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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-09-05
基金项目 : 河北省自然科学基金项目（C2008000171）
作者简介 : 范继业 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 细胞生物学 ; E-mail: fjyuser@126.com
通讯作者 : 张静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物医药
亲环素 AtCYP1 RNA干涉载体的构建及对
拟南芥发育的影响
范继业 张静 翟少华 武明明 张滨
（河北化工医药职业技术学院，石家庄 050026）
摘 要： 根据拟南芥 AtCYP1基因序列设计特异引物，以拟南芥总 DNA为模板，扩增 AtCYP1基因中 344 bp转录本，插入
表达载体 PTCK303，构建目的基因 RNA干扰载体 Ubi::AtCYP1i。利用改良的农杆菌浸染技术获得拟南芥 RNAi转基因株系，RT-
PCR分析结果表明转基因株系中 AtCYP1基因的表达量低于野生型，表型观察结果表明 RNAi转基因纯合株系抽苔时间比野生型晚
3.32 d，抽苔叶片数较野生型多 2.49片，其开花时间、结出第一个种荚的时间、株高等方面也与野生型存在明显差异。此结果说
明 AtCYP1可能参与了拟南芥的早花发育过程，为进一步研究其在植物生长发育中的功能奠定了基础。
关键词： AtCYP1 RNA干扰 PTCK303 早花
Vector Construction of Ubi::AtCYP1i and Functional Analysis of
CYP1 in Arabidopsis thaliana
Fan Jiye Zhang Jing Zhai Shaohua Wu Mingming Zhang Bin
（Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College，Shijiazhuang 050026）
Abstract: According to gene sequence of Arabidopsis AtCYP1, specific primers designed and Arabidopsis genomic DNA as template,
the 344 bp AtCYP1 gene transcripts was amplified and transformed into the expression vector PTCK303, to build the target gene RNAi vector
Ubi::AtCYP1i. Using RNAi transgenic Arabidopsis lines, RT-PCR analysis showed that transgenic expression of genes in AtCYP1 lower than
wild-type. Phenotype observed results showed that RNAi transgenic homozygous lines bolting time 3.32 days later than wild-type, bolting a few
more leaves than wild-type 2.49. Its flowering time, seed pod bear the first time, plant height, it is also obvious differences between the wild type.
This result showed AtCYP1 may be involved in early Arabidopsis flower development process.
Key words: AtCYP1 RNAi PTCK303 Early flowering
亲环素（cyclophilins，CyPs）是一类胞浆蛋白，
Handschum acher 等在 1984 年首先从哺乳动物环孢
素 A（cyclosporin A，CsA）的细胞受体中发现了亲
环素［1］。亲环素具有肽脯氨酰顺反异构酶（peptidyl
prolyl cis-trans isomerase，PPIase）的活性［2］，是蛋
白质折叠的限速步骤，催化蛋白质折叠过程，并起
着分子伴侣作用［2-5］，CyPs 能与 CsA 结合，通过阻
断 T 细胞信号传递而实现免疫抑制［6］。Takeshi 等
1999 年分离出 AtCYP1 基因，分析了其表达模式，
确定了 AtCYP1 主要分布在脉管分布的组织和花
中［7］。还有研究通过半定量 RT-PCR 的方法证实了
AtCYP1 在各个组织中普遍表达［8］，据我们目前所知
对于 AtCYP1 的生物学功能研究鲜有报道。
本研究主要设计从反向遗传学入手，通过研
究转基因 RNAi 株系，观察 AtCYP1 基因在拟南芥
体中缺失转录本后与野生型相比是否有一些表型
上的差异，分析 AtCYP1 在拟南芥发育中的生物学
功能。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期86
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 拟南芥（Arabidopsis thaliana）生
态型（ecotype）是 Columbia（Col），由本室保存。
1.1.2 质粒和菌种 PTCK303 质粒；质粒的转化宿主
E.coli DH5α ；拟南芥遗传转化用根癌农杆菌（Agro-
bacterium tumefaciens）GV3101 均由本实验室保存。
1.1.3 试剂 RNArose 购自上海华舜生物工程有限
工司 ；T4 DNA 连接酶、dNTP、Taq 酶及两步法 RT-
PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ；限制性内切酶购自
Promega 公司 ；其它生化试剂均为进口分装或国产分
析纯。
1.2 方法
1.2.1 Ubi::AtCYP1i 表达载体的构建 将 AtCYP1 的
cDNA 提交至 NCBI 数据库（GenBank 登录号 At4g
34870），进行同源序列比对（http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/blast/Blast.cgi），为了形成有效干涉，选取了 At-
CYP1 的 3非编码区中 344 bp 的特异序列 （图 1，图
2）作为 RNAi 的目的片段。
图 1 AtCYP1基因结构示意图
利用 Omiga 软件设计引物时，在上下游分别引
入 BamHI、KpnI、SpeI、SacI 限制性酶切位点，上
述引物由上海生工公司合成 ：
F: 5-GGGGTACCACTAGTATCTGAGTGAGAAA
GTGAGAGAC-3（单下划线为 Kpn I 酶切位点，双下
划线为 Sep I 酶切位点），
R: 5-CGGGATCCGAGCTCTCATCTCCTCAAAAA
GATTGTATT-3（单下划线为 BamH I 酶切位点，双
下划线为 Sac I 酶切位点）。
1.2.2 Ubi::AtCYP1i 表达载体的构建 提取拟南芥总
RNA，RT-PCR 扩增目的基因中 344 bp 的转录本，
反应程序 ：94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃
1 min；23 个循环。扩增产物电泳胶回收，连 T 载体，
转化 E.coli DH5α，白色菌斑筛阳性克隆，提质粒，
酶切，电泳检测，选正确全长测序 ；测序正确之后
图 3 Ubi::AtCYP1i的构建
图 2 3非编码区序列
ATCTGAGTGAGAAAGTGAGAGACTTTGATCTTTATG
AGTAATAATGGTGTCTTTTGCTTTCGGTTGTTCTTCC
TCTTACCTTAATGGATTATTCTGTTTAGGGTTTGAGT
TTTCGTTTCAGAGTTTGTAACAAAACCCTTTTGTGTT
TTCTGGGGTTTGAAATAATTATGAGCTTACCCAATT
GCTTCTTTGTGTTTTTGCTTCTATGAACAAGTAGTAA
CTGATTCGTCTTCTGATTCTTCAACTGAATCGTGAAT
CTTGTAAGACTGACTAGAAAAAAGAAGACTTTGTTA
CACGCAAATCTGTTTAACAGGAAAAAAAATACAAT
CTTTTTGAGGAGATGA
2012年第3期 87范继业等 ：亲环素 AtCYP1 RNA 干涉载体的构建及对拟南芥发育的影响
酶切连接，两步法构建到 pTCK303 载体上。分两次
连载体，第一次 SpeⅠ和 SacⅠ，第二次 BamH Ⅰ
和 KpnⅠ，两个反向的片段形成发夹结构以产生双
链 RNA，从而引起 RNAi 效应（图 3）。转化农杆菌
感受态，鉴定正确后准备转基因。上述 DNA 序列测
定由本实验室及上海生工公司完成。
1.2.3 拟南芥基因转化 真空渗入法转化拟南芥［9］，
略有改动 ：将含有农杆菌的转化介质倒入 100 mL 烧
杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花
序浸入转化介质中，浸泡5 min后将多余的水珠抖落，
侧卧放在干净的塑料盆中，并用薄膜覆盖避光保湿
恢复培养 24 h。揭开薄膜，将拟南芥正用水浇透正
常培养。待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。
1.2.4 转基因抗性苗的筛选及 GUS 染色 转基因
RNAi 苗具潮霉素抗性，收取转基因 RNAi 苗种子（T1
代）铺于潮霉素（500 mg/L）抗性 MS 平板上得到抗
性苗，移栽收取种子（T2 代），根据孟德尔分离定
律，T2 代在抗性平板上符合 3 1 分离比的株系即为
单拷贝插入的RNAi转基因株系。再从其子代（T3代）
中筛选全抗苗，即为 RNAi 转基因纯合株系。
GUS 染色 ：选取 T2 代抗性苗浸入 GUS 染液中
37℃过夜，用 100% 乙醇脱色 30 min，再浸入 75%
乙 醇 15 min， 转 入 0.24 mol/L HCl in 20% 乙 醇 15
min，用 7%NaOH in 60% 乙醇 15 min，然后依次用
40%、20%、10% 乙醇溶液浸泡 5 min，再用 5% 乙
醇处理 15 min，最后用 25% 甘油浸入 15 min。
1.2.5 转基因 RNAi 株系 AtCYP1 转录本鉴定 选取
空载体 PTCK303、RNAi 株系 T1、T2 代的抗性苗剪
取幼嫩叶片分别提取 RNA 并且做半定量 RT-PCR，
比较二者 AtCYP1 基因表达量。
选取野生型（WT）、空载体 PTCK303、转基因
RNAi 纯合株系的种子，在 MS 平板上培养，长出
真叶后分别提取 RNA 并且半定量 RT-PCR，比较其
AtCYP1 基因表达量。
2 结果
2.1 Ubi::AtCYP1i表达载体的鉴定
电泳图谱（图 4）显示目的基因条带大小正确，
Ubi::AtCYP1i 表达载体的构建符合预期，达到了转
基因的要求。
图 4 Ubi::AtCYP1i的鉴定
2.2 转基因抗性苗的筛选及GUS染色
RNAi 转基因株系筛选结果共得到 23 个符合分
离比的株系，部分见表 1，图 5-A。GUS 染色观察结
果见图 5-B。
按照孟德尔分离定律，子二代表型分离比是3 1，
则说明转基因植株为显性杂合，可进一步筛选全抗
幼苗，即得到转基因纯合株系。GUS 染色结果可以
看到 T2 代转基因苗的根部有较为明显的表达，苗的
叶片也有少量表达，说明转基因成功。
表 1 RNAi转基因株系的抗性分离比
Line Resistant Sensitive Ratio
RNAi T2 33 137 51 2.686
RNAi T2 200 119 40 2.975
RNAi T2 201 158 57 2.772
RNAi T2 2 136 43 3.163
RNAi T2 26 102 31 3.29
RNAi T2 19 214 69 3.101
RNAi T2 18 175 65 2.692
RNAi T2 22 192 66 2.909
RNAi T2 9 127 38 3.342
RNAi T2 21 116 35 3.314
RNAi T2 11 231 76 3.039
A. cyp1 基因 PCR 克隆产物，M. 100 bp DNA ladder，1, 2. PC 扩增产物 ; B. 酶切验证目的基因，M. 100 bp DNA ladder，
1. 重组质粒，2. 酶切质粒 ; C. 农杆菌菌体 PCR 验证，M. 100 bp DNA ladder，1-4. PCR 扩增产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期88
2.3 Ubi::AtCYP1i表达载体分子鉴定
空载体 PTCK303、转基因 RNAi 株系 T1、T2 代
抗性苗，取幼嫩叶片，通过半定量 RT-PCR，结果
见图 6-A，转基因 RNAi 株系 T1、T2 代的苗 AtCYP1
基因表达量明显低于空载体 PTCK303 苗。选取野生
型、空载体 PTCK303、转基因 RNAi 纯合株系的真叶，
通过半定量 RT-PCR，结果见图 6-B，野生型和空载
体苗 AtCYP1 基因表达量高于 RNAi 纯合株系，与前
面结果相符。
电泳结果说明，转基因后 RNAi 干涉效果较为
明显，T1、T2 代和纯合体的 AtCYP1 基因表达量均
有所降低，为生理功能的表型研究提供了依据。
抽苔时间、苔高、开花时间、结荚时间的连续观察
和比较，发现 RNAi 转基因纯合株系抽苔时间比野
生型晚 3.32 d，比空载体对照晚 2.93 d（图 7-A）；
抽苔时叶片数较野生型多 2.49 片，较空载体对照多
2.41 片（图 7-B）；其开花时间、结出第一个种荚的
时间（图 7-C）、株高等方面也与对照存在明显差异。
A. RNAi T2 代拟南芥幼苗分离比 ; B. T2 代阳性幼苗 GUS 染色
图 5 RNAi转基因抗性苗（T2代）的筛选及 GUS染色
图 6 RNAi转基因植株转录本鉴定
2.4 转基因RNAi株系AtCYP1表型观察
把 RNAi 转基因纯合体拟南芥植株与野生型和
空载体转基因株系（PTCK303）一同种植，观察各
个株系生长发育上的表型差异。通过对莲座叶片、
A. RNAi 拟南芥植株与野生型抽苔前叶片发育统计 ; B. RNAi
拟南芥植株与野生型抽苔后株高统计 ; C. RNAi 拟南芥植株与
野生型抽苔、开花和结荚时间统计
图 7 RNAi拟南芥植株与野生型的表型统计
A
B
C
如图 8 所示，RNAi 转基因纯合株系的开花、结
荚时间明显晚于野生型，显示随着 AtCYP1 表达量
2012年第3期 89范继业等 ：亲环素 AtCYP1 RNA 干涉载体的构建及对拟南芥发育的影响
降低，拟南芥开花时间也随之变化，与前期研究结
果相符，说明 AtCYP1 可能参与了拟南芥的开花发
育过程，同时，RNAi 株系在表现出抽苔时间差异的
同时也出现了叶片数的变化，说明 AtCYP1 可能还
参与了细胞增殖过程。
图 7 RNAi拟南芥植株与野生型的表型比较
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
3 讨论
利用 RNAi 技术，通过构建入 AtCYP1 基因 3
非编码区特异序列（344 bp）的载体 PTCK303 进
行转基因，通过半定量 RT-PCR 检测表达量。观察
T1、T2 代表型，发现抗性苗在开花早晚和抽苔时叶
片数目上与对照有明显差异，抽苔早的株系叶片数
目少于抽苔晚的。而 RNAi 纯合株系，种下后观察
表型发现 RNAi 纯合体在开花时间上晚于对照，抽
苔时叶片数目多于对照。说明 AtCYP1 基因的表达
量降低后确实能够引起拟南芥晚花现象，进一步验
证了此基因参与拟南芥开花时间的调控过程，但是
具体的参与调控的机理还有待进一步的研究。