全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-03-31
基金项目 : 科技部科技支撑计划项目（2007BAD48B04）, 国家橡胶产业技术体系（CARS-34-GW8）
作者简介 : 刘晓妹 , 女 , 硕士 , 副教授 , 研究方向 : 热带作物病害病原真菌致病基因 ; E-mail: lxmpll@126.com
通讯作者 : 郑服丛 , 男 , 教授 , 研究方向 : 热带作物病原真菌分子生物学 ; E-mail: zhengfucong@126.com
促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein
kinase，MAPK）是三大类细胞外信号转导途径之一，
由 MAPKKK-MAPKK-MAPK 组成，在细胞外信号的刺
激下，MAPKKK 通过 SxxxS/T 基序的丝氨酸和丝氨
酸 / 苏氦酸磷酸化激活 MAPKK，再通过 TxY 基序的
苏氨酸 / 酪氨酸磷酸化激活 MAPK，而 MAPK 被激
多主棒孢菌调控致病性相关基因 CCK1的克隆及
生物信息学分析
刘晓妹1，2 蒲金基3 张欣3 漆艳香3 谢艺贤3 张贺3 郑服丛1
（1 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228 ；2 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海口 570228 ；
3 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，儋州 571737）
摘 要： 采用同源克隆、SEFA-PCR和 RT-PCR技术克隆获得了多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）CCK1基因的 DNA和
cDNA。生物信息学分析表明，该基因 DNA和 cDNA全长分别为 2 710 bp和 1 065 bp，编码区含 4个内含子（长 53、54、50和 56
bp），推测编码 354个氨基酸，其分子量约 40.98 kD，等电点（pI）6.43。从 GenBank搜索相似蛋白和构建进化树发现，CCK1与多
个丝状真菌调控致病性相关的 PMK1类 MAPK蛋白聚为一类，且含 1个参与双重磷酸化作用的 MAPK蛋白激活域 TEY和 1个 Ser/
Thr蛋白激酶保守结构域。推测 CCK1基因可能参与调控 C. cassiicola菌丝生长、产孢和致病性等。
关键词： 多主棒孢菌 蛋白激酶 克隆 生物学信息
Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene CCK1 Related to
Pathogenicity of Corynespora cassiicola on Hevea Rubber
Liu Xiaomei1，2 Pu Jinji3 Zhang Xin3 Qi Yanxiang3 Xie Yixian3 Zhang He3 Zheng Fucong1
（1College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228；2Key Laboratory of Protection and Development
Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Hainan University，Ministry of Education，Haikou 570228；3Environment and Plant
Protection Institute，CATAS，Danzhou 571737）
Abstract: A new gene CCK1 of unknown function was cloned from Corynespora cassiicola （Bert. ＆ Curt.）Wei on Hevea rubber by the
method of homologous cloning, SEFA-PCR and RT-PCR. The bioinformatics analysis results were as follows ：The complete DNA and cDNA
sequence of CCK1 gene were respectively 2 710 bp and 1 065 bp in size, including four introns with 56, 54, 50, and 56 bp, respectively, encoding
a putative protein of 354-amino acid with a molecular weight 40.98 kD and isoelectric point of 6.43. After searching for proteins similar to CCK1
in the GenBank database and conducting a phylogenetic tree analysis, putative protein of CCK1 was found to be greatly similarity to some other
fungal PMK1-type MAP kinases related to regulating pathogenicity. Furthermore, a TEY of the MAP domain-participating dual phosphorylation
and Ser/Thr kinase-conserved domain were included. The protein kinase CCK1 may involve in mycelia growth, conidiation, and pathogenicity of C.
cassiicola.
Key words: Corynespora cassiicola MAP kinase Cloning Bioinformatics
活后能够将细胞质中信号传递到细胞核中，通过对
酶和转录因子的磷酸化，调节基因表达从而引起细
胞反应。近些年 MAPK 信号转导途径在植物病原真
菌中的作用备受关注［1］，在稻瘟病菌（Magnaporthe
grisea）中根据 MAPK 序列相似性已归纳出了 OSMl、
PMK1 和 MPS1 三条 MAPK 途径，主要参与调控病
2012年第10期 169刘晓妹等 ：多主棒孢菌调控致病性相关基因 CCK1 的克隆及生物信息学分析
菌的胁迫反应、附着胞的形成和致病性、细胞壁的
完整性等［2-4］。但同类基因在不同病原菌中所起的
作用是变化的，不同真菌的转导途径及各途径之间
的互作也是有差别的，所以选择尚未开展相关研究
的病原菌作为研究对象仍有必要。
巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要的热带
作物之一，其产品天然橡胶与钢铁、石油、煤炭并
列为四大工业原料。棒孢属（Corynespora spp.）是重
要的植物病原真菌，至今除漆艳香［5］初步克隆了一
个与调控细胞壁完整性有关的 CMP1 基因（MPS1 类）
外，国内外未见有人在该属病原菌中开展过与调控
致病性有关的 PMK1 类 MAPK 基因的研究。多主棒
孢菌［Corynespora cassiicola （Bert. ＆ Curt.）Wei］是
该属病菌的代表种，可为害 300 多种植物［6］，其中
由它引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是国际上公认
的继南美叶疫病之后的又一个为害巴西橡胶树的毁
灭性病害，极具典型性，以它作为研究对象，搞清
MAPK 类信号转导途径在多主棒孢菌对巴西橡胶树
致病力方面的调控功能，对揭示棒孢属真菌的致病
机理，了解该属真菌与寄主之间的互作机制很有意
义。本研究采用同源克隆等方法，从分离自天然橡
胶树的多主棒孢菌中克隆 MAPK 基因，并通过生物
信息学分析预测其功能，预期获得与 PMK1 类基因
高度相似的 MAPK 基因及其全长序列，旨在为下一
步研究其在多主棒孢菌致病过程中所起的具体功能
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病原菌
多主棒孢菌［C. cassiicola （Bert. ＆ Curt.）Wei］单孢
菌株 CC004，由中国热带农业科学院环境与植物保
护研究所热带果树病害课题组鉴定、提供。
1.1.2 试剂 Fungal gDNA Kit 为 BioMiga 产品；pMD
18-T Vector、1.5 U LA Taq DNA 聚合酶、2×GC Buf-
fer I（Mg2+ Plus）、2.5 mmol/L dNTP、PrimerSTAR HS
DNA Polymerase 为 TaKaRa 产品；2×Taq-Mixture Kit、
Escherichia coli DH5α、TIAN Gel Midi Purification Kit
和TIAN Script cDNA First-Stand Kit为TIANGEN产品，
RNA Extraction Kit 为 BioTeke 产品。
1.2 方法
1.2.1 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌菌丝的收集与
核酸的提取 收集用 PD 培养液培养 4-5 d 的菌丝。
DNA 的提取按 BioMiga Fungal gDNA Kit 说明书操作。
RNA 的提取按 BioTeke RNA Extraction Kit 操作。
1.2.2 从基因组 DNA 扩增 CCK1 基因片段 采用
同源克隆法。用 Clustal X（version 1.81）软件中
的 Alignment 比对分析 GenBank 中稻瘟病病菌（M.
grisea） 的 PMK1（U70134.1）、 玉 米 小 斑 病 病 菌
（Cochliobolus heterostrophus）的 CHK1（AF178977.1）
和稻胡麻斑病病菌（Cochliobolus miyabeanus）的
BMK1（AB180104.1）氨基酸和 cDNA 序列，根据保
守氨基酸和 cDNA 序列，设计简并引物对 M1：5-CA
（AG）GA（AG）（CT）T（ATCG）ATGGA（AG）
AC-3 和 M2 ：5-TC（AG）TT（ATCG）GG（AG）
TC（AG）TG（AG）TA-3。以巴西橡胶树棒孢霉落
叶病病原菌基因组 DNA 为模板，扩增体系（50 μL）：
2×Taq-Mixture 25 μL，M1（10 μmol/L）2 μL，M2
（10 μmol/L）2 μL，模板 DNA 1 μL，加 ddH2O 补至
50 μL。PCR 扩增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，51℃
45 s，72℃ 1 min，35 个循环 ；72℃ 10 min。PCR 产
物的凝胶回收、连接分别按照 TIANGEN 和 TaRaKa
相应试剂盒说明书操作。
1.2.3 SEFA-PCR 获得 CCK1 基因全长 参照 SEFA-
PCR（Self-Formed Adaptor PCR）引物设计原理［7］，
根据已获的 CCK1 基因片段序列设计扩增 5端和
3端的引物。扩增 5端引物 ：5SA1（5-TCGGCCA-
AGATGCAGCCCACA-3）；5SA2（5-TGGCGTTCAG-
CAGCAGGTTGG-3）；5Hemi-SA3（5-GTAGATGAA-
GTATTG，NNN，NNN，NNN，GCAGTG-3）。扩增 3
端引物 ：3SA1（5-AGTGTGGGCTGCATCTTGGCCG-
AGA-3）；3SA2（5-AACCCGTTCCCAGACCACCACCA-
G-3）； 3Hemi-SA3（5-TCGTGCCCGCGAAT，NNN，
NNN，NNN，ACATCC-3）。
1.2.3.1 SEFA-PCR 第一步扩增 扩增体系（30 μL）：
2×GC Buffer I（Mg2+ Plus）15.0 μL，dNTP Mix（各 2.5
mmol/L）5.0 μL，Hemi-SA3（20 μmol/L）0.5 μL，模
板 DNA 1.5 μL，LA Taq酶（1.5 U）0.5 μL，补 ddH2O
至 30 μL。扩增程序 ：94℃ 1 min ；94℃ 30 s，40℃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期170
3 min，以每秒增加 0.2℃的速度升至 70℃，70℃
5 min。取出 PCR 管加入 0.5 μL 引物 SA1（20 μmol/L）
后继续扩增，扩增程序 ：94℃ 30 s，70℃ 5.5 min，
25 个循环 ；再进行 8 轮不对称扩增（94℃ 30 s，
70℃ 5.5 min，2 个循环 ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，1 个
循环 ；70℃ 5 min。
1.2.3.2 SEFA-PCR 第 二 步 扩 增 扩 增 体 系（30
μL）：引物 SA2（20 μmol/L）0.5 μL，模板为第一步
扩增产物 1.5 μL，其余同第一步扩增。扩增程序 ：
94℃ 3 min；94℃ 30 s，66℃ 30 s（5端）/65℃ 30 s（3
端），72℃ 5 min，33 个循环 ；72℃ 10 min。
1.2.4 序列拼接与验证 利用 DNAssist 软件将所得
5端和 3端序列与 CCK1 基因片段序列拼接获得其
初步的全长序列。再从两端设计引物，用高保真酶
PrimerSTAR HS DNA Polymerase 扩增、测序，验证
已获得序列的正确性。
1.2.5 用RT-PCR法从基因组RNA扩增获得CCK1的
cDNA序列 用DNAssist 软件对所得CCK1基因全序
列与 GenBank 中的稻胡麻斑病病菌（C. miyabeanus）
的 BMK1 的 cDNA 序列（AB180104.1）比对分析后，
用推定的 cDNA 序列设计引物对 RCK1（5-ATGTCT-
CGCGCCCCC-3）和 RCK2（5-AATTACCGCATGATC-
TCCT-3），按照 TIAN Script cDNA First-Stand Kit 说明
书操作，扩增 CCK1 基因的 cDNA 片段并克隆、测序。
1.2.6 CCK1 基因序列分析 利用 DNAssist 1.0 软件
比对分析所获得的 CCK1 基因 DNA 和 cDNA 序列，
找出开放读码框、Kozak 序列、起始密码子、终止
密码子、外显子、内含子。利用 BioEdit 软件分析
CCK1 基因编码序列的化学特征。用 Primer5.0 软件
推测 CCK1 基因编码的氨基酸序列。用 ExPASy 软件
包中 Computer PI/MW 软件对该蛋白序列组分进行分
析。用 Clustal X（version 1.81）软件中的 Alignment
程序和 MEGA 4.1 构建该蛋白的系统进化树，推测
CCK1 可能的功能。
2 结果
2.1 CCK1基因片段扩增结果
用引物组合 M1 和 M2，以巴西橡胶树棒孢霉落
叶病病菌基因组 DNA 为模板扩增获得了 700 bp 片
段（图 1），定名 CCK1。测得的序列经 Blastn 分析
与多个植物病原真菌 PMK1 类 MAPK 基因高度相似，
说明获得 CCK1 基因片段符合预期。
M. DL2000 DNA Marker；1，2. PCR扩增产物
图 1 CCK1基因片段扩增结果
2.2 SEFA-PCR获得CCK1基因DNA全长
通过 SEFA-PCR 两步成功扩增获得了 CCK1 基
因片段上下游侧翼区域（图 2）。测序表明，5端和 3
端侧翼序列长分别为 1 802 bp 和 652 bp，与已获得
序列拼接后的 CCK1 基因为 2 710 bp。再从两端设计
引物并用高保真酶扩增、测序和校正，证实所得上
下游片段来自同一基因，所得 CCK1 基因个别碱基
被校正，但全长不变。
图 2 CCK1基因 5端（A）和 3端（B）SEFA-PCR产物
M. DL2000 DNA Marker ；1,2. 分别为第一轮、第二轮扩增产物
2.3 用RT-PCR法从基因组RNA扩增获得CCK1的
cDNA序列
经 RT-PCR 扩增获得约 1 000 bp 的 cDNA 片段
（图 3），测序表明大小为 1 065 bp。
2.4 CCK1序列分析
2.4.1 CCK1 基因全长 DNA 与 cDNA 序列分析 比
对分析 CCK1 基因 DNA 和 cDNA 序列，发现含一个
2012年第10期 171刘晓妹等 ：多主棒孢菌调控致病性相关基因 CCK1 的克隆及生物信息学分析
1 065 bp 大小的开放阅读框，起始密码子 ATG 位于
第 1 227-1 229 bp 处，符合Kozak规则，即ACCATGT，
终止密码子 TAA 位于第 2 502-2 504 bp 处，自 ATG
到 TAA 的 DNA 全长 1 278 bp，其中存在 4 个大小分
别为 53、54、50 和 56 bp 的内含子（位于第 1 337-
1 389，1 586-1 639，2 022-2 071 和 2 420-2 475 碱
基处），所有内含子均符合 GT-AG 法则。
用 BioEdit 软件分析结果表明，CCK1 基因编码
序列的双链核苷酸分子量大小为 778.48 kD，（G+C）
mol% 为 57.12%，（A+T）mol% 为 42.88%，可见该
编码区富含 G+C 碱基，其中 C 的摩尔百分含量为
32.39%。
2.4.2 CCK1 基因推测蛋白的化学特征分析 用
Primer 5.0 软件推测 CCK1 基因编码 354 个氨基酸。
用 ExPASy 软件包中 Computer PI/MW 软件分析发现
推测的 CCK1 蛋白分子量为 40.98 kD，包括 46 个强
碱性氨基酸（KR），49 个强酸性氨基酸（DE），150
个非极性氨基酸（AILMPWVF），109 个极性氨基
酸（NCQSTYHG），等电点（pI）为 6.43。可见是一
种富含非极性氨基酸的微酸性蛋白质，其中亮氨酸
（Leu）、赖氨酸（Lys）的含量分别达 11.02% 和 7.34%。
2.4.3 CCK1 基 因 预 测 蛋 白 的 相 似 性 分 析 从
GenBank 中搜索相似蛋白比对发现，CCK1 推测蛋白
序列与禾谷类叶枯病病菌（Phaeosphaeria nodorum）
MAK2（XP_001793869.1）、 稻 胡 麻 斑 病 病 菌（C.
miyabeanus）BMK1（AB180104.1）、玉米小斑病病菌
（C. heterostrophus）CHK1（AF178977.1）、稻瘟病病菌
（M. grisea）PMK1（U70134.1）和番茄枯萎病病菌
（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）FMK1（AF286-
533.1）蛋白序列高度相似，相似性分别为 99%、
98%、98%、93% 和 93%，而且含有一个参与双
重磷酸化作用的 MAPK 蛋白激活域 TEY（182AA-
184AA）。
用 MEGA4.1 构建系统进化树（图 4）表明，CCK1
预测蛋白属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
的 FUS3/KSS1 类或稻瘟病菌（M. grisea）PMK1 类的
MAPK。
图 3 CCK1基因 cDNA扩增
M. DL2000 DNA Marker ；1,2. RT-PCR 产物
PMK1（U70134.1），MPS1（AF020316.1） 和 OSM1（AF184980.1） 表 示 来
自稻瘟病病菌（Magnaporthe grisea）的 MAPK ；CHK1 来自玉米小斑病病
菌（Cochliobolus heterostrophus） （AF178977.1）；BMK1 来自稻胡麻斑病病
菌（Cochliobolus miyabeanus）（AB180104.1）；GMK1 自（Gaeumannomyces
graminis）（AF258529.1）；FMK1 （AF286533.1） 来自番茄枯萎病病菌（Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici） 的 MAPK ；FsMAPK（U52963.1）来自豌豆根腐
病病菌（Fusarium solani）；GPMK1（AF448230.1）来自禾谷赤霉病病菌
（Gaeumannomyces zeae）；MK2（AY262368.1）来自栗疫病病菌（Cryphonectria
parasitica）；KSS1（AAA34882.1），FUS3 （M31132.1），HOG1 （L06279.1），
SLT2 （X59262.1） 和 SMK1（AAB59325.1） 来 自 酿 酒 酵 母（Saccharomyces
cerevisiae）的 MAPK
图 4 CCK1蛋白与其他真菌MAPK蛋白的系统树
分支上为 bootstrap 值，1000 次重复抽样检测
2.4.4 CCK1 基因预测蛋白的保守结构域分析 利
用 NCBI 的 Blast 软 件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
structure/cdd/wrpsb.cgi）进行 CCK1 基因预测蛋白的
结构域分析（图 5），发现该蛋白中含有 Ser/Thr 蛋
白激酶的保守结构域，说明 CCKl 属于 Ser/Thr 蛋白
激酶。
3 讨论
在不同植物病原真菌中，PMK1 类 MAPK 基因
缺失突变体的表型通常表现为致病力下降或完全丧
失，但对菌丝生长和产孢等的影响存在明显差异。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期172
如稻胡麻斑病病菌（C. miyabeanus）BMK1、玉米小
斑病病菌（C. heterostrophus）CHK1 和稻瘟病病菌（M.
grisea）PMK1 同为 PMK1 类 MAPK 基因，但是突变
后的表型却有差异，BMK1 突变后致病力和产孢能
力完全丧失、菌丝生长不良［8］；CHK1 突变后却仅
表现致病力和产孢量下降，菌丝除生长不良外，还
有自溶现象，菌丝也不能受精产生假囊壳［9］；PMK1
突变后菌丝的生长、产孢、孢子的附着力与萌发力
都正常，但萌发后的芽管前端只能膨大成钩状体，
不能形成附着胞，也无致病力［10］。尽管 CCK1 推测
蛋白与这些基因编码蛋白高度相似，但该基因是否
与巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌的生长发育及致病
性有关，还有待进一步研究来证实。
SEFA-PCR 技术是王世明［7］博士发明的一种快
速扩增某已知 DNA 序列侧翼序列的新方法。与目前
热门的 RACE、Tail-PCR 和 Gene-walking 相比，该技
术操作步骤简单，无需经过加接头、加尾、筛选扩
增体系和扩增条件等一系列复杂的试验，仅需两步
即可获得预期片段，而且用 TaKaRa 公司常规的 La-
Taq DNA 聚合酶即可，无需使用昂贵试剂盒，所以
试验成本大大降低，费用约为 RACE 的 1/20、Gene-
walking 的 1/4。缺点是有时获得的片段偏长（>1.8
kb），不易克隆测序，又因第二轮扩增获得的序列两
端反向互补，也无法用第二轮扩增引物进行 PCR 产
物测序。经过推敲，本试验巧妙地利用第二个和第
三个引物（用于 SEFA-PCR）之间的已知序列，设
计了一个单向测序引物克服了这一难题，避免了
SEFA-PCR 扩增产物过长造成克隆测序困难的难题，
而且因为是 PCR 产物测序而非克隆测序，所以测序
时间较短，结果更为准确。该改进方法已在 CCK1
及本实验室另外两个基因的 SEFA-PCR 扩增及其产
物测序中得到了成功验证，值得推荐。
4 结论
本试验参考多个真菌 MAPK 基因序列，用同
源克隆等方法，从巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌
多主棒孢菌（C. cassiicola）中克隆获得 MAPK 类基
因 CCK1，其 DNA 和 cDNA 全长分别为 2 710 bp 和
1 065 bp，推测编码 354 个氨基酸，具有 1 个参与
双重磷酸化作用的 MAPK 蛋白激活域 TEY 和 1 个
Ser/Thr 蛋白激酶保守结构域，且与多个丝状真菌中
调控致病性相关的 PMK1 类 MAPK 蛋白高度相似。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
图 5 CCK1基因预测蛋白的保守结构域