全 文 ：·综述与专论· 2013年第11期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2013-05-28
作者简介 ：黄蔚，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物与基因工程 ；E-mail ：xinzi6023@sina.com
通讯作者 ：苏建宇，男，博士，教授，研究方向 ：工业微生物 ；E-mail ：su_jy@nxu.edu.cn
泰乐菌素高产菌株选育研究进展
黄蔚1  徐春燕1  牛春2  张萍2  苏建宇1
（1. 宁夏大学生命科学学院 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021 ；
2. 宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川 750101）
摘 要 ： 泰乐菌素是一类十六元大环内酯类禽畜专用抗生素，因其抗菌谱广及对动物生长的促进作用而被国内外养殖业广
泛使用。泰乐菌素高产菌种选育是泰乐菌素发酵技术研究的重点。物理诱变、化学诱变等传统育种方法虽然发展成熟、操作简单，
但诱变效率低下，且后续筛选过程繁琐。随着遗传学、分子生物学等学科的发展，利用分子育种技术定向改造泰乐菌素产生菌的
生产能力成为高产菌种选育的一种最有效手段。以分子育种为重点，结合各种菌种选育方法，对近年来泰乐菌素高产菌株选育的
进展情况进行综述。
关键词 ： 泰乐菌素 生物合成 链霉菌 抗生素 育种
Advance in Breeding of High Tylosin Producing Strain
Huang Wei1 Xu Chunyan1 Niu Chun2 Zhang Ping2 Su Jianyu1
（1. Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China，School of Life
Science，Ningxia University，Yinchuan 750021 ；2. Ningxia Tairui Pharmaceutical Company Limited，Yinchuan 750101）
Abstract:  Tylosin is a kind of 16-numbered macrolide antibiotic which is exclusively applied in animals. As its and it could，Tylosin
is widely used in livestock breeding because of its property of broad spectrum antibiotic and function of promoting animal growth. Breeding of
high-yield strain is the emphasis of tylosin fermentation research. Traditional breeding methods such as physical and chemical mutagenesis are
simple and mature. However，the efficiency of mutagenesis is very low，and the subsequent screening process is tedious. With the development
of genetics and molecular biology，it becomes an efficiency method by using directed evolution of molecular breeding technology to improve the
production capacity of tylosin. In this paper，we focused on the molecular breeding progress and combined different breeding methods to review
the progress in breeding of high tylosin producing strain in recent years.
Key words:  Tylosin Biosythesis Streptomyces Antibiotic Breeding
有人用药物残留，且泰乐菌素与红霉素（Erythromy-
cin）等抗生素有很高的结构相似性，为了避免病原
菌产生对某些人用大环内酯类抗生素（主要为红霉
素家族）的交叉抗性，欧盟已经禁止泰乐菌素在畜
禽养殖中作为饲料添加剂继续使用，从而导致近些
年来泰乐菌素的市场份额有所减少［3］。但是，作为
动物疾病高效的防治药物，泰乐菌素依然是一种十
分重要的畜禽用抗生素，国内外对泰乐菌素的研究
也从未停止［4］。
泰 乐 菌 素 产 生 菌 有 弗 氏 链 霉 菌（S. fradiae）、
吸 水 链 霉 菌（S. hygroscopicus）、 龟 裂 链 霉 菌（S.
泰乐菌素（Tylosin），又名泰乐星，是一类 16
元大环内酯类禽畜专用抗生素，在国内外养殖业中
广泛用作兽药和饲料添加剂，是国家规划重点发
展的兽药产品［1］。它通过与核糖体结合，作用于
mRNA-氨酰 -tRNA-核糖体复合体来抑制蛋白质的合
成，进而有效抑制革兰氏阳性菌、某些革兰氏阴性
球菌、支原体、分枝杆菌、螺旋体及原虫等微生物
的生长与繁殖［1-2］。此外，泰乐菌素还可以促进禽
畜生长，提高饲料利用率，缩短饲养周期，并且增
加养殖业的经济效益［2］。
近年来研究发现，使用过泰乐菌素的动物体内
2013年第11期 35黄蔚等 ：泰乐菌素高产菌株选育研究进展
表 1 秦乐菌素的主要组分
成分 R1 R2 R3
A 组分 泰乐菌素 L-mycarose（碳霉糖） CH3 CHO
B 组分 脱碳霉糖泰乐菌素 H CH3 CHO
C 组分 大菌素 L-mycarose H CHO
D 组分 雷洛菌素 L-mycarose CH3 CH2OH
rimosus）等，目前其工业生产菌是弗氏链霉菌。生
产菌菌种质量是决定抗生素开发和发展前途的关键
因素。与其他微生物菌种选育相似，泰乐菌素生产
菌选育的研究早期主要集中于一些传统的育种方法。
随着弗氏链霉菌分子生物学研究的逐渐深入，现已
成功克隆了泰乐菌素的生物合成基因簇，对其中多
数基因的功能及泰乐菌素的生物合成途径也已明确。
泰乐菌素生物合成的分子生物学基础研究不仅帮助
人们了解泰乐菌素和大环内酯类抗生素的生物合成
机制，还有利于人们打破传统育种方法，利用基因
工程的手段定向改良工业生产菌种。基于此，本文
主要介绍泰乐菌素高产菌株选育的研究进展情况，
重点就分子育种的进展进行阐述。
1 泰乐菌素简介
泰乐菌素属于大环内酯类抗生素，其结构主要
由十六元大环内酯环连着碳霉氨基糖（Mycaminose）、
红霉糖（Mycarose）和 6-脱氧 -D-阿洛糖（Mycinose）
3 个糖苷配基组成。这 3 个脱氧糖苷配基均来自葡
萄糖，N 上甲基基团则来自 SAM（腺苷甲硫氨酸）。
早在 20 世纪 60 年代，Morrin 等就着手研究泰乐菌
素的结构，到 1970 年已阐明泰乐菌素各组分的结构，
其分子结构，见图 1。
因工程等技术手段进行菌种选育［5-8］，分别对其综
述如下。
2.1 物理诱变
物理诱变是微生物育种的一个重要方法，其具
有操作简单，见效快等优点，在发酵工业中具有不
可替代的位置。当今发酵工业中的生产菌种大部分
是通过物理诱变选育出来的［9］。目前常用的物理诱
变有紫外诱变、激光辐射诱变、微波诱变、离子注
入诱变、超高压诱变和空间作用诱变等［10］。
国外对泰乐菌素生产菌株诱变育种研究的起步
较早，如 Khaliq 等［11］以 S. fradiae NRRL-2702 为出
发菌株，经过紫外线诱变，筛选得到一株产泰乐菌
素 1 500 mg/L 的菌株，产量是出发菌株的 2.7 倍。
传统的物理诱变使得菌种产生抗生素的能力有
所提高，但是人们对新的、更有效的育种方法的探
寻从未间断。随着人类对空间资源的开发利用和全
球航天工业的发展，空间环境对生物体的效应研究
受到重视，国内外将研究重点放在微生物的空间诱
变育种上。方晓梅等［12］ 将 S. fradiae 9940S+-86 连
续经“神舟”1、3、4 号飞船搭载进行太空诱变育
种，获得 48 株效价提高较多的菌株，最高效价达到
14 950 μg/mL，较出发菌株提高 91.5%。魏丽勤等［13］
将 S. fradiae 9904S+-86 经过搭载第 18 颗返回式科学
与技术试验卫星，诱发菌株发生突变，并且筛选出
一株高产菌株 T1-156-84-23-s67，该菌摇瓶效价达到
15 266 U/mL，比出发菌株 9904S+-86（8 742 U/mL）
提高了 74.6%，并且对菌株的全细胞蛋白 SDS-聚丙
烯酰胺凝胶分析发现，突变菌株比出发菌株的全细
胞蛋白指纹图谱也有显著差异。
2.2 化学诱变
化学诱变育种主要是指利用一系列化学物质，
如亚硝基胍、氯化锂、吖啶橙等物质［14］对菌体处
理，导致基因组中碱基突变［15，16］。文献报道，1987
年 Kibarska 等［17］ 用 1% 亚 硝 基 胍 处 理 S. fradiae
HO
H3C
OR2
CH2
CH3
R3
CH3
H3C
OH
HO
O
OO
O
O
O
O
CH3
OR1
NCH32
OCH3
Tyloisin
H3C
图 1 泰乐菌素结构式
泰乐菌素主要由泰乐菌素（tylosin）A、脱碳霉
糖泰乐菌素（desmycosin）B、大菌素（macrocin）C
和雷洛菌素（relomycin）D 四种组分构成（表 1），
其中 tylosin A 为主要组分，且生物活性最高。据国
家兽药典规定，泰乐菌素四种组分的含量必须超过
95%，其中泰乐菌素 A 必须达 80% 才合格。
2 泰乐菌素高产菌株选育
为了获得泰乐菌素高产菌株，研究人员在其生
产菌种改造方面做了大量工作，主要集中于利用物
理诱变、化学诱变、复合诱变、原生质体技术和基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期36
4 h，获得比出发菌株产量提高 5-6 倍的突变株。
Panfilova［18］在 S. fradiae 出发菌株中取不同萌发时
期的孢子经亚硝基胍短暂处理，确定孢子诱变的敏
感时期，并且分离到了较出发菌株泰乐菌素产量高
60% 的菌株［11］。
很多化学诱变剂能够产生高比例的点突变和低
比例的 DNA 畸变，但是化学诱变剂大都是潜在的致
癌物质，其使用对环境及研究人员自身会造成一定
程度上的污染和毒害。
2.3 原生质体技术
微生物原生质体技术分为原生质体融合和原生
质体诱变。Malanicheva［19］将 S. fradiae NCIB 8233 和
ATCC 19609 进行原生质体融合，结果新的菌株不仅
产生了泰乐菌素，还产生了新霉素。Ikeda 等［20］将
泰乐菌素产生菌的原生质体经过两轮再生，分别使两
者的产量提高 2 倍和 3 倍。Baltz［21］利用 S. coelicolor
和 S. fradiae 进行原生质体融合，也获得了亲本菌株
所不具有的新的抗生素。
基因重组技术（Genome shuffling）是在原生质
体融合技术基础上发展起来的，结合传统有变育种
技术与细胞融合技术的一项对微生物整合全基因组
进行重排的定向育种技术［22-25］。Zhang［26］以泰乐菌
素生产菌 S. fradiae 为研究对象，将 S. fradiae 营养缺
陷型菌株作为亲本，进行无选择性的原生质体融合、
再生后等一系列试验，证明了多轮原生质体融合可
将多个亲本株的优良基因整合在同一菌株中。另外，
应用基因组重排技术，可以快速有效的改进细胞的
表性特征，或是对生长代谢途径进行优化，将该技
术与代谢工程中其他的分析方法结合使用，可以更
好地研究微生物代谢网络和调控［27］。
2.4 复合诱变
采用两种或两种以上的方式进行诱变育种，在
S. fradiae 的诱变育种上也开展了一些工作，并且已
经取得了很好的效果。如 Liutskanova［28］用紫外诱
变和亚硝基胍先后作用于 S. fradiae，获得的突变
株较出发菌株产量提高 0.5%-28.3%。田宇［14］ 以
S. fradiae A-49 为出发菌株依次用紫外线氯化锂诱变、
硫酸二乙酯诱变、链霉素抗性诱变等多种诱变手段
处理，筛选得到一株遗传性状稳定的高产菌株，摇
瓶发酵效价较出发菌株提高了 68%［29］。李向红等［30］
采用亚硝酸盐诱变与原生质体诱变相结合的技术处
理 S. fradiae，经 3 轮亚硝酸盐诱变后获得突变株
H188，再经 2 轮原生质体再生和诱变后再生，使泰
乐菌素产量显著提高［14］。
2.5 基因工程育种
在生物技术迅速发展及人们对微生物遗传学基
础深入研究的今天，高产菌株的选育不再局限于以
往盲目、效率低、回复性突变率高的传统诱变方法，
逐渐发展为通过应用代谢调控理论推理选育及基因
工程手段定向获得遗传稳定性好的高产菌株。对于
大部分目的产物为次级代谢产物的菌株来说，可以
通过基因工程的方法对次生代谢产物的生物合成进
行改造和调控。
国外从 20 世纪 70 年代起将基因工程技术应用
在微生物育种中，从 Hopwood 于 1983 年首次利用
链霉菌为宿主系统，克隆抗生素生物合成基因以来，
链霉菌的分子育种已经取得了很大的成就，并将基
因工程菌商业化［31，32］。目前已经有报道分子育种的
方法有 ：基因工程方法扩增表达代谢过程限速酶基
因、敲除负调控基因、引入正调节基因、引入抗性
基因、引入外源蛋白的克隆表达和将整个此生代谢
产物合成基因簇转移到易于工业化操作的宿主系统
中等方法［33］。
泰乐菌素的生物合成基因簇已经被克隆并测
序［34-36］，Baltz 等［37］利用基因阻断突变菌株的方法
阐明了泰乐菌素的生物合成过程，并将其生物合成
途径分为泰乐内酯的合成和酯环的修饰两个部分。
据现有文献报道，泰乐菌素分子育种主要通过扩增
表达次级代谢过程限速酶基因和引入血红蛋白基因
等［33］方法得到高产菌株。
2.5.1 限速酶基因的扩增 研究表明，泰乐菌素生
物合成的最终步骤是泰乐菌素整个生物合成的限速
步骤，催化反应是大菌素 O-甲基转移酶，编码该
酶的是泰乐菌素生物合成基因簇中的 tylF 基因［34］。
Solenberg 等［35］通过突变形成的 Tn5099 转座子证实
了基因组的中性位点，然后通过转座子交换将第二
个 tylF 的拷贝子插入这个中性位点。包含了 tylF 双
拷贝的重组菌比出发菌株泰乐菌素产量高了 40%。
2013年第11期 37黄蔚等 ：泰乐菌素高产菌株选育研究进展
另一种操作是克隆中性位点侧翼的 DNA 至 E. coli，
用这种克隆中性位点侧翼 DNA 的方法克隆 tylF 侧
翼的基因，然后 E. coli 与 S. fradiae 进行属间接合转
移［36］。重组菌株包含双交叉，tylF 插入中性位点的
重组菌株其泰乐菌素产量比出发菌株高 60%。范亮
等［38］通过拼接 PCR（SOE-PCR）将 tylF 置于链霉
菌中普遍使用的强启动子——红霉素抗性基因启动
子（PermE）之后，并且把拼接的基因连接至整合
型表达载体 pSET152，构建穿梭表达载体 pBH05，
通过属间接合转移至 S. fradiae，经过发酵验证发现
重组菌泰乐菌素产量较出发菌株提高了 32.7%。
2.5.2 引入血红蛋白基因 泰乐菌素发酵生产是一
个严格好氧的过程，溶氧水平直接影响 S. fradiae 的
菌体生长与产物合成。由于发酵培养基中一般需要
添加植物油促进泰乐菌素的合成［39］，培养基较黏
稠，而菌体的生长繁殖使发酵液黏度进一步加大，
严重阻碍了氧的传递，进而影响菌体生长和泰乐菌
素的合成。因此，在泰乐菌素生产中，空气成本占
动力成本的很大比例。近些年来，透明颤菌血红蛋
白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）在抗生素产生菌
种改良方面多有报道，取得了较好的效果。
透明颤菌血红蛋白是由一种能在厌氧环境中生
存的好氧型革兰氏阴性菌［40］透明颤菌（Vitreoscilla）
合成的原核生物血红蛋白，它在细胞处于氧限制条
件下大量合成，通过增加氧的传递效率促进细胞生
长，提高细胞培养密度和蛋白质合成能力，从而使
细胞适应贫氧的环境［41］。VHb 的生物学特性对于解
决好氧生物发酵过程中的供氧问题具有很大的科学
意义，尤其在耗氧量大、溶氧易成为限制性因素的
抗生素行业中备受关注。目前 vgb 基因已经在糖多
孢红霉素菌［41］、肉桂地链霉菌［42］、变青链霉菌［43］、
顶头孢霉菌［44］、委内瑞拉链霉菌［45］及刺糖多孢
菌［46］等多种抗生素产生菌中成功表达，并显著提
高相应抗生素的效价。
关于 VHb 在弗氏链霉菌基因工程改造中的研究
也有报道。陈文青等［31］首次将 VHb 导入弗氏链霉
菌中并获得表达，通过使用含有能被硫链丝菌素诱
导的强启动子（PtripA）的整合型表达载体 pIJ8600
构建 vgb（透明颤菌血红蛋白基因）基因表达载体，
并且再经过大肠杆菌 - 链霉菌属间接合转移导入弗
氏链霉菌中。结果表明，由硫链丝菌素诱导表达的
vgb 基因成功表达，并通过摇瓶发酵证实 VHb 蛋白
的表达可明显促进菌体的生长和泰乐菌素的合成。
VHb 在弗氏链霉菌中的成功表达提示研究者以工业
生产菌种为研究对象，从提高氧气利用效率和减少
空气成本的角度对泰乐菌素生产菌种进行改良将是
提高产量和质量的有效手段。
近些年来，随着相关学科的发展和对菌种改造
新技术的探索，一种基于基因组工程的新技术“最
小基因组构建”出现了。最小基因组是指，正在最
适宜条件下维持细胞生长和繁殖所必需的最小数目
的基因，优势小基因组菌株是保留了菌株特殊功能
基因簇的最小基因组菌株［47-50］。优势小基因组菌株
可以提高目标产物的量，尽可能几种底物和能量合
成目的产物，并且提高菌株生长繁殖速率，降低原
料消耗、缩短周期［51，52］。
3 展望
从我国的实际情况出发，在当前和今后相当长
的一段时间内，泰乐菌素仍将是我国禽畜养殖业用
于治疗禽畜支原体病的理想药物。目前，国内在泰
乐菌素的基础与应用研究方面滞后于国外，并且对
于泰乐菌素生产产量的提高，国内的大多研究只是
集中在工艺优化方面，因此，深入开展泰乐菌素菌
种选育工作是十分必要的。随着新的分子生物学技
术的开发和应用，以及泰乐菌素次级代谢途径的明
了，充分利用现有的基因工程技术和分子生物学手
段，通过改造泰乐菌素生物合成基因簇中其他基因，
如敲除负调控基因、增加正调控基因、增加抗性基因、
及修饰一些辅助基因等等方法来增加泰乐菌素的产
量。由此，分子育种将会开创弗氏链霉菌及微生物
次级代谢产物高产菌菌种选育的新局面。
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（责任编辑 狄艳红）