全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-21
基金项目 : 国家重点基础研究发展计划项目（“973” 计划）（2010CB-126105）, 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目 [ 黔科教（2009）
0132 号 ]，贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目 [ 黔省专合字（2009）104 号 ], 贵州省科技成果重点推广计划项目 [ 黔科
合成字 (2010)5034]，贵州省科技厅农业攻关项目 [ 黔科合 NY 字（2011）3052 号 ]
作者简介 : 陈卓 , 男 , 博士 , 副教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 植物分子生物学和植物病毒剂 ; E-mail: gzdxfcc@126.com
烟草 HrBP的研究与应用
陈卓 于丹丹 郭勤 刘家驹 王贞超 李向阳 毕亮
胡德禹 杨松 宋宝安
（贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地，贵阳 550025）
摘 要： 旨在进一步发掘 HrBP在新农药创制和抗病品种选育等方面的价值，采用 BLAST和 Clustal X2软件对 HrBP进行序
列同源性分析，发现其序列较保守；采用 PSIPRED Protein Structure Prediction在线服务器进行烟草 HrBP二级结构预测，采用 UCL
Department of Computer Science进行 HrBP跨膜结构预测，发现两种可能存在的跨膜方式；采用 SWISS-MODEL、Phyre和 CPH进行
HrBP空间结构预测，发现以膜蛋白为模板进行模建的蛋白具有相似的空间结构；建立基于 Real-time PCR的 HrBP mRNA定量分析
方法，其相关系数为 0.999 6 ；通过 ProtScale方法分析 HrBP抗原指数，并获得序列特异性较高的多肽，采用 9-氟甲氧羰基固相合
成法制备多肽，并由此制备多克隆抗体，采用 Indirect-ELISA和Western blotting测定其效价和特异性，表明多克隆抗体可特异识别
烟草 HrBP。采用 DIBA和Western blotting试验研究多克隆抗体对常见植物的抗原识别特性，发现多克隆抗体对这些植物的 HrBP
均有一定识别能力。此外，采用 Real-time PCR和 Indirect-ELISA等方法进行烟草各组织部位 HrBP的表达量的研究，发现 HrBP在
各组织部位存在差异表达。
关键词： Harpin结合蛋白 生物信息学分析 基因克隆表达 多克隆抗体制备 烟草组织差异表达
Study and Application of HrBP from Tobacco
Chen Zhuo Yu Dandan Guo Qin Liu Jiaju Wang Zhenchao Li Xiangyang
Bi Liang Hu Deyu Yang Song Song Baoan
（State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering， Guizhou University，Guiyang 550025）
Abstract: To further explore the potential value of HrBP in new pesticide creation and disease resistance breeding，the sequences
homology was firstly analyzed by BLAST and by Clustal X2 software，and the results indicated that the sequence of HrBP was much conserved，
then tobacco HrBP secondary structure was predicted by the server of PSIPRED Protein Structure，the transmembrane structure of HrBP
was also analyzed by UCL Department of Computer Science with obtaining to two kinds of feasible transmembrane mode ； SWISS-MODEL，
Phyre and CPH were used to predict HrBP spatial structure with obtaining the similar results about HrBP spatial structure at the condition of
membrane proteins as a modeling template ； a method of quantitative analysis HrBP mRNA was established by Real-time PCR，and the results
indicated that the correlation coefficient of Real-time PCR was reached at 0.999 6 ； Polypeptides with sequence-specific were obtained by
ProtScale software，the polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods for preparation polyclonal antibody，and its titer
and specificity were determined by indirect-ELISA and Western blotting. The results shown that polyclonal antibody can detect the specific band
in tobacco leaves. The recognition ability of this polyclonal antibody was evaluated against maize，rice，cabbage，radish and Chenopodium
amaranticolor by DIBA and Western blotting，and the results showed that the polyclonal antibody possessed recognition ability to these plants
to some extent. In addtion，Real-time PCR and Indirect-ELISA method were used to evaluate the differentially expression of HrBP in various
tissues in tobacco.
Key words: Harpin binding protein （HrBP） Bioinfromatics analysis Gene cloning and expression Polyclonal antibody preparation
Differentially expression in tobacco issues
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期60
Harpin binding protein （HrBP） 是 位 于 植 物 细
胞壁上的一种受体蛋白，由 280 个氨基酸构成，分
子量约为 30 kD ［1］。该蛋白首先发现于拟南芥，后
陆续发现大豆、番茄、马铃薯和水稻等植物中也
有该蛋白存在。HrBP 可激活植物细胞内水杨酸
（salicylic acid，SA）、乙烯（ethylene，ET）和茉莉
酸（jasmonic acid，JA）等信号通路，可使病程相关
蛋白（pathogenesis related protein，PR）和植保素等
防御物质含量增加，植物表现出抗虫、抑菌、抗病
毒等生物活性［1］。研究发现，HrBP 激活所产生的
抗病或抗逆通路由如下基因及通路构成 ：enhanced
disease susceptibility-5 （EDS5）- SA/ nonexpressor of
pathogenesis-related genes 1（NPR1）/unknown effective
protein pathway，EDS/SA/NPR1/AOX/PR pathway 和
ethylene （ET）/jasmonic acid （JA）/PDF1.2/Thi2.1 ［2-5］。
此外，研究表明，HrBP 的激活与病程相关蛋白基
因——HIN1 密切相关，而该基因的激活受 mitogen-
activated protein kinase （MAPK）的调控［6］。也有研
究表明 HrBP 受其配体——harpin（一种病原菌表达
蛋白）的激活，并可激活 NDR1 和 EDS1 等基因［7］；
同时，NDR1 和 EDS1 基因的激活也受外源性 auxin
基因的反向调控［8］。然而，由于 HrBP 结构和功能
研究进展缓慢，关于 HrBP 具体的激活机制的较少
有报道。目前，仅见 Lee 等［6］推测 HrBP 与 harpin
的相互作用后可通过两种方式激活下游MAPK通路。
由于 HrBP 是一个膜蛋白，结构相对复杂，其纯化
和结构鉴定相对困难。本研究拟从 HrBP 的结构预
测出发，对其空间结构进行预测分析，并在核酸和
蛋白质水平上进行 HrBP 的含量检测方法的研究和
检测方法的建立。首先根据 GenBank 报道的 HrBP
序列进行序列同源性、二级结构、跨膜结构和空间
结构的预测分析，获得可能存在的空间结构模式 ；
此外，采用基因表达方法进行 HrBP mRNA 提取、
逆转录和 Real-time PCR 方法的研究，采用生物信息
学方法获得烟草 HrBP 序列特异性多肽，采用 9-氟
甲氧羰基固相合成法获得目的多肽，采用碳化二亚
胺法偶联获得 Pep-KLH，并由此制备 HrBP 的多克
隆抗体，并通过 Indirect-ELISA、Western blotting 方
法进行了抗原特异性鉴定，利用间接 -斑点免疫试
验（indirect dot-immunobinding assay，indirect-DIBA）
和 Western blotting 方法对各种植物叶片标本进行检
测，旨在为进一步研究 HrBP 在抗病免疫剂筛选及
抗病育种方面工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
普通烟 K326 （Nicotiana tabacum）由中国农业
科学院烟草研究所种质遗传室提供。健康新西兰雄
性大白兔 （2.5 kg），购自吉林省生物制品所。RNA
isolation kit、Prime Script® One Step RT-PCR Kit Ver.
2 （DRR055A）、DNA 分 子 量 Marker 为 QDL 2000
Quantitative DNA Marker 和 琼 脂 糖 粉 均 购 自 大 连
宝生物公司。完全弗氏佐剂（Complete Freund’s
adjuvant，CFA） 和 不 完 全 弗 氏 佐 剂 （Incomplete
Freund’s adjuvant，IFA）购自北京鼎国生物公司。
HRP-标记羊抗兔 IgG 抗体购自 Santa Cruz 公司。AP-
标记羊抗兔 IgG 抗体购自武汉博士德生物工程有限
公司，ECL 化学发光试剂盒 （ECL plus）购自碧云天
公司，NBT 和 BCIP 试剂购于北京索莱宝科技有限公
司。NC 膜，（0.22 μm）购于美国 PALL 公司，PVDF
膜 （0.22 μm）购于美国 Millepore 公司。其它试剂均
为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 HrBP 蛋白同源性分析 （1）登录 http：//www.
ncbi.nlm.nih.Gov，获得烟草 （Nicotiana tabacum）、拟
南芥 （Arabidopsis thaliana）、野花 （Arachis diogoi）、棉
花 （Gossypium hirsutum）、大麦 （Hordeum vulgare subsp.
Vulgare）、 蒺 藜 苜 蓿 （Medicago truncatula）、 水 稻
（Oryza sativa indica）、番茄 （Solanum lycopersicum）、
小麦 （Triticum aestivum）和葡萄 （Vitis sp. NL-2003）
的 HrBP 的序列及其 FASTA 格式文件 ；（2） 采用
Clustal X2 软件对 HrBP 进行多序列比对，对多序列
比对结果贮存为 aln 格式文件 ；（3） 采用 ESPript 在
线软件进行序列着色（http ：//espript.ibcp.fr/ESPript/
cgi-bin/ESPript.cgi）；（4） 采用 BLAST 在线软件，输
入烟草 HrBP 蛋白质多肽序列，进行多序列比对。
1.2.2 HrBP 蛋白的结构预测 采用 PSIPRED Protein
Structure Prediction 在线服务器（http ：//bioinf.cs.ucl.
ac.uk/psipred/）进行烟草 HrBP 二级结构预测，在
PSIPRED Protein Structure Prediction 主页，输入 HrBP
2012年第9期 61陈卓等 ：烟草 HrBP 的研究与应用
蛋白质的氨基酸序列，进行在线预测。采用 UCL
Department of Computer Science 进行 HrBP 跨膜结构
预测。采用 SWISS-MODEL 服务器（http ：//swissmod
el.expasy.org/）进行蛋白质同源模建，采用 Phyre 在
线 分 析 软 件（http ：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/），
通过轮廓匹配以及二级结构寻找三维结构类似蛋白
的方法，将 HrBP 的氨基酸序列提交至 Phyre，预测
HrBP 蛋白结构。此外，采用 CPHmodels-3.0 Server
（http：//www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/），通过神
经网络同源模建方法进行 HrBP 的模建。
1.2.3 烟草 HrBP 基因表达与克隆 采集烟草叶片
组织，参照 RNA Trizol 提取方法进行（http ：//zh.inv
itrogen.com/）提取烟草总 RNA，将总 RNA 溶解在
RNase-free 水中，在 260、280 和 320 nm 处测定吸收
值（OD），计算总 RNA 纯度和浓度，并定量至
100 ng/μL，采用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳判断总 RNA
的完整性。使用 TaKaRa PrimeScriptTM 试剂盒，按照
操作说明（http ：//www.takara.com.cn/）进行反转录。
反应体系 ：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μL，PrimeScri-
ptTM RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer （50 μmol/
L） 0.5 μL，Random 6 mers （100 μmol/L） 0.5 μL， 加
RNase free 水至 10 μL。反应条件 ：37℃ 15 min，
85℃ 5 s，保存于 -20℃。取合成的 cDNA 为模板进
行 PCR 扩增，PCR 扩增反应体系为 25 μL，其中含
10×PCR 缓冲液 2.5 μL、MgCl2 （25 mmol/L） 2.0 μL、
dNTP （10 mmol/L） 2.5 μL、上下游引物 （100 μmol/L）
各 1.5 μL、模板 DNA 1 μL、Taq DNA 酶 （2 U/μL） 0.5
μL。PCR 反应程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃ 40 s，
58℃ 40 s，72℃ 40 s，30 个循环 ；72℃延伸 7 min。
2% 琼脂糖凝胶电泳，鉴定引物的特异性。根据 NCBI
GenBank 报道 HrBP 的 AY383625 序列，采用 Primer 5
软件设计引物，引物序列分别为 ：left primer 5-aattt-
gccagtcgggtattg-3； right primer 5-caatttccacctcccttga-
a-3，扩增产物分子量大小为 247 bp。
1.2.4 HrBP 基因在烟草组织差异表达 提取烟草
下位叶、上位叶、茎部和根部组织总 RNA，采用
TaKaRa SYBR® Premix Ex TaqTM （Perfect Real-time）
试剂以及提供方法（http ：//www.takara.com.cn/）进
行烟草组织 HrBP 基因扩增，将以 10 倍梯度稀释的
cDNA 作为模板进行扩增，进行标准曲线制作和熔
链曲线分析。
1.2.5 烟草 HrBP 多克隆抗体制备 登录 http ：//
www.ncbi.nlm.nih.Gov，采用 ProtScale 程序对 HrBP 抗
原指数进行分析，并由此设计含 15-18 个目的多肽，
采用 9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成多肽［9］，
多肽裂解后经高效液相色谱法（high performance
liquid chromatography，HPLC）进行纯化和纯度分
析。HPLC 色谱柱为 4.6×250 mm （VYDAC-C18 柱），
溶剂 A 和 B 分别为含 0.1% 三氟醋酸的乙腈溶液和
0.1% 三氟醋酸的水溶液。流速为 1.0 mL/min，检测
波长为 220 nm，上样量为 20 μL。采用碳化二亚胺
法（EDCI）将纯化多肽与 KLH 用进行缩合反应，得
到 Pep-KLH 复合物［10］。根据抗体生成规律，取 250
μL（约 250 μg）纯化多肽抗原液，并与等体积 CFA
混合，充分乳化后，采用背部多点注射法免疫新西
兰大白兔。2 周后取多肽抗原液加等体积 IFA，采用
上述方法进行加强免疫，免疫抗原量约 200 μg，以
后每两周免疫一次，每次免疫抗原量约 100 μg，全
程共免疫 5 次，在末次免疫 5-7 d 后，通过家兔耳
缘静脉取血进行效价检测，待效价达理想值后，采
用颈动脉放血，收集家兔血清［11］。采用饱和硫酸铵
沉淀法初步纯化兔血清，采用 HPLC 进行多肽纯度
分析［11］。收集兔抗血清，并经过离心和微滤后，采
用 HiTrap Protein A 亲和层析柱进行多克隆抗体的纯
化。将 5.0 mL 的 HiTrap Protein A 亲和层析预装柱，
与 AKTA explorer 系统相连接，用 0.1 mol/L Tris-HCl
Buffer （含 0.15 mol/L NaCl，pH7.5）充分洗涤平衡后
上样，以相同 buffer 洗去未结合的杂蛋白质后，用 0.1
mol/L Gly-HCl Buffer（含0.15 mol/L NaCl，pH2.8）洗脱，
收集洗脱峰，并用 pH7.5 Buffer 中和后，冻干备用，
采用 SDS-PAGE 分析多抗的纯度［12］。将人工合成裸
肽作为抗原，包被浓度设为 2 μg/mL，包被量为 100
μL/ 孔，4℃包被过夜 ；封闭体系含有 2% BSA 的
PBS-T Buffer，200 μL / 孔，37℃封闭 1-2 h；采用含 2%
BSA PBS-T Buffer 稀释抗血清，抗血清稀释比分别为
1 1 000、1 8 000、1 16 000、1 32 000，以 1 200
稀释的正常兔血清作为阴性对照，37℃孵育 1-2 h ；
二抗采用 HRP-标记羊抗兔二抗，工作浓度为
1 10 000，100 μL/ 孔 ；37℃孵育 1-2 h ；以上每步
结束后都是用 PBST 洗 3-5 遍 ；最终采用 TMB 显色
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期62
系统进行显色，酶标仪读取 450 nm 波长处的 OD 值，
当效价达 1 8 000 后，采兔血清，并纯化抗血清获
得多克隆抗体。
1.2.6 Western blotting 分析对烟草 HrBP 的特异性
采集普通烟叶片，采用打孔器采集样品，称重后
经液氮固定后保存于 -80℃冰箱。烟草样品经液氮
研磨成粉后，按质量体积比 1 10 加入碳酸盐包被
Buffer，研磨匀浆后转移至 1.5 mL EPP 管中，4℃
条件下，采用 12 000 g 条件下，离心 15 min，获得
蛋白上清液。采用 Bio-Rad 蛋白定量试剂对上清液
进行定量和稀释，-80℃保存备用。采用 12% SDS-
PAGE 电泳分离烟草蛋白上清液，采用湿转移方式
将蛋白转移至 PVDF 膜，转移条件为 90 mA 恒流，
转移时间 1.5 h。封闭液采用含 TBS-T Buffer（含 5%
脱脂牛奶），室温条件下，采用 TBS-T Buffer（含 0.1%
Tween-20）洗涤 3 次，每次 3-5 min。抗血清样本
A 和样本 B 按照 1 750，多克隆抗体的稀释比按照
1 1 500，4℃封闭过夜。采用 1 3 000 稀释比稀释
HRP-标记羊抗兔抗体，室温孵育 1 h，ECL plus 试
剂常规感光胶片显影至条带显示完全终止反应［13］。
1.2.7 采用 DIBA 和 Western blotting 检测常见植物
的 HrBP 参照 Hawkes 报道 DIBA 方法，略作如下
修改［14］，采集玉米、水稻、甘蓝、苋色藜、烟草和
萝卜的叶片，液氮研磨成粉后，在 1 5 的稀释比的
Tris-HCl 蛋白提取 Buffer 中继续匀浆，研磨 10 min，
无可见沉淀和颗粒，将研磨液转移至 1.5 mL EPP 管
中，4℃条件下，11 440 r/min 离心 5 min，将上清转
移至另一支 1.5 mL EPP 管中，采用考马斯亮蓝法进
行各种植物提取液中总蛋白的定量。取定量后的 5
μL 上清液，采用微量移液器加在 NC 膜上，室温条
件下，待 NC 膜自然干燥，采用 TBS-T Buffer（含 5%
脱脂牛奶）在 37℃条件下封闭 30 min，倒掉 TBS-T
Buffer（含 5% 脱脂牛奶），加入 1 1 500 的一抗溶液
［采用 TBS-T Buffer（含 5% 脱脂牛奶）稀释］，37℃
孵育 60 min，TBS-T Buffer 洗涤 3 次，每次 3 min，
加入 AP 标记的羊抗兔二抗溶液采用 TBS-T Buffer
（含 5% 脱脂牛奶）稀释，按照 1 30 000 稀释比，
37℃孵育 40 min，TBS-T Buffer 洗涤 3 次，每次 3
min，加入底物显色 Buffer，平衡 3 min，在 10 mL 的
底物显色 Buffer 加入 15 μL NBT（50 mg/mL）和 25
μL BCIP（50 mg/mL）溶液，至显色清晰，终止染色。
试验设阳性对照和阴性对照，显色时间控制在阳性
对照出斑，而阴性对照不显斑，即停止显色。同时，
对于这些植物样品，采用 1.2.6 报道方法进行 HrBP
的 Western blotting 分析。
1.2.8 统计学分析 所有数据采用 SPSS 11.5 软件
进行分析，采用 One-Way ONOVA 方法进行任意两
组间的差异性分析检验，所有数据首先采用方差
齐性分析（Test of Homogeneity of Variances）检验，
P>0.05，采用 LSD 方法进行方差分析 ；P<0.05，采
用 Dunnett T3 方法进行方差分析，数据采用 Origin 8.0
和 Excel 2010 作图。
2 结果
2.1 HrBP蛋白同源性分析
通过登录 http ：//www.ncbi.nlm.nih.Gov，获得烟
草等 10 种植物 HrBP 或 HrBP 蛋白的 FASTA 文件，
通过 Clustal X2 多序列比对发现 HrBP 或 HrBP 蛋白
序列非常结构保守，集中在第 80-274 个氨基酸这
一区间，而序列变异区主要集中在前 80 个氨基酸
的范围内（图 1）。通过 BLAST 进行序列比对，发
现与其它植物物种相比，除与蒺藜苜蓿（Medicago
truncatula）序列同源性（Max ident）为 67%，与其
它物种间的序列同源性均在 70% 以上 ；此外，分析
发现烟草 HrBP 与多种植物的 plastid-lipid-associated
protein 有较高的序列相似度（比对结果未显示）。
2.2 HrBP空间结构预测
采用 PSIPRED Protein Structure Prediction 在线服
务器进行烟草 HrBP 二级结构预测，α-螺旋位于第
70-89 个氨基酸和第 96-115 个氨基酸区间内（图 2-
A）。同时，采用 UCL Department of Computer Science
进行跨膜结构预测，在第 1 种跨膜方式中，N 端在
胞外，C 端位于胞内，N 端含有 40 个氨基酸构成的
信号肽（图 2-C）；第 2 种跨膜方式，C端位于胞外，
N端位于胞内（图 2-D）。
采用 SWISS-MODEL 服务器对烟草 HrBP 空间
结构进行在线分析，结果发现，PDB 数据库中无
同源模板可借鉴，无法进行同源模建（结果未显
示）；登录 Phyre 网站，提交烟草 HrBP 氨基酸序列
至 Phyre，共有 10 个蛋白质参与进行模建，根据比
2012年第9期 63陈卓等 ：烟草 HrBP 的研究与应用
对结果，选取 Estimated Precision 和 ID 值较高，且
具有对应 PDB 数据的蛋白，进行 HrBP 空间结构预
测分析。将 HrBP 与 ferripyoverdine receptor （chain A）
比对分析，其 SCOP Code （i.d. 值）为 5%、E-value
为 35、Estimated Precision 为 5%，由 ferripyoverdine
receptor （chain A）建模得到蛋白质空间结构（图
3-A），ferripyoverdine receptor （chain A） 蛋 白 质 单
体结构图未显示，其MMDB ID：60123和PDB ID：2O5P
（可登录 NCBI 数据库进行检索）；将 HrBP 与 fe（iii）-
pyochelin receptor （chain A）比对分析，其 SCOP Code
（i.d. 值）为 5%、E-value 为 36、Estimated Precision
为 5%，由 fe（iii）-pyochelin receptor （chain A）建模
得到 HrBP 蛋白质结构（图 3-B），其中 fe（iii）-
pyochelin receptor （chain A）蛋白质单体结构图未显
示，其 MMDB ID：35045 和 PDB ID：1XKW；将 HrBP
与 β-glucuronidase （chain B）比对分析，其 SCOP Code
（i.d. 值）为 4%、E-value 为 38、Estimated Precision
为 0%，由 β-glucuronidase （chain B）建模得到 HrBP
蛋白质结构（图 3-C），其 MMDB ID ：6432 和 PDB
ID ：1BHG。通过 Phyre 预测发现 NCBI 数据库中与
第 1 行 gi 号 . 烟草的 HrBP ；第 2-9 行 . 分别对应拟南芥、野花、棉花、大麦、蒺藜苜蓿、水稻、番茄、小麦和葡萄的 HrBP
图 1 十种植物 HrBP的多序列比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期64
烟草 HrBP 匹配的蛋白质中有 5 个与膜蛋白有关，
Estimated Precision 值和 ID 值均较低，通过模建后
获得的结构与图 3-A 和图 3-B 相似，而通过蛋白
酶——β-glucuronidase （chain B）模建的蛋白质单体
图 2 烟草 HrBP二级结构及其跨膜结构预测
A ：HrBP 二级结构预测 ； B ：HrBP 的穿膜结构预测，图中 Signal Peptide 为信号肽 ；Cytoplasmic 为细胞质内 ；Extracellular
为细胞外 ；Re-entrant Helix 为凹角螺旋 ；Transmembrane Helix 为穿膜螺旋 ；C 和 D. HrBP 两种穿膜的结构
A. 由 Full Length Ferric Pyoverdine Outer Membrane Receptor 模建的 HrBP 单体结构 ； B. 由 fe（iii）-pyochelin receptor 模建的 HrBP
单体结构 ； C. 由 β-glucuronidase （chain B） 模建的 HrBP 单体结构
图 3 采用 Phyre模建得到烟草 HrBP单体结构
结构与膜蛋白的模建结果差异却较大。此外，采用
CPHmodels 的神经网络同源模建方法进行模建，结
果（图 4）表明其结构与图 3-A 和图 3-B 相似。
2.3 烟草HrBP基因的表达
提取烟草总 RNA，逆转录获得 cDNA，以 cDNA
为模板进行 PCR 扩增，2% 琼脂糖凝胶电泳，结果
显示在 100-250 bp 之间出现 1 条特异性条带（图 图 4 采用 CPH模式模建的 HrBP的空间结构
5-A），未出现非特异性条带及引物二聚体，显示引
2012年第9期 65陈卓等 ：烟草 HrBP 的研究与应用
A. 烟草 HrBP 基因的 PCR 产物 ； B. 烟草 HrBP 基因荧光定量 PCR 的标准曲线，数据采用 Origin 8.0 软件作图 ； C. 烟草 HrBP 荧光定量 PCR 的熔链曲线
物特异性以及扩增体系良好。将以 10 倍梯度稀释
的 cDNA 作为模板，以优化后的反应条件进行荧光
定量 PCR 扩增，结果显示标准曲线线性关系良好，
HrBP 基因标准曲线的 R2 值均超过 0.999 6（图 5-B），
熔链曲线显示为单峰，提示表明引物特异性良好（图
5-C）。
2.4 制备HrBP多克隆抗体
根据 NCBI 中登录的 HrBP 信息（AY383625.1，
LOCUS：AY383625），采用 Protean 等软件进行 HrBP
的抗原指数分析（结果未显示），分析发现 HrBP 中
3 段多肽序列在烟草中具有良好的特异性，其多肽序
列为：（1）C-PLSNNHCSSSLPSLT；（2）C-RIPDQLRP-
PSNTGSGE ；（3）C-TYIDSDTRVTRGDRGELR。试验
采用 9-氟甲氧羰基固相合成法对序列 -3 进行多肽合
成，对所获得的多肽采用 HPLC 进行纯度分析，试
验发现共有 5 个成分峰，其中一个主要成分峰的含
量为 85.16%，其它 4 个成分峰的总浓度为 14.84%
（图 6 和表 1）；同时，采用 LC-MS 质谱对主要成分多
肽进行分子量鉴定，试验发现其分子量为 2 213.42，
与预测分子量吻合度较好（图 7），提示目的多
肽可达到抗体制备试验的要求，可用作目的免疫原。
对免疫原制备获得的抗血清和多克隆抗体，采
用 Indirect-ELISA 方法，对 2 个样本抗血清进行特
异性检测，试验发现在 1 32 000 的条件下，样本 A
和 B 的两个重复抗血清的 OD 值为分别为 0.926 和
1.009。对样本 B（抗血清）进一步纯化，获得多克
隆抗体（样本 C），并进行效价检测，试验发现稀
释比在 1 128 000 条件下，其 OD 值为 1.025（效
价图未显示）。试验对普通烟 K-326 叶片中总蛋白进
行 SDS-PAGE，采用抗血清和多克隆抗体对普通烟
HrBP 进行特异性检测（图 8）（抗血清的 Western
blotting结果未显示），试验发现多克隆抗体特异性好，
不存在非特异性产物。
鉴于 HrBP 蛋白序列的序列保守性，试验采用
DIBA 和 Western blotting 方法检测 HrBP 多克隆抗体
对常见几种植物的识别特性，试验发现各个植物蛋
白提取液处理均呈现紫色斑点，显示出 HrBP 对各
种供试植物均有识别能力（图 8）。此外，我们也采
图 5 烟草 HrBP基因的表达
试验发现共有 5 个成分峰，其保留时间分别是 7.85、8.087、8.374、8.639、8.893
min，它们对应的浓度分别为 0.639%、2.7%、85.16%、8.799%、2.704%.
图 6 HPLC测定 HrBP纯度
表 1 HPLC测定 HrBP的纯度
编号 时间（min）样品浓度（%）峰面积（相对值）峰高度（相对值）
1 7.85 0.6393 35678 4550
2 8.087 2.7 150678 24386
3 8.374 85.16 4752634 457295
4 8.639 8.799 491052 89537
5 8.893 2.704 150904 14009
合计 100 　 5580946 589777
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期66
采用 Indirect-ELISA 和 Real-time PCR 方法研究
HrBP 在烟草叶片、茎部和根部组织的差异表达。
Indirect-ELISA 试验表明，烟草上位叶 HrBP 表达含
量相对最高，根部组织 HrBP 表达含量相对较低（图
10）。此外，试验提取了烟草上位叶、下位叶、茎部
和根部组织的总 RNA，并定量和反转录获得 cDNA，
进一步采用 Real-time PCR 方法获得相似的结果（基
因表达图未显示）。
用了 Western blotting 方法对各种植物的 HrBP 进行
了检测，试验结果与 DIBA 结果基本一致（结果图
1-4. 普通烟 K-326 叶片提取总蛋白样品
图 8 Western blotting检测 HrBP特异性
图 7 通过 LC-MS质谱测定 HrBP多肽分子量
1-7. 分别代表玉米、水稻、甘蓝、萝卜、苋色藜、烟草、
碳酸盐 Buffer 处理 ； A，B. 2 个重复试验
图 9 DIBA检测 HRBP对常见植物的识别特性
未显示）。
2.5 HrBP在烟草各组织中的差异表达
HrBP 数值由吸收值的均值 ± 标准差（Means±SD）表示，差异性分析
在 P=0.05 的条件下进行检验。图中小写字母不同表示两处理间有差异显
著性，小写字母相同表示两处理间无差异显著性
图 10 Indirect-ELISA法表达分析烟草各种组织中的HrBP
3 讨论
HrBP 是一种位于植物细胞壁的重要受体蛋白，
尽管此蛋白有 20 余年的时间［1］，但目前关于它的
2012年第9期 67陈卓等 ：烟草 HrBP 的研究与应用
研究报道却相对较少。1992 年，Wei 等［1］发现梨
火疫病细菌（Erwinia amylovora）的分泌蛋白——
harpin 可作用于植物细胞壁的 HrBP 受体，并产生
免疫激活作用，植物表现出抗病活性。因此，关于
HrBP 的研究备受大家的关注，并普遍认为 HrBP 是
植物重要的受体蛋白，在作物保护中具有重要的研
究价值。例如，采用生物工程技术制备 harpin，并
喷施在烟草和辣椒上，可使烟草和辣椒产生抗 TMV
活性［15］；利用生物农药——康壮素（有效成分 ：
harpin）喷施作物，具有抗病毒、抗菌、提高植物抗
病能力以及调控植物生长和增产的作用［15，16］。同时，
研究表明，HrBP 也位于 SA 信号通路的上游，可调
控下游关键分子，如 ：EDS、SA、NPR 和 PR 的表
达。本试验前期针对 EDS、SA、NPR 和 PR 等进行
了抗体开发和应用检测技术的研究，并用来指导新
农药的创制［17-19］。但由于 HrBP 属膜蛋白，它不溶
于水，分离纯化困难，晶体不易生长，因此，其结
构很难确定。目前，HrBP 的研究工作相对其它类型
蛋白的研究进展显得相对缓慢。当前，对于膜蛋白
研究往往采用生物信息学进行结构预测，采用分子
生物学的方法进行间接研究，本研究采用 BLAST 软
件对目前 NCBI 中报道的 HrBP 进行在线比对，同
时，也采用 Clustal X2 进行主要植物 HrBP 序列的比
对，发现该蛋白序列相对保守 ；同时，序列保守区
主要集中在 80-274 个氨基酸区段内，因此，根据
BLAST 和 Clustal X2 的结果预测各种植物 HrBP 空间
结构具有一定的相似性，这一预测通过 DIBA 和
Western blotting 检测各种常见植物 HrBP 得到了进一
步的证实（图 9）。因此，本研究中序列同源性分析
为进一步研究HrBP空间结构奠定基础。既往研究中，
Lee［6］ 提出了多种 HrBP 与配体相互结合的机制，但
由于受HrBP空间结构不清楚的限制，也仅作了推测。
为此，我们采用 PSIPRED Protein Structure Prediction
在线计算方式进行烟草 HrBP 二级结构预测，通
过图 2 与图 1 结果比较，发现 HrBP α-螺旋位于第
70-89 位氨基酸和第 96-115 位氨基酸，第 193-204
位氨基酸之间的 β-折叠的序列比较保守，通过 UCL
Department of Computer Science 进行跨膜预测，发现
两种可能的膜蛋白跨膜方式。同时，采用 SWISS-
MODEL、Phyre 和 CPHmodels 三种方法进行空间结
构模拟，SWISS-MODEL 是基于网络的同源建模工
具［19］，由于 SWISS-MODEL 没有检索到相似结构的
蛋白晶体模板，无法获得 HrBP 的模拟结构 ；Phyre
与 SWISS-MODEL 方法不同，它是采用穿线法原理
进行蛋白质模建，它可在数据库中搜寻和待测蛋白
结构较匹配的模板蛋白质，其中模板蛋白质和待测
蛋白质明显的序列相似性并不是必要条件，穿线法
可以检测到数据库中与 HrBP 亲缘关系很远的蛋白
质，我们以其中两种膜蛋白和一种酶作为模板蛋白，
发现通过两种结构和生物活性完全不同的膜蛋白均
能获得相似的空间结构，并且与酶作为模板蛋白所
获得的结构完全不同［20］。对这一特征，我们也利用
神经网络进行蛋白质同源模建，CPHmodels 是以预
测距离为基础的串线（threading）算法，利用折叠
识别预测蛋白质结构的方法，进行 HrBP 的预测蛋
白质（图 3，图 4）［21］，尽管采用模板与 Phyre 所采
用的模板不同，但其结果与 Phyre 有一定的相似性。
针对 HrBP 结构预测结果，本研究中，基于 mRNA
和蛋白质两种水平，我们采用分子生物学方法进行
其表达研究。结果显示，HrBP 的 Real-time PCR 的
相关系数（R2）在 0.999 6（图 5），基因定量表达显
示 HrBP 基因在叶片中含量较高，在根和茎部含量
较低 ；同时，采用 Western blotting 也获得了相似的
结果（图 10），表明本研究所建立检测 HrBP mRNA
和蛋白质的方法是可靠的。HrBP 是植物体重要的膜
蛋白，对于调控植物产生抗逆、抗病均有重要的生
理学意义［1］，将该蛋白应用于植物保护的研究还产
生了重大的社会价值 ［15，16］。但由于 HrBP 结构和功
能复杂，深入研究结构、功能、它与配体的结合模
式以及激活状态下对下游的调控机制，这些工作将
有助于生物农药的创制和抗病品种的选育。
4 结论
本研究采用生物信息学发现 HrBP 序列异常保
守，保守区域主要集中在第 80-274 个氨基酸区段内；
采用 PSIPRED Protein Structure Prediction 进行 HrBP
二级结构预测，发现 HrBP α-螺旋位于第 70-89 个
氨基酸和第 96-115 个氨基酸，第 193-204 个氨基
酸之间的 β-折叠的序列比较保守 ；采用 Phyre 和
CPHmodels 进行 HrBP 模建，发现 HrBP 空间结构与
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期68
多个膜蛋白的结构相似，与酶的空间结构完全不同；
采用 Real-time PCR 和多肽抗体制备技术获得检测
HrBP 核酸和蛋白质的方法，并进行了烟草各种组织
HrBP 差异表达的研究，发现其在叶片组织的表达含
量较高。
参 考 文 献
［1］ Wei ZM, Laby RJ, Zumoff CH, et al. Harpin, elicitor of the hypersen-
sitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.
Science, 1992, 257 ：85-88.
［2］ Alonso JM, Hirayama T, Roman G, et al. EIN2, a bifunctional tran-
sducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 1999,
284 ：2148-2152.
［3］ Wang KL, Li H, Ecker JR. Ethylene biosynthesis and signaling
networks. Plant Cell, 2002, 14 ：S131-S151.
［4］ Camehl I, Sherameti I, Venus Y, et al. Ethylene signalling and ethy-
lene-targeted transcription factors are required to balance beneficial
and nonbeneficial traits in the symbiosis between the endophytic
fungus Piriformospora indica and Arabidopsis thaliana. New Phytol,
2010, 185 ：1062-1073.
［5］ Liu FQ, Liu HX, Jia Q, et al. The internal glycine-rich motif and
cysteine suppress several effects of the HpaGXooc protein in plants.
Bacteriology, 2006, 96（10）：1052-1059.
［6］ Lee J, Klessig DF, Nürnberger T. A harpin binding site in tobacco
plasma membranes mediates activation of the pathogenesis-related
gene HIN1 independent of extracellular calcium but dependent on
mitogen-activated protein kinase activity. The Plant Cell, 2001, 13 ：
1079-1093.
［7］ Peng JL, Dong HS, Dong HP, et al. Harpin-elicited hypersensitive
cell death and pathogen resistance require the NDR1 and EDS1
genes. Physiol Mol Plant Pathol, 2003, 62 ：317-326.
［8］ Gopalan S. Reversal of an immunity associated plant cell death
program by the growth regulator auxin. BMC Research Notes, 2008,
1（126）：1-5.
［9］ Howard GC, Kaser MR, eds. Making and using antibodies［M］ .
Beijing ：Science Press, 2010 ：5-48.
［10］ 符友伟 , 吴蕾 . 多肽固相合成法中的 3 个关键点 . 化学工业与
工程 , 2010, 27（4）：370-375.
［11］ Cooper SM, Sambray Y, Frious GJ. Isolation of separate Fc receptors
for IgG complexed to antigen and native IgG from a murine leukae-
mia. Nature, 1977, 270 ：253-255.
［12］ Zhao YF. Technique principle and application of biochemistry
［M］. Beijing ：Science Press, 2002 ：429-430.
［13］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. In Molecular Cloning：A Labo-
ratory Manual［M］. Plainview, NY ：Cold Spring Harbor Lab
Press, 1989.
［14］ Hawkes R, Niday E, Gordon J. A dot-immunobinding assay for mon-
oclonal and other antibodies. Anal Biochem, 1982, 119 ：142-147.
［15］ 徐进平 , 孟小林 , 王健 , 等 . Harpin 的表达及其诱导抗烟草花
叶病毒感染的活性 . 中国病毒学 , 2003, 18 ：607-610.
［16］ 刘勇 , 布云虹 , 李凤芝 , 等 . 超敏蛋白对烟苗 TMV 抗性和生长
的影响 . 现代农药 , 2008, 3 ：14-16.
［17］ 陈卓 , 刘开兴 , 于丹丹 , 等 . EDS1 多肽抗体的制备和应用 . 中
国农学通报 , 2011, 27（30）：164-170.
［18］ 陈卓 , 刘家驹 , 毕亮 , 等 . NPR1 多肽抗体的制备和应用 . 生物
技术通报 , 2012（1）：145-150.
［19］ Bordoli L, Kiefer F, Arnold K, et al. Protein structure homology
modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols, 2009,
4（1）：1-13.
［20］ Kelley LA, Sternberg MJ. Protein structure prediction on the Web ：
a case study using the Phyre server. Nature Protocols, 2009, 4 （3）：
363-371.
［21］ Manobala J, Jannet Vennila J, Singh S. Comparatvie protein mode-
ling of metallothionein 1B protein acting as a potential chemopro-
tector against hepatic neoplasia. Int J Appl Bio Pharm Tech, 2010,
1（3）：1092-1097.
（责任编辑 狄艳红）