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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
乳腺炎（Mastitis）是造成奶牛业经济损失的重
要疾病，乳腺炎的发生也影响奶制品的质量。金黄
色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常见和最重
要的乳腺炎致病菌之一，乳腺炎奶牛乳导管和乳腺
组织中金黄色葡萄球菌的分离率可达 40%-70%［1］。
目前乳腺炎疫苗的研制仍然是奶牛业生产中亟待解
决的问题之一。金黄色葡萄球菌黏附到乳头管被认
为是乳腺感染的第一步［2］，对其致病性至关重要。
黏附的过程中有多种黏附因子参与［3，4］，纤连素
收稿日期 ：2012-09-21
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31160191，31260222），新疆维吾尔自治区普通高校重点学科基础兽医学科项目
作者简介 ：苏艳，女，副教授，研究方向 ：细菌分子致病和免疫 ；E-mail ：2006au @163.com
重组牛乳源金黄色葡萄球菌黏附因子 FnbpA
A 功能区的表达与鉴定
苏艳1  王世民1  李莹1  韦海娜1  邵俊高1  张宝江1  殷涛2 
（1. 新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052 ；2. 新疆兵团兽医总站，乌鲁木齐 830000）
摘 要： 黏附素分子 FnbpA（纤连蛋白结合蛋白 A，fibronectin binding protein A）是金黄色葡萄球菌感染早期最重要的致病因
子，也是一个重要的免疫靶标。由于不同地区流行的菌株产生的黏附素有一定的差异，将分离自新疆地区奶牛乳源金黄色葡萄球
菌黏附素分子 FnbpA 的 A 功能区亚克隆至 pGEX 原核表达载体并转入 BL21 中诱导表达，SDS-PAGE 分析表明，切除 GST 标签后
在 63 kD 处出现特异性条带。纯化切除 GST 标签的蛋白经弗氏佐剂乳化免疫试验兔。ELISA 方法检测免疫兔的抗体效价并评估抗
体和葡萄球菌结合能力，结果表明，目的蛋白的抗体效价可达 6.7×106，并可在体外识别菌体抗原。
关键词 ： 金黄色葡萄球菌 FnbpA 原核表达 蛋白纯化 免疫原性 ELISA
Expression and Identification of Recombinant A Domain of Adhesin
Fnbp A from Staphylococcus aureus in Bovine Milk
Su Yan1 Wang Shimin1 Li Ying1 Wei Haina1 Shao Jungao1 Zhang Baojiang1 Yin Tao2
（1. College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052 ；
2. Xinjiang Corps Veterinary Station，Urumqi 830000）
Abstract:  Fibronectin binding protein A plays an important role in Staphylococcus aureus early infection, and is also a potential target
of immunization. We subcloned the A domain of FnbpA into the prokaryotic expression vector pGEX and transformed it to the BL21 host cell.
After removing the GST tag the purified purpose protein was analyzed by SDS-PAGE and approximately 63 kD exogenous protein was observed
by SDS-PAGE. The purified protein without GST tag was emulsified by Freund’s adjuvant and injected rabbits subcutaneously to produce
hyperimmune serum. The antibody titer and the binding capacity between the S. aureus and rabbit serum were tested by ELISA. The result
indicated the antibody titer could reach 6.7×106 and the antibody could recognize the antigen of S. aureus in vitro.
Key words:  S. aureus FnbpA Prokaryotic expression Protein purification Immunogenicity ELISA
中的纤粘连结合蛋白（fibronectin-binding protein A，
FnbpA）是重要的黏附素之一，它能够介导金葡菌
结合于细胞表面的纤维连结素与纤维蛋白原，促进
细菌对寄主组织的侵入。抑制其活性后可在早期切
断金黄色葡萄球菌感染的途径［5］。已有研究证明抑
制该菌的黏附功能可部分保护实验动物抵抗金黄色
葡萄球菌的感染［6，7］。
FnbpA 蛋白有多个功能区，目前最受关注的有
两个的功能区 ：一个是能够结合机体组织纤连蛋白
2013年第4期 137苏艳等 ：重组牛乳源金黄色葡萄球菌黏附因子 FnbpA A 功能区的表达与鉴定
（Fibronectin，Fn）和纤维蛋白（Fibrinogen，Fg）的
A 区。另一个是能够和纤连蛋白结合的由 11 或 12
个重复序列组成的 D 区［8］。目前还发现不同地区流
行菌株黏附素具有其各自的特点，我们前期对本地
流行菌株的分子流行病学调查表明新疆地区流行的
菌株具有一定的地域特征［9］。本研究对从新疆几个
大型奶牛场分离鉴定的金黄色葡萄球菌 FnbpA 蛋白
A 区部分片段进行诱导表达，将表达产物分离纯化
后免疫试验兔，测定其免疫原性并验证高免血清与
葡萄球菌产生的 FnbpA 的结合能力，旨在为流行于
新疆地区的金黄色葡萄球菌 FnbpA 基因工程亚单位
疫苗的研制和本地区奶牛乳腺炎的预防提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种及质粒 金黄色葡萄球菌菌株、DH5α、
BL21（DE3）、 质 粒 pMD-Fn、pGEX-4T-2 均 由 新 疆
农业大学微生物实验室保存。
1.1.2 试验动物 成年新西兰白兔（2.5 kg）由新疆
乌鲁木齐疾病防治与控制中心实验动物部提供。按
要求饲养于洁净环境，试验随机分成 2 组，每组 4 只。
1.1.3 主要试剂 LA Taq DNA 聚合酶、pMD18-T 载
体、DNA Marker、中等分子量蛋白 Marker 均购自大
连宝生物工程有限公司。T4 DNA 连接酶、限制性内
切酶 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ均购自 Promega 公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的克隆 设计的 FnbpA 基因引物 ：
上游引物 5-GCGGAATTCCCACTAACGTTAATCATA-
T-3，下游引物 5-TATTCTCGAGATTCAATGTATCC-
GTC-3， 下 划 线 分 别 为 EcoR Ⅰ 和 Xho Ⅰ 酶 切 位
点。PCR 反应体系为 ：重组质粒 pMD-Fn，0.5 μL ；
10×LA PCR Buffer 5 μL ；dNTPs（2.5 mmol/L）5
μL ；上游引物（50 pmol/μL）0.5 μL ；下游引物（50
pmol/μL）0.5 μL ；LA Taq DNA 聚合酶 0.3 μL ；灭菌
去离子水补至 50 μL。PCR 扩增循环参数 ：95℃预
变性 5 min ；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30
个循环 ；72℃延伸 10 min。扩增完成后，1% 琼脂糖
凝胶电泳检测。
1.2.2 FnbpA 重组表达载体的构建及酶切鉴定 PCR
产物经纯化后与 pGEX-4T-2 质粒分别经 EcoR Ⅰ、
Xho Ⅰ双酶切。酶切体系 ：PCR 产物 10 μL，2.5 μL
EcoR Ⅰ（10 U/mL）、2.5 μL Xho Ⅰ（10 U/mL）、5
μL 10×Buffer，灭菌水补至 50 μL。酶切后进行连接。
将连接好的产物转入 DH5α 感受态细胞，筛选阳性
菌落，提取质粒酶切鉴定后测序。测序正确的质粒
pGEX-Fn 用于表达。
1.2.3 重组蛋白的诱导及表达 将 pGEX-Fn 质粒转
入 BL21（DE3）细胞中，接种于新鲜 LB 培养基中
37℃培养。用终浓度为 0.4 mmol/L 的 IPTG 诱导表达。
6 h 结束诱导，SDS-PAGE 电泳检测重组蛋白的表达。
1.2.4 重组蛋白的纯化 将表达和收获的重组蛋白
产物用 GST 琼脂糖凝胶柱和终浓度 10 U/mL 凝血酶
进行酶切纯化和切标签。用 PBS 洗涤杂蛋白后，回
收纯化蛋白并用 BCA 法对蛋白定量。
1.2.5 重 组 蛋 白 免 疫 试 验 动 物 及 抗 体 效 价 的 检
测 免疫试验分两组进行，试验组 1 为重组蛋白免
疫组，试验组 2 为 PBS 对照组。将纯化的蛋白与等
体积弗氏完全佐剂混匀充分乳化。成年新西兰白兔
通过背部皮下多点注射法接种 200 μg 重组蛋白，对
照组 200 μL PBS 液。初免后 15 d 进行加强免疫，30
d 进行三免。
免疫前及首免后 10 d，二免后 10 d，三免后 10
d 分别采血收集血清，用重组 FnbpA 蛋白做包被抗原，
间接 ELISA 法检测血清中抗 FnbpA 蛋白的抗体效价，
抗体效价的测定按文献［11］的方法进行。
1.2.6 重组蛋白的 Western blot 检测 诱导表达重组
蛋白经 SDS-PAGE 电泳转至 NC 膜，用重组蛋白免
疫试验兔产生的抗体检测其与重组蛋白的免疫反应。
1.2.7 间接 ELISA 检测抗体对细菌抗原的识别 将
生长对数期的金黄色葡萄球菌，用 PBST 洗涤 3 次
并煮沸灭活，第一孔吸入 100 μL 样品，进行 10 倍
梯度稀释，ELISA 板上经 4℃过夜包被。相同体积
的 PBST 为阴性对照，用 2% 脱脂奶粉 37℃温育 1 h
进行封闭。1∶1 000 倍稀释三免血清，37℃温育 2 h，
PBST 洗涤 5 次，1∶4 000 倍稀释的羊抗兔酶标二抗
37℃温育 1 h，PBST 洗涤 5 次，TMB 显色液室温显
色 30 min 终止。OD450nm 检测结果。
2 结果
2.1 目的基因克隆结果
PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳，扩增电
泳目的条带约 1 700 bp（图 1），与预期结果相符。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期138
清效价为 4 个试验动物的平均值）。检测结果（图 4）
表明，三免后血清效价可达 6.7×106。
Ｍ ：DL2000 Marker ；１ ：PCR 产物
图 1 FnbpA 基因的 PCR 扩增
M1：DL15000 Marker；1-3：构建的 pGEX-Fn 重组质粒双酶切产物；
M2 ：DL2000 Marker
图 2 重组质粒 PGEX-Fn 的双酶切鉴定
1 ：阴性对照 ；M ：中分子量蛋白 Marker ；2 ：纯化的目的蛋白
图 3 纯化目的蛋白的 SDS-PAGE 电泳检测
2000
bp
M 1
1000
2.2 pGEX-Fn 质粒双酶切鉴定结果
随 机 选 择 3 个 阳 性 克 隆 小 量 提 取 质 粒， 经
EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，将酶切产物 1% 琼脂糖
凝胶电泳，结果（图 2）显示，电泳带位于 5 000 bp
和 1 700 bp 附近，与预期结果相符。
15000
bp bp
M1 1 2 3 M2
2000
1000
5000
2.3 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE电泳检测
纯化后的蛋白电泳条带在 63 kD 附近，与预期
相符（图 3）。经改良型 BCA 法对纯化蛋白进行浓度
测定，纯化蛋白的浓度为 0.5 mg/mL。
97.2
kD
1 M 2
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
** 表示差异极显著（P<0.01）
图 4 试验兔免疫后血清抗体效价的检测
PBSሩ➗㓴
FnBPA䈅傼㓴
8
7
6
5
4
3
2㹰␵
〰䟺
ᓖL
og
10

1
0 ݽ⯛ࡽ аݽ Ҽݽ йݽ
2.6 高免血清对金黄色葡萄球菌的结合能力
用菌液包被 ELISA 板后间接 ELISA 的试验结果
（图 6）表明，随着包被菌液浓度的降低，OD 值随
之降低，呈正相关，说明试验兔的免疫血清和细菌
有特异结合能力。
3 讨论
多数研究者认为 FnbpA 的 D 区（羧基端的 3-4
个重复序列）保守性较高，且对 Fn 有较强的结合力，
被认为适合做疫苗。史冬梅等［10］对 FnbpB 的 D 区
所编码蛋白产生的抗体功能进行了相关研究。国内
范鑫等［11］用 FnbpB 的 D 区羧基端的 4 个重复序列
和 ClfA 的 A 区串联作为靶基因做相关研究。目前的
研究又发现具有 Fn 结合能力的 D 区产生的抗体绝
120
kD1 2 M
85
60
40
M ：预染蛋白分子量标准 ；1 ：未诱导的对照与免疫兔血清的反应 ；
2 ：重组蛋白与免疫兔血清的反应
图 5 重组蛋白的 Western blot 检测
2.4 重组蛋白免疫试验兔后抗血清的效价
ELISA 板用 100 ng 纯化蛋白 / 孔 4℃包被过夜。
血清经倍比稀释检测免疫前及免疫后血清的效价（血
2.5 重组蛋白的Western blot检测
Western blot 检测的结果（图 5）表明，重组融
合蛋白能与免疫兔产生的抗重组蛋白的抗体发生特
异性的结合反应。
2013年第4期 139苏艳等 ：重组牛乳源金黄色葡萄球菌黏附因子 FnbpA A 功能区的表达与鉴定
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（责任编辑 马鑫）
3.0
2.5
1.5
O
D
45
0
0.5
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100ؽ〰䟺㓴 1000ؽ〰䟺㓴0
1.0
2.0
图 6 目的蛋白的功能试验
大多数不能和 FnbpA 无定型的重复序列结合，只有
当无定型的重复序列与 Fn 结合后，此抗体才能与其
结合［11］。因此 D 区产生的抗体不但不能阻断细菌
的侵入，反而使重复序列和 Fn 的结合更加稳定，这
对免疫保护来说是不利的［13］。此外 D 区片段过小，
并且没有固定的二级结构。因此对于动物机体的免
疫保护来说，需要重新评估 D 区的作用。FnbpA 的
A 区也是人们关注的重要功能区。A 区片段较大，
二级结构稳定，适合做免疫原。目前，国外报道
FnbpA 的 A 区至少有 7 个亚型，且不同的亚型之间
也有地区差异性。以往研究表明 FnbpA 与 FnbpB 具
有较高的同源性。因此本研究选取新疆地区 FnbpA
的 A 区作为抗原表位研究本地区流行菌株的免疫原
性，期望为本地区该病的防治提供试验基础。
4 结论
本试验成功构建新疆地区牛乳源金葡菌 FnbpA
的 A 区的原核表达载体，诱导表达目的蛋白经试验
兔经皮下免疫 3 次后抗体效价可达 6.7×106。不同
浓度的金黄色葡萄球菌菌体做包被抗原，FnbpA 的
A 区部分片段免疫动物产生的抗体具有与对数期的
金黄色葡萄球菌结合的能力。
参 考 文 献
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