南林场，利
用剪刀将已开放的花序剪下放于自封袋中。采集后
立即放于冰盒中保存，第 2 天回到实验室立即用自
来水冲洗 3-5 次，用吸水纸吸掉表面水分，用灭过
菌的镊子将花放于冻存管中，立刻置于液氮速冻，
-80℃保存备用。
1.1.2 试剂 EASYspin Plus 植物 RNA 快速提取试
剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司 ；M-MuLV
第一链 cDNA 合成试剂盒购自上海生工生物工程股
份有限公司 ；2×Power Taq PCR Mastermix ；质粒提
取试剂盒 ；多功能 DNA 纯化回收试剂盒 ；DNA 连
接试剂盒等均购自北京百泰克生物科技有限公司 ；
JM109 感受态菌株购自北京鼎国生物技术有限公司。
1.1.3 仪 器 PCR 扩 增 仪（Mastercycler nexus）；
-80℃超低温冰箱（SANYO）；低温冰箱（BCD-268
TN，青岛海尔股份有限公司）；凝胶成像系统（GIS-
2010，天能科技（上海）有限公司）；制冰机（SIM-
F140，SANYO）；高速冷冻离心机（HC-2518R，安
徽中科中佳科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌
器（LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂）；恒温水
浴槽（北京精科华瑞仪器有限公司）；培养箱（北京
议嘉林科技有限公司）；电泳仪（DYY-8C 型，北京
六一电泳厂）。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取和 cDNA 的合成 取人参花样品，
在液氮中研磨，依据艾德莱生物公司的 EASYspin
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6124
Plus 植物 RNA 快速提取试剂盒的操作步骤提取人参
总 RNA，用 0.7% 的琼脂糖电泳检测 RNA 完整性。
利用生工生物工程股份有限公司的 Moloney Murine
Leukemia Virus Reverse Transcriptase 反转录酶，按照
该试剂盒提供的步骤和反应条件将 RNA 反转录成第
一链互补链 DNA（cDNA）。
1.2.2 PgFUL 基因的扩增与测序 根据 PgFUL 的 cD-
NA 片段序列设计 3-RACE 扩增特异引物，上游引物
为 ：5-TTTTTTTTTTTTTTTTTCGCCGGCGACATCCT-
AGGCC-3，下游引物为 ：5-CTAGAGYACKCGRAA-
GAASTC-3，cDNA 模 板 为 3-RACE 第 一 链 cDNA，
20 μL 反 应 体 系 ：1.0 μL cDNA、9 μL 2×Taq Mix、
上 下 游 引 物 各 0.8 μL（10 μmol/L）、8.4 μL ddH2O。
PCR 反应程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃ 30 s，48℃
30 s，72℃ 1 min，10 个循环 ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，
72℃ 1 min，25 个循环；72℃ 10 min，4℃保温。0.7%
的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，对扩增所得目的
片段进行切胶回收。
将回收产物与 pMD20-T 载体连接，再转化到
JM109 感受态菌株中进行克隆，涂布在含有 X-gal、
IPTG 和 Amp 的 LB 平板上于 37℃进行培养，挑取
白色菌落单克隆经菌落 PCR 扩增和电泳检测后选择
阳性克隆送公司测序。
1.2.3 生物信息学分析 将所测定的序列结果在
NCBI 通过 Blast 搜索蛋白质和核苷酸数据库，并由
DNAMAN 软件翻译成氨基酸序列，使用 ORF Finder
（http ：//www.ncbi.nlm.nih.g ov/gorf/gorg.html） 查 找 开
放阅读框（ORF）。生物信息学分析主要采用一些网
上 软 件 包 进 行 分 析， 进 行 信 号 肽 预 测 Signal P4.1
（http ：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），如采用 Ex-
pasy 中的工具 ProtParam 进行理化性质预测（http ：//
web.expasy.org/protparam/），TargetP 1.1（http ：//www.
cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析亚细胞定位，TM-
pred（http ：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_
form.html）进行跨膜域预测。
采 用 SWISS-MODEL（http ：//swissmodel.expasy.
org/）进行二级结构的分析。用 DNAMAN 软件对序
列进行多重比对，用 ClustalW 软件与其他植物中的
MADS-box 氨基酸序列进行比较，用 MEGA5.1 软件
构建 Neighbor-Joining 系统进化树，bootstrap 重复次
数为 1 000 次。
2 结果
2.1 人参PgFUL基因的克隆
将提取的人参花的总 RNA 经 0.7% 的琼脂糖凝
胶电泳进行检测，可知 28S rRNA 与 18S rRNA 条带
宽度和亮度比接近 2∶1，说明 RNA 提取的完整性
较好，未发生明显的降解（图 1-A）。根据 PgFUL 的
cDNA 片段序列设计 3-RACE 扩增特异引物，cDNA
模板为 3-RACE 第一链 cDNA 进行 PCR 扩增，PCR
产物经 0.7% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得的
片段大小约为 867 bp，结果（图 1-B）显示，使用
pMD20-T 载体通用引物对白色菌落的单克隆进行菌
落 PCR 检测，结果如图 1-C 所示，选取白色菌落中
的阳性克隆菌送去测序。
2000 28S18S
bp
M
750
2000
867
bp bpbp
M
750
2000
867
bp
M
750
A B C
M ：DL2000 Marker LG2000 ；A ：人参花中提取的总 RNA ；B ：PgFUL 基因
的 3-RACE 结果 ；C ：菌落 PCR 鉴定结果
图 1 琼脂糖凝胶电泳图
2.2 缺失部分5端碱基的PgFUL及其编码蛋白的生
物信息学分析
2.2.1 PgFUL cDNA 测序结果及其编码蛋白的理化
性质 对测序结果校对并分析确定已克隆的 cDNA，
全长 867 bp，具有 639 bp 的 CDS 和 228 bp 3 端非
翻译区（untranslated region，UTR），编码由 212 个
氨基酸残基组成的蛋白质（图 2）。通过 ProtParam
对该蛋白理化性质的分析，结果表明该蛋白分子式
为 C1074H1727N305O338S10，总原子数为 3 454。其分子
量是 24.64 kD，pI5.80。带正电残基（Arg+Lys）28，
带负电残基（Asp+Glu）34，不稳定指数为 56.28，
表明该蛋白不稳定。脂溶指数为 86.51，总平均亲水
性为 -0.753，表明该蛋白为亲脂性蛋白。
2015,31(6) 125郭双双等：人参 euFUL基因的克隆与生物信息学分析
2.2.2 PgFUL 编码蛋白二级结构分析及结构域预
测 采用 SWISS_MODEL 对 PgFUL 编码的蛋白进行
二级结构的分析和结构域的预测。PgFUL 的编码蛋
白二级结构中 α-螺旋（alpha helix）占 60.19%、延
伸链（extend strand）占 5.21%、无规卷曲（random
coil）占 34.60%。
InterproScan 的结构域预测结果（图 3）表明，
PgFUL 编码蛋白含有两个保守结构域，一个是转录
因 子 MADS-box 结 构 域（Transcription factor MADS-
box domain，IPR002100），位于氨基酸残基的 1-31
位之间，或 1-33 位、1-67 位之间，另一个是转录
因 子 K-box 结 构 域（Transcription factor K-box doma-
方框表示 taa 作为终止密码子，双下划线表示 mRNA 的 PolyA 尾巴结构
图 2 cDNA 缺失部分碱基的 PgFUL 基因
IPR002100：Transcription factor，MADS-box，Domain
InterproScan
1 212
PF00319
PS50066
SSF55455
PF01486
IPR002487：Transcription factor，K-box，Domain
图 3 InterproScan 对 PgFUL 基因编码蛋白结构域预测结果
in，IPR002487），位于氨基酸残基的 47-146 位之间。
2.2.3 PgFUL 基因氨基酸序列同源性分析 将 PgF-
UL 基因的氨基酸序列于 GenBank 数据库中进行 bla-
stp 比对，获得与其具有同源性较高的 A 功能 MADS-
box 氨基酸序列，利用 DNAMAN 软件进行同源性分
析。结果（图 4）显示，由同源性比对结果可知，
Panax g FUL2 和 GenBank 数据库中的 Panax g FUL1
（BAK20018.1，Panax ginseng）属于同一序列，序列
相似度 100%，与八仙花 APETALA1/FRUITFUL、咖
啡树 FUL、大桉 EUGRSUZ_K02547、金鱼草 euFUL、
苹果 MdMads2.1 的氨基酸序列具有较高的序列相似
性。euFUL 进化系和 FUL-like 进化系成员的 C末端
结 构 域 拥 有 FUL motif 和 paleoAPl motif，euAP1 进
化 系 成 员 均 拥 有 FUL motif 和 euAPl motif。Panax g
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6126
M 98ArabidopsisAP1
100ArabidopsisCAL
98Betula_p_MADS3
100Nicotiana_t_NAP1
98AntirrhinumSQUA
70#Panax_g_FUL2
98Panax_g_FUL1
98Hydrangea_m
98EUGRSUZ_K02547
98Malus_d_MADS5
98Coffea_a_FUL
67AntirrhinumFUL
98Vitis_v_AP1
98Oryza_s_MADS14
98Zea_m_AP1
98Oncidium_h_MADS1
98ArabidopsisAGL79
Consensus
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241Nicotiana_t_NAP1
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240Panax_g_FUL1
250Hydrangea_m
245EUGRSUZ_K02547
255Malus_d_MADS5
242Coffea_a_FUL
212AntirrhinumFUL
247Vitis_v_AP1
246Oryza_s_MADS14
273Zea_m_AP1
242Oncidium_h_MADS1
249ArabidopsisAGL79
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MADS domain K domain
K domain
euAP1
euAP1
motif
euFUL
FUL-like
FUL motif paleoAP1 motif
MADS、K 结构域以及 FUL 基序、paleoAPl 基序、euAPl 基序用方框标出 ； #Panax-g-FUL2 ：PgFUL 编码蛋白
图 4 部分 A 的功能基因的氨基酸序列进行比对结果
FUL2 蛋白的 C 末端结构域拥有保守的 FUL motif 和
paleoAPl motif，而不具有 euAPl motif，表明 Panax g
FUL2 基因可能属于 A 功能基因中的 euFUL 进化系。
2.2.4 PgFUL 编码蛋白信号肽、亚细胞定位、跨膜
区预测分析 应用在线 Signal 4.1 Server 软件分析
结果表明 PgFUL 编码蛋白不含信号肽。在线工具
TargetP 1.1 Server 预测该蛋白定位于细胞质中，使用
TMHMM Server v.2.0 预测 PgFUL 编码蛋白跨膜区域，
结果显示无跨膜区域，PgFUL 整条肽链都位于细胞
膜外，即 PgFUL 不存在跨膜结构域。结合上述转运
肽的预测，可以推断，PgFUL 也是在细胞质基质中
合成后，没有经过蛋白转运，直接锚定于细胞质基
质中的特定部位行使催化功能。
2.2.5 PgFUL 编码蛋白系统进化树分析 为了分析
pgFUL 编码蛋白的进化情况，从 GenBank 数据库中
共选取了 22 条 A 功能基因的序列，经过软件 Clustal
W 比对，并利用 MEGA5.1 中的 Neighbor-Joining 方
法［14］，构建了包括核心真双子叶植物、基部被子植
物和基部真双子叶植物的系统进化树。树枝长度用
比例尺表，其中 FUL Panax ginseng 代表本研究利用
3-RACE 克隆得到的缺失部分 5 端目的片段。系统
发育树分析（图 5）显示，A 功能基因包括 4 个进
2015,31(6) 127郭双双等：人参 euFUL基因的克隆与生物信息学分析
化系 ：拟南芥 AGL79 单独为一支、FUL-like 为一支、
euAP1 为一支、FUL Panax ginseng 基因与加拿大蝙
蝠 葛（AGX01589.1） 相 似 度 达 95%， 同 属 于 类 别
euFUL 为一支。故 PgFUL 基因属于 A 功能基因中的
ABF82231.1 Nicotiana tabacum
AAF19721.1 Petunia x hybrida
AAD39036.1 Nicotiana sylvestris
AAP83363.1 Antirrhinum majus
BAG68947.1 Hydrangea macrophylla
AGX01589.1 Menispermum canadense
BAK20018.1PgMADS3 Panax ginseng
FUL Panax ginseng
AHW58040.1FUL Coffea arabica
KCW48936.1EUGRSUZ K02547 Eucalyptus grandis
ABB22023.1MdMads2.1 Malus domestica
CAA45228.1SQUA Antirrhinum majus
AAD01422.1NAP1-2 Nicotiana tabacum
AF448521 1MADS-MC Solanum lycopersicum
CAA67967.1MADS3 Betula pendula
CAA78909.1AP1 Arabidopsis thaliana
AEE30674.1CAULIFLOWER Arabidopsis thaliana
AAQ83693.1 Chloranthus spicatus
ADJ67240.110 Oncidium hybrid cultivar
AAF19047.1MADS14 Oryza sativa
NP 001105333.1 Zea mays
AAN52802.1AGL79 Arabidopsis thaliana
100
99
100
100
66
70
35
89
56
40
95
44
89
72
57
80
33
10
29
0.05
euFUL
euAP1
FUL-like
图 5 利用从人参中克隆得到的 PgFUL 基因编码的蛋白序列与其他植物中的 A 功能基因的氨
基酸序列构建系统发育树
euFUL 进化系。
3 讨论
人参是多年生传统的中药材，3 年生以上的植
株每年均可开花，开花时间 7-15 d，其中 8-10 d 居
多，种子具有后熟现象。MADS-box 基因家族具有调
控植物花的形成、果实的发育以及营养生长等方面
的作用。本研究通过克隆 PgFUL 基因，生物信息学
分析预测基因的保守结构域及基因功能［15，16］。基于
生物信息学分析，分别对 PgFUL 蛋白氨基酸序列的
理化性质、二级结构、结构域、蛋白信号肽、亚细
胞定位和跨膜区进行预测分析，但预测结构和性质
仍需试验验证。
利用 MEGA5.10 软件，通过搜索 GenBank 数据
库上与所克隆人参 PgFUL 氨基酸序列进行同源性分
析和系统进化分析。PgFUL 和 GenBank 数据库中的
Panax g FUL1（BAK20018.1，Panax ginseng）相似度
达 100%，可以认定二者为同一种蛋白氨基酸序列。
PgFUL 蛋白氨基酸的 C 末端结构域拥有保守的 FUL
motif 和 paleoAPl motif，而不具有 euAPl motif，与洋
葱的 AcFUL 基因的 C 末端结构域相同［17］，进一步
通过系统进化树分析表明 PgFUL 基因可能属于 A 功
能基因中的 euFUL 进化系。褚婷婷等［18］克隆得到
拟南芥 FRUITFULL（euFUL）基因启动子区与其第
一内含子，对 FRUITFULL 基因表达起到重要的调
控作用。A 功能基因在被子植物中发生了两次基因
重复事件，在被子植物形成之前的重复事件产生了
FUL-like、euFUL 和 euAP1 三 个 进 化 系。 由 于 FUL
基因在控制植物开花结果方面的特殊作用，随着对
其深入的研究，相信在农业生产、品种改良等方面
将取得巨大成就。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6128
PgFUL 基因仅是人参 MADS-box 基因家族中的
一个成员，其功能仍需进一步研究，为了解人参花
形成、果实发育及营养生长过程，在后续研究中需
要克隆人参 MADS-box 基因家族的其他成员，分析
各自的基因功能，研究各成员之间是否存在协同作
用或功能冗余。
4 结论
通过克隆获得的 PgFUL 基因由 867 个核苷酸
组成，编码 212 个氨基酸。生物信息学分析结果显
示，PgFUL 编码蛋白分子质量为 24.64 kD， 等电点
pI5.80，不含信号肽，无跨膜区。二级结构中 α-螺
旋结构占 60.19%、延伸链占 5.21%、无规则卷曲占
34.60%。与加拿大蝙蝠葛（AGX01589.1）相似度达
95%，同属于类别 euFUL 为一支。故 PgFUL 基因属
于 A 功能基因中的 euFUL 进化系。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）