全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):228-235
随着世界人口的增加，对粮食需求的不断增长。
为增加农作物的产量，避免病虫害造成的损失，各
种农药的使用量也在逐渐增长。有机磷农药（Orga-
nophosphorus pesticides，OPS）是一类非常重要的农
药品种，全球已注册的 500 多种农药或农药代谢物
中，有机磷农药占有很大的比例［1］。目前，世界上
有机磷农药种类达 150 多种，我国生产的有机磷农
药品种有 20 余种，年产量超过 10 万 t，占我国农药
总产量的 80% 以上［2］。虽然有机磷农药的大量使用
提高了作物的产量，但由于有机磷农药的半衰期较
长，大量的农药会残留在水体和土壤环境中造成严
重污染［3-5］。水体、土壤及农产品中残留的有机磷
收稿日期 ：2015-03-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31170119），中国农业科学院基础研究基金项目（0042011006，0042012003，0042014011）
作者简介 ：贾阳，女，硕士，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：jia_yang@outlook.com
通讯作者 ：闫艳春，女，教授，研究方向 ：微生物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：yanyanchun@caas.cn
有机磷农药降解菌 YC-YH1 中 mpd 和 ophc2 的克隆及
酶学性质分析
贾阳  史延华  任磊  乔铖  王俊欢  闫艳春
（中国农业科学院研究生院，北京 100081）
摘 要 ： 从一株有机磷农药降解菌施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri YC-YH1 中克隆到两个有机磷水解酶基因 mpd 和 ophc2。
将两个基因分别连接到表达载体 pET-32a 并克隆到大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达 ；利用 Ni 亲和层析柱纯化甲基对硫磷水解酶
（MPH）和有机磷水解酶（OPHC2），并进行了酶学性质分析。MPH 最高活力的反应温度为 40℃，在 pH8-12 范围内，酶表现出
较高的活力。OPHC2 酶的最适反应温度为 30℃，在 pH 8-12 的范围内酶活力较高。两种酶按 11 比例混合组成的混合酶在 30-
40℃范围内酶活力很高，达 95% 以上，混合酶在 pH 范围为 8-12 内仍具有较高的活力。多种金属离子会对酶的活性产生一定影响，
酶对 SDS 和 EDTA 都有很高的敏感度，混合酶能够降低对金属离子的敏感性。
关键词 ： 有机磷水解酶基因 ；MPH ；OPHC2 ；纯化 ；酶学性质
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.030
Cloning and Characterization of mpd and ophc2 from an
Organophosphorus Pesticide-degrading Bacteria YC-YH1
Jia Yang Shi Yanhua Ren Lei Qiao Cheng Wang Junhuan Yan Yanchun
（Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: We cloned two organophosphorus hydrolase genes mpd and ophc2 from an organophosphorus pesticide-degrading bacteria
Pseudomonas stutzeri YC-YH1. The two genes were inserted into the expression vector pET-32a and transformed into E. coli BL21（DE3）
respectively. We used Ni-affinity column to purify enzymes and then study the nature of the two enzymes. It was suggested that the optimal
temperature of MPH is 40℃, and the MPH displays high activity in the pH range of 8 to 12. The optimal temperature of OPHC2 is 30℃. In the
pH ranging of 8 to12, OPHC2 has higher activity. The mixture of MPH and OPHC2 in the proportion of 11 showsed higher activity in the range
of 30℃ to 40℃, the enzyme showsed more than 95% activity in the range of pH8-12. A variety of metalions affect the activity of the enzymes
and the enzymes are sensitive to SDS and EDTA, but the compound could reduce the sensitivity to the metalions.
Key words: organophosphorus hydrolase gene ；MPH ；OPHC2 ；purification ；enzymatic property
2015,31(11) 229贾阳等 ：有机磷农药降解菌 YC-YH1 中 mpd 和 ophc2 的克隆及酶学性质分析
农药已对人们的健康安全带来极大威胁［6-8］。乙酰
胆碱（Acetylcholine，ACh）是一种神经递质，在神
经信号传导过程中发挥着重要作用。有机磷农药能
够抑制乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）
的活性从而使 ACh 不能降解而大量聚积进而对人体
产生毒性［9-11］。有研究表明，长期暴露于低剂量有
机磷环境下会造成机体多部位损伤，癌症、老年痴呆、
帕金森氏综合症和糖尿病等疾病都与包括有机磷农
药在内的环境污染物有关［12］。因此，消除环境中残
留的有机磷农药一直是人们关注的焦点。
有机磷农药的降解方式主要可分为化学降解、
物理降解和生物降解等［7，13，14］。生物降解是指通过
生物的作用将农药分解成小分子无毒的或者低毒的
化合物，并且最终降解为水、CO2 和矿物质的过程。
相对于物理、化学降解技术，生物降解特别是微生
物降解具有高效、操作简单、成本低、彻底、无二
次污染等诸多优点，目前对环境污染物的生物降解
已经成为研究的热点［15，16］。
微生物对有机磷农药的降解多是依靠酶促反
应进行，而利用纯化酶对农药尤其是低浓度农药的
降解效果远优于利用微生物本身，因为在农药浓度
较低的情况下，降解菌会优先利用其他碳源而不能
有效利用农药作为碳源，而降解酶的专一性高而且
不存在碳源的选择问题，因此降解效果不受碳源影
响，于是有机磷降解酶受到越来越多的关注［17］。到
目前为止，国内外的学者们已经分离了多种能够降
解有机磷的微生物，并且提取纯化了多种有机磷降
解 酶。1973 年，Sethunathan 等［18］ 从 水 稻 田 土 壤
中分离到了第一株能够降解二嗪农和对硫磷的黄杆
菌 Flavobacterium sp. ATCC 27551。1982 年，Serdar
等［19］ 发现了能够降解对硫磷的菌株 Pseudomonas
diminuta MG。2001 年， 崔 中 利 等［20］ 分 离 到 了 水
解甲基对硫磷的菌株 Plesiomonas sp. Stain M6，并克
隆到了 mpd 基因。2002 年，陈亚丽等［21］从农药污
染土样中分离出的一株能彻底降解甲基对硫磷的菌
株 Pseudomonas sp. WBC-3。2003 年， 楚 晓 娜 等［22］
从有机磷农药降解菌 Pseudomonas sp. WBC-3 中纯
化了甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，
MPH）并对酶性质进行了分析。2003 年，伍宁丰等［23］
从农药厂被污染的土壤中分离到了一株产有机磷水
解 酶（Organophosphorus hydrolase，OPH） 的 菌 株
Pseudomonas pseudoalcaligenes C2-1 并对其产生的有
机磷降解酶 OPHC2 进行了分离和纯化。
目前已报道的有机磷降解菌中只含有一种有机
磷降解酶基因，而本研究从一株有机磷农药降解菌
施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri YC-YH1 中同时克
隆到两种有机磷降解酶基因 mpd 和 ophc2。将两种
基因分别连接到表达载体并转化大肠杆菌进行表达，
研究了这两种降解酶各自的酶学特性及二者联合的
酶学特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主 要 试 剂 甲 基 对 硫 磷（Methyl parathion，
纯度 >99%）购自上海市农药研究所。对硝基苯酚
（p-Nitrophenol）（分析纯）购自天津市凯通化学试剂
有限公司。4×SDS 凝胶上样缓冲液低分子量标准蛋
白、限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接
酶、IPTG、DNA 片段纯化试剂盒购自宝生物工程（大
连）有限公司（TaKaRa）。氨苄青霉素购自 Amresco
公司。细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有
限公司。LB 培养基 ：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，
NaCl 10 g，去离子水 1 L，121℃灭菌 20 min。上样
缓 冲 液 ：Na2HPO4·12H2O 1.78 g，NaH2PO4·2H2O
1.38 g，NaCl 29.22 g，Imidazole 2.0 g， 去 离 子 水 至
1 L，pH7.4。洗脱缓冲液 ：Na2HPO4·12H2O 1.78 g，
NaH2PO4·2H2O 1.38 g，NaCl 29.22 g，Imidazole 34.0 g，
去离子水至 1 L，pH7.4。
1.1.2 菌株及质粒 本研究所用菌株为本实验室
分离的有机磷降解菌施氏假单胞菌（Pseudomonas
stutzeri）YC-YH1，在中国普通微生物菌种保藏管理
中心的保藏号为 CGMCC No. 9624。E.coli BL21（DE3）
购自天根生化科技有限公司。质粒 pET-32a 购自
Novagen 公司。
1.1.3 仪 器 AKTA avant 蛋 白 纯 化 系 统 配 Ni 柱
（HisTrapTM FF crude 1 mL），Tecan infinite 200 酶标仪，
Bio-Rad（PowerPacTM HV Power Supply）蛋白质电泳仪，
BRANSON 超声波仪器（DIGITAL SONIFIER 250）。
1.2 方法
1.2.1 mpd 和 ophc2 基因的克隆 根据施氏假单胞菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11230
Pseudomonas stutzeri YC-YH1 全基因组测序结果，用
Primer Premier 5.0 设计引物（表 1），引物 P1 和 P2
PCR 扩增 mpd 基因，引物 P3 和 P4 PCR 扩增 ophc2
基因。以 YC-YH1 菌株基因组 DNA 为模板，扩增目
的基因。PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 5 min，94℃
变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 20 s，进
行 30 个循环 ；72℃延伸 10 min ；10℃保存。扩增产
物用 DNA 片段纯化试剂盒纯化。
表 1 引物名称及序列
引物名称 序列（5-3）
P1 GCGCGGATCCATGCCCCTGAAGAACCGC
P2 GCGCGAGCTCGGGGTTGACGACC
P3 GCGCGGATCCATGCGTCTTTTCTCGCTG
P4 GCGCGAGCTCTCAGCGGTCGCTACGG
注 ：黑色下划线处的碱基为酶切位点
1.2.2 重组质粒的构建 将纯化后的 mpd 和 ophc2
用 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切，同时酶切载体 pET-32a，
用 DNA 片段纯化试剂盒回收，用 T4 DNA 连接酶将
酶切后 mpd 和 ophc2 分别与 pET-32a 质粒于 16℃过
夜连接，将连接产物转化 E.coli BL21（DE3）感受
态细胞，在含有 100 mg/L 氨苄青霉素的抗性平板上
筛选阳性克隆，提取质粒进行验证。
1.2.3 mpd 和 ophc2 基因的表达及蛋白纯化 将已
验 证 正 确 的 E.coli BL21（pET-mpd） 和 E.coli BL21
（pET-ophc2） 分 别 取 300 μL 接 种 到 30 mL 液 体 LB
培养基中，37℃下振荡培养 12 h。将培养后的菌液
取 4 mL 接 种 到 400 mL 液 体 LB 培 养 基 中，37℃，
200 r/min 振荡培养至菌液 OD600 达到 0.8，加入 IPTG
至 终 浓 度 1 mmo/L， 在 30℃，200 r/min 下 振 荡 培
养，诱导 3 h。然后 5 000 r/min 离心 8 min 收集菌体，
用 30 mL 上样缓冲液悬浮菌体后进行超声破碎。超
声功率为 20%，超声频率 ：超声 3 s，暂停 5 s，共
超声破碎 20 min。破碎完成后 12 000 r/min 离心 10
min，收集上清液进行纯化。
用 AKTA avant 蛋白纯化系统对蛋白进行纯化，
流速 1 mL/min，上样 26 mL，用洗脱缓冲液进行洗脱，
从第 4 mL 开始收集，收集 2 mL 蛋白洗脱液。
1.2.4 纯化蛋白的检测 使用 SDS-PAGE 对纯化的
蛋白进行纯度测定。配制浓度为 12% 的分离胶，浓
度为 5% 的浓缩胶，固定染色液为考马斯亮蓝 R-250
（含异丙醇 25%，乙酸 10%），脱色液含乙酸 10% 和
乙醇 5%。未诱导及诱导后的全细胞蛋白处理方法 ：
l mL 菌体细胞沉淀加入 20 μL 4×SDS 凝胶上样缓冲
液及 60 μL H2O，100℃加热 10 min 以充分裂解细胞，
12 000 r/min 离心 10 min 使细胞碎片及 DNA 等沉淀，
取适量溶液上样。纯化的 MPH 和 OPHC2 分别取 60
μL 加入 20 μL 4×SDS 凝胶上样缓冲液混匀，取适量
溶液上样。
1.2.5 酶的活性测定 取 1 μL 甲醇配制的浓度为
1×104 mg/L 的甲基对硫磷母液，1 μL 酶液，加入到
98 μL Tris-HCl（50 mmol/L，pH9.0） 中 混 匀，28℃
反应 2 min，然后用酶标仪检测溶液在 405 nm 下的
吸光度值。
有机磷降解酶的一个活性单位（U）定义为 ：
在 28℃条件下，每分钟降解 1 μmol 甲基对硫磷所
需酶量。在甲基对硫磷的降解过程中，甲基对硫磷
的消耗量与其降解产物对硝基苯酚的生成量之间为
11 的关系，所以本研究通过检测产生的对硝基苯
酚的量而得到甲基对硫磷被降解的量。
1.2.6 酶 学 性 质 的 测 定 分 别 以 纯 化 的 MPH、
OPHC2 以及二者按 11 比例混合的混合酶为材料，
在不同温度、pH 及不同金属离子下检测酶对甲基对
硫磷的降解效率，测定了其最适反应温度、最适 pH
及金属离子对酶活性的影响。
取 4 μL 甲醇配制的浓度为 1×104 mg/L 的甲基
对硫磷母液，1 μL 酶液，加入到 995 μL Tris-HCl（50
mmol/ L，pH9.0） 中 混 匀， 在 不 同 温 度（20、30、
40、50、60、70 和 80℃）下保温 30 min，检测溶液
在 405 nm 下的吸光度值；在不同 pH（3、4、5、6、7、
8、9、10、11 和 12）下进行酶促反应，测定了其最
适 pH，取 0.5 μL 酶液，1 μL 甲醇配制的浓度为 1×104
mg/L 的甲基对硫磷母液，加入到 98.5 μL Tris-HCl（50
mmol/ L，pH9.0）中混匀，28℃反应 30 min 后检测
405 nm 下的吸光度值 ；在酶促反应体系中分别加入
不同金属离子及化学试剂，各种化合物的终浓度为
1 mmol/L，28℃下反应 30 min 后检测 405 nm 下的吸
光度值，以研究不同金属离子及化学试剂对酶反应
的影响。
1.2.7 降解甲基对硫磷的动力学分析 将不同浓度
2015,31(11) 231贾阳等 ：有机磷农药降解菌 YC-YH1 中 mpd 和 ophc2 的克隆及酶学性质分析
的甲基对硫磷（25、50、100、200 和 400 mg/L）作
为底物，加入到 50 mmol/L Tris-HCl（pH9.0）缓冲
液体系中，在 28℃下测酶反应速度，按双倒数作图
法（Lineweaver-Burk 法）求 Km 和 Vm。
1.2.8 MPH 和 OPHC2 的比较分析 对几种常见的
有机磷农药降解酶基因基因进行分析，用 MEGA 5.2
构建系统进化树 ；用 Swiss-PdbViewer 4.1.0 对 MPH
和 OPHC2 蛋白结构进行分析。
2 结果
2.1 目的基因的获得与重组质粒的验证
以 Pseudomonas stutzeri YC-YH1 的 基 因 组 DNA
为模板，扩增获得两个目的基因，其大小与基因组
测序基因大小一致（图 1-A）。将扩增获得的 mpd 和
ophc2 基因片段纯化后，用 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ双酶
切，与载体 pET-32a 连接并转化 E.coli BL21（DE3），
在含有 100 mg/L 氨苄青霉素抗性平板上筛选转化
子，提取质粒酶切验证，并分别以 pET-mpd 和 pET-
ophc2 为模板进行 PCR 验证，与预测结果相符（图 1-B、
图 1-C）。
2.2 酶蛋白MPH和OPHC2的纯化
将未进行诱导的全细胞蛋白、诱导后的全细胞
蛋白及纯化后的 MPH 和 OPHC2 蛋白同时进行 SDS-
PAGE 电泳，结果证明纯化后的酶为单一条带（图 2）。
对纯化的酶进行蛋白定量，得到 MPH 浓度为 1.012
mg/mL，OPHC2 浓度为 1.028 9 mg/mL。
2.3 酶学性质的研究
2.3.1 MPH 酶和 OPHC2 酶反应最适温度 温度对
酶活力有重要影响，太高的温度会使得蛋白变性，
从而使酶失活，太低的温度又会降低酶的活性，因
此只有在最适温度下纯化酶才能发挥出最高活性。
MPH 酶在不同温度下具有不同的活性，MPH 对甲基
对硫磷的最适反应温度为 40℃左右。温度低于 40℃
时，酶的活性随着温度的升高而逐步上升，但超过
40℃酶活力迅速下降，到 80℃时酶已经失活。结果
表明此酶在室温下有较高的活性，但耐热能力较差，
高温时降解能力明显较弱。OPHC2 酶的最适反应温
度为 30℃左右。在 20-30℃的温度范围内，酶的活
力没有明显的变化，超过 30℃以后，酶的活力开始
下降，当超过 40℃后，酶活力会急剧下降，在 50℃
时只有室温时的 60%。混合酶的最适温度也在 30℃
左右，混合酶在室温时有较高的酶活，温度上升到
50℃时，酶活力下降到 60%，这与单一纯化酶相类
似（图 3）。
2.3.2 MPH 酶和 OPHC2 酶反应的最适 pH pH 值
1016 bp
A B
C
925
3472
6223
19329
bp
M 1 2 M 1 2 3 4
M 1 2 3 4
1243 bp
5900 bp
6890 bp
5888 bp
1002 bp
1016 bp
5900 bp7117 bp5888 bp
1229 bp 1243 bp
（A）M：λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA Marker；1：mpd PCR 产物；2：ophc2 PCR 产物；
（B）M ：λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA Marker ；1 ：pET-32a BamH Ⅰ 酶 切 ；2 ：
pET-mpd BamH Ⅰ 酶 切 ；3 ：pET-mpd BamH Ⅰ 和 Sac Ⅰ 酶 切 ；4 ：pET-mpd
的 PCR 验证 ；（C）M ：λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA Marker ；1 ：pET-32a BamH Ⅰ
酶切 ；2 ：pET-ophc2 BamH Ⅰ酶切 ；3 ：pET- ophc2 BamH Ⅰ和 Sac Ⅰ酶切 ；4 ：
pET- ophc2 的 PCR 验证
图 1 PCR 扩增结果及重组质粒验证结果
14.3
66.4
29.0
97.2
kD
M 1 2 3 4 5 6
34 KD 35 KD
M ：蛋白 Marker ；1 ：对照全细胞蛋白 ；2 ：诱导全细胞蛋白 ；3 ：纯化后
MPH ；4 ：对照全细胞蛋白 ；5 ：诱导全细胞蛋白 ；6 ：纯化后 OPHC2
图 2 MPH 及 OPHC2 纯化过程 SDS-PAGE 图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11232
能够对蛋白质的空间构象产生显著影响，过低或过
高的 pH 值均能够降低酶的活性甚至使酶失活，不
利于降解酶活性的发挥。降解酶通常只能在特定的
pH 值范围内具有活性。不同 pH 下酶活性测定结果
表明，两种酶都是在碱性环境中酶的活性较高，同
时都有很宽的 pH 酶解范围。MPH 的最适反应 pH
为 9，在 pH8-12 的范围内酶的相对活力均在 70%
以上，pH 为 7 时酶活力只有 40% 左右。OPHC2 酶
的 最 适 pH 为 10， 在 pH3-10 范 围 内， 随 着 pH 值
的增加，酶活一直呈增长状态，在 pH 为 10 时到达
最高值。在 pH8-12 的范围内，OPHC2 的酶活均在
70% 以上，而当 pH 为 7 时，酶活只有 50% 左右。
混合酶活力较高的 pH 范围仍是 8-12，pH8-10 范
围内酶活力在 90% 以上，pH 为 7 时酶活力下降到
50%（图 4）。
2.3.3 MPH、OPHC2 及混合酶的动力学参数 以甲
基对硫磷为底物，分别测定 MPH、OPHC2 及混合酶
的动力学参数，利用双倒数作图法，求取 K m 和 Vm
值，结果见表 2。
表 2 MPH、OPHC2 及混合酶的动力学参数
Km /（mmol·L
-1） Vmax/（mmol·L
-1·min-1）
MPH 0.23 0.03
OPHC2 0.15 0.06
混合酶 0.27 0.08
2.3.4 金属离子及有机试剂对酶活的影响 不同的
金属离子和有机试剂会对酶组分产生不同的影响，
从而促进或抑制酶的作用。由表 3 可以看出，有机
试剂 SDS 和 EDTA 对酶活的影响最大，是 MPH 和
OPHC2 的强变性剂。SDS 是一种表面活性剂，它是
两亲性分子，会使蛋白质变性，所以加入后酶会失
活；EDTA 是一种络合剂，可与金属离子形成络合物，
MPH 和 OPHC2 均金属酶，加入 EDTA 会与酶活性
中心的金属离子螯合，从而降低了酶的活性。不同
的金属离子会对酶的活性产生不同的影响。Co2+ 对
MPH 的活性有一定促进作用，但同时会对 OPHC2
的活性产生抑制作用。其他各种金属离子对 MPH
和 OPHC2 均表现出抑制作用，其中 Zn2+ 的抑制作
用最强。已有文献报道，MPH 活性中心的金属离子
为 Zn2+，晶体状态时每个活性中心的一个 Zn2+ 可被
Cd2+ 取代。OPHC2 的活性中心有 Zn2+ 还可能有 Co2+
或者 Fe2+。加入 Zn2+ 可能使得 Zn2+ 过量从而对酶的
活性产生强烈抑制。混合酶活性相对稳定，受各种
金属离子的影响较小，能够降低添加的金属离子对
酶活力的抑制作用。
2.4 MPH与OPHC2的比较分析
对常见的几种有机磷农药降解酶基因进行比较
分析，用 MEGA 5.2 构建系统进化树（图 5）。可见
mpd 和 ophc2 相似性较高，亲缘关系较近。
MPH 与 OPHC2 都属于 β-内酰胺酶，属于典型
的 β/α（TIM）折叠桶结构，活性位点均有两个金属
离子，其催化机制也类似。MPH 的晶体结构为同源
二聚体，包含 A，B 两条链；OPHC2 的晶体结构有 A、B、
C、D 和 E 5 条链，其中包括两个二聚体和一个单体
20
0.0
0.2
0.4⴨ሩ⍫࣋% 0.60.81.01.2
30 40 ⑙ᓖć50 60 70 80
MPH
OPHC2␧ਸ䞦
图 3 温度对酶反应的影响
2
0.0
0.2
0.4⴨ሩ⍫࣋% 0.60.81.01.2
4 6
pH
8 10 12
MPH
OPHC2␧ਸ䞦
图 4 pH 对酶反应的影响
2015,31(11) 233贾阳等 ：有机磷农药降解菌 YC-YH1 中 mpd 和 ophc2 的克隆及酶学性质分析
（图 6）。MPH 每个单体中含有 45 个氢键和 8 个盐桥。
OPHC2 单体的 N 端与另一单体相互作用，单体间相
互作用强烈，有 29 个氢键和 15 个盐桥，涉及 61 个
氨基酸残基。同时 OPHC2 的每个单体还有一个二硫
键（Cys110-Cys146），可能使 OPHC2 有更好的热稳
定性。
MPH 每个单体通过 Asp151、His152、His302、
His147、His149、His234 和 Asp255 与 两 个 金 属 离
子相连，一个 H2O 分子桥与两个金属离子相连，还
有一个 H2O 分子只与一个金属离子配位。OPHC2
单 体 中 的 两 个 金 属 离 子 α 和 β，His294、His144、
Asp143、Asp247 与 α 金 属 离 子 作 用，His226、
His139、His141 还有一个 H2O 分子与 β 离子作用。
用 Swiss-PdbViewer 4.1.0 对 MPH 和 OPHC2 的 单 体
进行分析（图 7），其三维结构相似性很高，与之前
表 3 不同金属离子及有机试剂对酶解反应的影响
离子
相对酶活力 /%
MPH OPHC2 混合酶
对照组 100 100 100
Pb2+ 52.10 32.63 41.02
Zn2+ 18.48 13.07 30.49
Ni2+ 59.87 45.19 85.20
K+ 46.41 72.58 68.46
Mg2+ 39.65 56.46 65.30
Cu2+ 69.70 31.60 57.16
Li+ 67.06 56.33 73.74
Al3+ 62.21 44.02 65.08
Co2+ 110.29 77.17 93.25
Cd2+ 57.37 54.95 72.25
SDS 1.60 0 0
EDTA 0 0 0
opd-2Pseudomonas diminuta MG
opdA-1Agrobacterium tumefaciens
opdA-2Agrobacterium radiobacter
mpdPseudomonas stutzeri YC-YH1
ophc2Pseudomonas stutzeri YC-YH1
ophArthrobacter sp. B-5
opaAAlteromonas
hocAProteus mirabilis
opdBSalmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium
0.2
opd-1Flavobacterium sp. ATCC27551
图 5 几种常见有机磷降解酶基因的系统进化树
A B
A ：MPH ；B ：OPHC2
图 6 MPH 与 OPHC2 三维结构图
的报道一致。由图 7 中可以看到，MPH 的 Gln173-
Phe178，Gln182-Asp186，Phe196-Ala210 形 成 3 个
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11234
α 螺 旋，Lys214-Phe216 形 成 β 折 叠， 此 段 区 域 在
OPHC2 中不存在，可能会对酶的性质有一定影响。
3 讨论
本研究将来源于施氏假单胞菌 YC-YH1 的 mpd
和 ophc2 基因克隆到大肠杆菌中，并成功进行了诱
导表达，得到了有功能活性的蛋白，通过亲和层析
的方法对蛋白进行纯化，得到了高纯度高浓度的目
的蛋白，对单一纯化酶和混合酶的酶学性质进行了
初步研究。
楚晓娜等［22］报道其纯化的的 MPH 在 pH9-12
范围内能够表现出较高的活力水平，最高活力的反
应温度为 40℃。在本研究中纯化的 MPH 的最适反
应温度也为 40℃，最适 pH 为 9，在 pH9-12 范围酶
活力同样较高。伍宁丰等对纯化的 OPHC2 进行酶学
性质分析，其降解甲基对硫磷的最适温度为 65℃，
最适 pH 为 9［24］，本研究中纯化的 OPHC2 最适反
应温度为 30℃，更加接近自然环境温度，最适 pH
为 10，在 pH8-12 范围内酶活一直较高，具有较好
的 pH 适应性。MPH 和 OPHC2 组成的混合酶在 30-
40℃范围内具有很高的酶活性，在 pH9-10 范围内
其活力仍保持在最高水平。可以看出混合酶能够更
好地适应小范围内温度和 pH 的变化，使酶活力保
持在最高水平。不同金属离子及化学试剂对两种酶
的的活性都有一定影响，很多金属离子都会降低酶
的活性，SDS 和 EDTA 会使酶完全失活。比较二者
对底物甲基对硫磷的降解效率发现，MPH 对甲基对
硫磷的亲和力高于 OPHC2，而 OPHC2 对甲基对硫
磷的降解最大速率高于 MPH。混合酶对甲基对硫磷
亲和力虽然降低，但最大反应速率明显升高。
MPH 与 OPHC2 酶性质相似，OPHC2 的结构表
明其更强的热稳定性［25］。通过对酶性质的研究，可
以根据其特点定向对酶进行改造，提高降解效率和
稳定性。酶工程正在迅速发展，也逐渐应用到人们
的生活中。利用酶的进化和改造，使其应用到解决
农药污染和环境防治中具有十分重要的意义。
4 结论
株 有 机 磷 降 解 菌 施 氏 假 单 胞 菌 Pseudomonas
stetzeri YC-YH1 中产生的两种降解酶 MPH 和 OPHC2
性质相似，共同作用时混合酶比单一的降解酶具有
更好的温度和 pH 适应性，对金属离子和有机试剂
的抑制作用也具有较强的抗性，同时最高反应速率
也显著增大。
参 考 文 献
［1］Wu L, Yao J, Polonca T, et al. Compound specific isotope analysis of
organophosphorus pesticides［J］. Chemosphere, 2014, 111 ：458-
463.
［2］刘建利 . 有机磷农药降解酶的研究进展［J］. 广东农业科学 ,
2010（1）：60-64.
［3］Ahire KC, Kapadnis BP, Kulkarni GJ, et al. Biodegradation of
tributyl phosphate by novel bacteria isolated from enrichment
cultures［J］. Biodegradation, 2012, 23（1）：165-176.
［4］Rovedatti MG, Castané PM, Topalián ML, et al. Monitoring of
organochlorine and organophosphorus pesticides in the water of the
Reconquista River（Buenos Aires, Argentina）［J］. Water Res,
2001, 35（14）：3457-3461.
A B C
A ：MPH 单体 ；B ：OPHC2 单体 ；C ：MPH 单体与 OPHC2 单体重叠比较
图 7 MPH 与 OPHC2 单体三维结构比较
2015,31(11) 235贾阳等 ：有机磷农药降解菌 YC-YH1 中 mpd 和 ophc2 的克隆及酶学性质分析
［5］谷月 , 姜华 . 农药污染土壤的微生物降解［J］. 辽宁农业科学 ,
2013（4）：52-55.
［6］Xie J, Zhao Y, Zhang H, et al. Improving methyl parathion hydrolase
to enhance its chlorpyrifos-hydrolysing efficiency［J］. Lett Appl
Microbiol, 2014, 58（1）：53-59.
［7］王燕 , 刘建峰 , 刘振华 , 等 . 环境中有机磷农药微生物降解技术
的研究进展［J］. 安徽农业科学 , 2013, 41（16）：7163-7164.
［8］Fu G, Cui Z, Huang T, et al. Expression, purification, and
characterization of a novel methyl parathion hydrolase［J］. Protein
Expression and Purification, 2004, 36（2）：170-176.
［9］Zhao X, Kong W, Wei J, et al. Gas chromatography with flame
photometric detection of 31 organophosphorus pesticide residues in
Alpinia oxyphylla dried fruits［J］. Food Chemistry, 2014, 162 ：
270-276.
［10］张呈祥 , 侯明 , 鲍海咏 , 等 . 急性有机磷农药中毒的相关进
展［J］. 青海师范大学学报 ：自然科学版 , 2012, 28（1）：54-
61.
［11］赵敏 , 陈良宏 , 张志刚 , 等 . 有机磷农药中毒机制和治疗新进
展［J］. 中国实用内科杂志 , 2014, 34（11）：1064-1068.
［12］张宇童 , 杨兆娜 , 谢飞 , 等 . 有机磷农药神经发育毒性作用机
制研究进展［J］. 安徽农业科学 , 2014, 42（12）：3561-3564.
［13］李松桧 , 李日强 . 有机磷农药生物降解的研究进展［J］. 科技
情报开发与经济 , 2008（2）：123-124.
［14］金潇 , 颜冬云 , 秦文秀 . 有机磷农药的微生物降解技术［J］.
湖南农业科学 , 2011（9）：93-97.
［15］刘建利 . 利用微生物降解农药污染［J］. 生物学教学 , 2010,
35（4）：5-9.
［16］龙致科 , 胡永志 , 王韧 , 等 , 农药降解酶在果蔬清洗剂中的应
用探讨［J］. 中国洗涤用品工业 , 2014（2）：78-80.
［17］王晓辉 , 杜利平 , 赵丽霞 . 有机磷农药生物降解研究进展［J］.
河北工业科技 , 2008, 25（6）：405-409.
［18］ 汤鸣强 . 三唑磷降解菌的分离鉴定及其降解酶特性的研
究［D］. 福州 ：福建农林大学 , 2012.
［19］ Serdar CM, Gibson DT, Munnecke DM, et al. Plasmid involvement
in parathion hydrolysis by Pseudomonas diminuta［J］. Applied
and Environmental Microbiology, 1982, 44（1）：246-249.
［20］Cui Z, Li S, Fu G, et al. Isolation of methyl parathion-degrading
strain M6 and cloning of the methyl parathion hydrolase gene［J］.
Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67（10）：4922-
4925.
［21］陈亚丽 , 张先恩 , 刘虹 , 等 . 甲基对硫磷降解菌假单胞菌
WBC-3 的筛选及其降解性能的研究［J］. 微生物学报 , 2002,
42（4）：490-497.
［22］楚晓娜 , 张先恩 , 陈亚丽 , 等 . 假单胞菌 WBC-3 甲基对硫磷水
解酶性质的初步研究［J］. 微生物学报 , 2003, 43（4）：453-
459.
［23］ 伍宁丰 , 邓敏捷 , 史秀云 , 等 . 一种新的有机磷降解酶的分离
纯化及酶学性质研究［J］. 科学通报 , 2003, 48（23）：2446-
2450.
［24］Su Y, Tian J, Wang P, et al. Improving the thermostability of a
methyl parathion hydrolase by adding the ionic bond on protein
surface［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2011, 165 ：989-997.
［25］Gotthard G, Hiblot J, Gonzalez D, et al. Structural and enzymatic
characterization of the phosphotrieterase OPHC2 from Pseudomonas
pseudoalcaligenes［J］. PLoS One, 2013, 8（11）：e77995. doi ：
10. 1371/journal. pone. 0077995.
（责任编辑 狄艳红）