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重组腺相关病毒载体的研究进展



全 文 :·综述与专论· 2012年第11期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是
一种常见的自然缺陷、无包被和无致病性的人细小
病毒。2 型 AAV 是其中最早获得的病毒,并且大多
数的突变体是在 AAV-2 的基础上发现的。目前 AAV
在基因治疗上应用广泛,但是只有 AAV-2 在临床上
应用较多[1]。重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治
疗的工具具有以下几个优点 :(1)无致病性。(2)
能在转染的宿主细胞长期表达。(3)具有低免疫原性。
(4)可以感染多种细胞,而且不受细胞分化的影响。
这些特点正是 rAAV 可以作为基因治疗的条件。下
面就 rAAV 载体的研究进展作一下综述。
1 AAV 的生物学特性
AAV 是最小的动物 DNA 病毒之一,直径大约
20 nm。AAV 基因组是一个线性、单链 DNA(ssDNA),
大小为 4.7 kb,左右两侧面有 145 bp 的反向末端重
复序列(ITR)[2]。ITR 来源于野生型的腺相关病毒
收稿日期 : 2012-05-03
作者简介 : 邱燕 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物传染病及其分子流行病学 ; E-mail: 442114741@qq.com
通讯作者 : 柳纪省 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 动物传染病及其分子流行病学 ; E-mail: liujixing@hotmail.com
重组腺相关病毒载体的研究进展
邱燕  杨彬  柳纪省
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原微生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: 重组腺相关病毒(rAAV)载体作为基因治疗的工具,具有无致病性、长期表达、低免疫原性和感染多种细胞等特点。
因此,rAAV 载体越来越受到重视。就 rAAV 载体在生物学特性、构建、安全性和应用方面作一介绍。
关键词 : 重组腺相关病毒 载体 生物学特性 构建 安全性 应用
Research Development of the Recombinant Adeno-associated
Virus Vector
Qiu Yan Yang Bin Liu Jixing
(Key Laboratory of Veterinary Public Health of the Ministry of Agriculture/State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou
Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046)
Abstract:  As the tool of gene therapy, recombinant adeno-associated virus(rAAV)has no pathoiesia , long-term expression and low
immunogenicity, which infect many kinds of cells. So rAAV is paid more and more attentions. The Biological characteristics, construction, safety
and application of rAAV were reviewed in this paper.
Key words:  Recombinant adeno-associated virus(rAAV) Vector Biological characteristics Construction Safety Application
(wild-type adeno-associated virus,wtAAV), 对 于 病
毒的复制、包装和 DNA 整合起重要。开头的 125 个
核苷酸形成回文序列作为复制开始的启动元件,能
够自我向后折叠形成发夹结构,是 AAV 生活周期中
唯一的顺式调控元件。内部编码区域包括两个主要
的开放读码框(ORFs)。左边 ORF 基因编码复制蛋
白(Rep),右边 ORF 编码结构蛋白(Cap)。左侧的
ORF 包 括 P5、P19 启 动 子。Rep 蛋 白 与 AAV 基 因
的表达自我调控、异源性启动子的抑制和癌基因放
大作用的抑制、病毒的复制、包装和基因的表达调
控有关。右侧的 ORF 包含 P40 启动子,能够通过不
同的翻译起始子编码生成病毒结构蛋白 VP1、VP2、
VP3,这些结构蛋白用于病毒衣壳的组装。
目前,已从啮齿类、非人的灵长类和人类组织
中发现 AAV 有 14 个血清型和多种变异体[3-5]。许
多不同血清型的 AAV 进入宿主细胞的方式多种多
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期50
样,这也导致了不同血清型的 AAV 对宿主细胞的选
择不同[2]。AAV 载体在 2 型衣壳的基础上改造,是
基因治疗中最常用的载体。在人群中检测发现 70%-
80% 的人感染了 AAV[6]。AAV 可以感染多种细胞,
如肌肉、肝脏、大脑、视网膜和肺等。病毒颗粒由
二十面体的衣壳蛋白组成,密度 1.41 g/cm。AAV 很
稳定,对极端的 pH 环境、清洁剂和温度有很强的
耐受力[7]。
2 rAAV 载体的构建及纯化
最早被用作基因治疗的是 AAV-2,且至今该
亚型的特点被阐述得最多,是大部分导入基因研究
的基础。但是最近几十年,成套的 rAAV 系统来自
自然发生的血清型和混合的血清型[8],血清型间
呈现十分相似的结构,不同的趋向性和免疫学的特
性。AAV 是自然复制缺陷病毒,需要依靠辅助病毒
来完成复制循环。能够提供辅助功能的病毒有腺病
毒(AV)、单纯疱疹病毒(HSV-1)、牛痘病毒(CPV
和胞病毒(CMV)。在辅助病毒的存在下,AAV 基
因就整合到宿主基因中并以原病毒的形式持续潜伏。
在辅助病毒的存在下,AAV 基因能激活病毒的复制,
包装 DNA 并形成衣壳蛋白。因为 AAV 自身在自然
感染过程中不产生细胞溶解酶,所以要依靠辅助病
毒。wtAAV 能够整合到人的 19 号染色体的特定位点
的特性,这一点在 AAV-2 上已有较多描述。但因病
毒基因的改变导致 rAAV 缺少大量的编码 Rep 蛋白
的基因,所以在重组的载体上没有这种特性[9]。
rAAV 的 构 建 通 常 涉 及 到 将 目 的 基 因 插 入 到
ITR 元件之间和 Rep、Cap 基因的剔除。传统的转
染方法利用两种质粒,一种含有 rAAV 载体,一种
有 Rep/Cap 基 因 的 质 粒 共 转 染 HEK-293、A549 或
HeLa 细胞,之后感染辅助病毒(大多数的情况下需
要 wtAd)产生 rAAV。因此,辅助病毒可以被带有
腺病毒(Ad)在 rAAV 复制时必须需要的基因 E2A、
E4 和 VA 的辅助质粒所替代,其他的必须功能可由
HEK-293 细胞提供 Ad 提供的 E1A 和 E1B。当利用
HeLa 或 A549 细胞时,辅助质粒必须提供必要的功
能,包括 Ad 基因 E1A、E1B[10]。利用辅助质粒的
生产 AAV 依靠与各自带有 Rep、Cap 基因和腺病毒
辅助基因的质粒共转染 HEK-293 细胞,在培养 48-
72 h 后收获。提高转染的方法是利用两种质粒系统,
因为可以产生含有 AAV Rep 和 Cap 基因的包装质粒
和 Ad 辅助功能的质粒。这样可以比传统的方法提
高 10 倍的 rAAV 载体的滴度。
随着 AAV 血清型的发现和发展,从这些亚型
上发展载体的方法快速出现[11]。基本上所有的载体
都是基于 AAV-2 的 ITRs,部分或全部的 Rep 基因,
只有衣壳是来自感兴趣的血清型[12]。但是以上的生
产体系不能满足现实临床对病毒的需要量。因此,
2002 年 Kotin 等[13]利用昆虫细胞(Sf9 cell)/ 杆状
病毒系统(baculovirus)已经能够大量生产 AAV 载体。
这也为后来的临床治疗打下基础。rAAV 在目前纯化
方面仍然缺乏高效、简便、低成本的方法。常用的
是采用硫酸铵浓缩、氯化铯密度梯度离心进行纯化。
但是这些方法繁琐且回收率低。吴小兵等[14]利用 2
型 AAV 能够抵抗氯仿的特性,采用氯仿处理 -PEG/
NaCl 沉淀 - 氯仿抽提 3 个步骤为 rAAV 的纯化提供
了新的方法。李桂林等[15]通过氯仿 -PEG8000/NaCl-
氯仿法结合超滤纯化病毒获得无腺病毒和氯化铯污
染的 rAAV。
3 rAAV 的安全性
Rep 蛋白具有杀细胞毒性及细胞生长抑制的
作用,且在 wtAAV 定点整合到人的 19 号染色体上
起关键作用。rAAV 因为 Rep 基因的剔除,不能像
wtAAV 一样进行定点整合。rAAV 与宿主染色的整
合是一种随机整合。rAAV 的序列在转导组织的整
合通过载体 DNA 与转导的肝细胞的中期染色体荧光
原位杂交证明了整合的随机性[16]。rAAV 的随机整
合能整合到宿主的任何一条染色体上,会引起宿主
染色体的缺失、插入等一系列核酸水平的改变,而
这也成了在基因治疗中潜在的威胁。Nakai 等[17]的
试验发现,rAAV 的整合中有部分会发生在 9 个癌
相关基因上或其临近区域。这一研究结果让人们对
rAAV 载体临床应用上安全性的担忧,虽然在临床上
尚未发现任何因为 rAAV 基因药物随机整合而引起
基因失活或者癌症发生[18]。目前大多数的试验证明
rAAV 基因药物在鼠类、大型动物及灵长类动物体
内能够长期表达且无致癌性。随着人们对 wtAAV 及
rAAV 载体整合机理研究的深入,真正引起癌症的原
2012年第11期 51邱燕等 :重组腺相关病毒载体的研究进展
因会得到研究和证明。wtAAV 整合效率较低,在动
物水平研究发现整合率为 0.1%-0.5%。而 rAAV 的
整合效率因载体血清型、宿主种群、组织细胞和试
验方法的不同而有所差异[19]。
rAAV 载体已经证明能够转染很多种细胞,而
且 rAAV 的转导效率和表达量并不受分裂或未分裂
细胞的影响[20]。AAV 能包装的目的基因大小有限。
基因较小的 rAAV 能够有效的包装,但是基因大于 5.2
kb 时不适于构建 rAAV。所以用于克隆的基因不能
大于 2 kb。rAAV 能否转入给定的靶细胞需要 3 个必
须条件 :(1)rAAV 与靶细胞接触,随后附着、相互
作用,核酸转入;(2)核酸能有效的转换成双链;(3)
无论是附加型还是整合型,转入的 rAAV 能够充分
表达。AAV 的血清型不同,靶细胞也有所差异。例如,
rAAV-1 比 rAAV-2 在转导的肌肉、胰岛、心脏、血
管内皮、中枢神经系统和肝细胞更能有效表达。但
是 rAAV-3 更适合在耳蜗内的毛细胞转导,rAAV-4
适合在脑组织转导,rAAV-5 适合在中枢神经、眼睛、
关节连接处和肝脏细胞内转导,rAAV-6 适合在肌肉、
心脏和气管上皮组织转导,rAAV-7 适合在肌肉转导,
rAAV-8 适合在肌肉、胰腺、心脏和肝脏中转导[21-26]。
rAAV 与其他大多数的病毒或非病毒载体介导的基因
治疗相比,rAAV 介导的目的基因能在体内长期持续
的表达。有试验证明 rAA 介导的目的基因能在肌肉
和肝脏内持续表达高达 3 年以上[27]。目的基因的长
期有效表达也说明了 rAAV 是作为治疗慢性病的有
力工具。
机体对 rAAV 的免疫主要有两个方面 :先天性
免疫反应和适应性免疫反应。虽然现在人们对于引
起先天性免疫反应的机理尚不清楚,但是 Zaiss 等[28]
已经通过 AAV 引起的免疫反应与补体之间的关系证
明了先天性免疫的存在。rAAV 的外壳蛋白和目的基
因蛋白是引起适应性免疫的关键因素。现在构建的
大部分 rAAV 不含病毒的 ORFs,只有 AAV 两端的
ITR 和目的基因,所以只有外壳蛋白可以引起机体
的免疫反应。机体对 rAAV 的免疫反应会影响到转
染效率。因此,消除 rAAV 免疫作用的策略主要集
中消除 Cap 蛋白所引起的免疫反应 ;也可以通过选
择合适的血清型和给药方式、免疫抑制、改变二次
给药时装载的目的基因的 rAAV 的衣壳蛋白等。
4 载体的应用
自从 1983 年第一次分离到 rAAV 载体以来,人
类的基因治疗有了很大的进步。虽然 rAAV 作为基
因治疗载体仍有很多障碍存在,但 rAAV 已成为
临床治疗上最受欢迎的病毒载体之一(http://www.
wiley.co.uk/genmed/clinical)。 绝 大 多 数 的 临 床 试 验
AAV 载体是在 2 型的基础上得来的,多数集中应用
在治疗单基因的混乱造成的疾病上,如纤维性囊肿
病、肌营养失调病和恶性肿瘤等。此外,rAAV-2 常
被用作体内转导的转基因载体,也用在大量的处于
疾病潜伏期的动物模型上。除了 rAAV-2 外,AAV
的其他血清型在体内不同组织均表现出较好的转导
效率[29]。
rAAV 载体应用广泛且 rAAV 介导的基因转染已
经在前期的临床治疗中显示了良好的应用前景。下
面就应用方面作一下简要的介绍 :(1)利用 rAAV
的长期表达的特点,可以应用在遗传性疾病治疗
中,例如,Kay 等[30]通过肌肉注射患者所需要的
rAAV-FIX 因子而在血友病 B 治疗的临床 I 期试验中
取得了良好治疗的结果。(2)随着对 rAAV 不同血
清型研究的深入,利用 rAAV 血清型的不同以及所
转导的组织不同来进行定位治疗。如 Bell 等[31]利
用 AAV-8 能在肝脏内高转导率而在门静脉周围的肝
细胞转导率低的特点来改变肝脏所产生的代谢性酶
量。Mayra[32]通过试验证明,腹膜内 shRNA-AAV9
载体能在胎儿骨骼肌和心肌组织表达干扰 RNA,有
效沉默基因且没有造成肝脏衰竭。(3)对于目前无
有效药物可治疗的癌症,rAAV 基因治疗无疑为其
提供了良好的工具,rAAV 介导的重组载体可以在体
内表达可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体
(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,
TRAIL)杀伤肿瘤细胞。Ren 等[33]用具有肿瘤特效
的条件复制型腺病毒载体表达 TRAIL,进行肝癌的
基因治疗研究。Lv 等[34]通过试验证明了 AAV 介导
的抗-DR5 嵌合抗体能够稳定表达并在裸鼠体内有效
抑制了人肿瘤细胞的增长。
rAAV 载 体 作 为 基 因 治 疗 的 有 力 载 体, 目 前
已经被医学界多个治疗领域所接受,如神经学和
心血管疾病的治疗。Noe 等[35]通过将前元神经肽
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期52
(preproNPY)的 cDNA 克隆到只有 AAV-1 载体,并
通过强启动子能在病毒的衣壳表达从而提高抗惊厥
的效果来治疗癫痫。Su 等[36]通过 AAV 介导共表达
血管生成素 -1(angiopoietin-1)和血管内生长因子
(VEGF)在治疗梗塞性心脏病的试验中也取得了良
好的效果。
5 展望
作为 21 世纪最有前途的基因治疗载体,rAAV
最终应用到临床治疗当中还有很多的障碍。如随着
AAV 血清型的多样性和新型的 AAV 载体不断的开
发带来其安全性问题 ;rAAV 是否能够大规模生产、
纯化以及能否达到未来临床治疗所需的剂量也是成
为将来该载体应用的障碍。当然,rAAV 引起细胞毒
性 T 淋巴细胞(CTL)反应也成为了科学家必须要
解决的问题。保证试验的安全性是 rAAV 应用到临
床的前提。现在的研究大多着重于在小动物模型上
试验,但有必要在大动物模型上得以证实,最后才
能应用到人的临床试验中去。
目前人们仍然需要进一步了解 AAV 血清型的病
毒衣壳蛋白的结构、病毒衣壳蛋白与宿主受体之间
的相互作用机制、rAAV 的随机整合机制与癌症发生
机制的关系及不同血清型对不同宿主细胞趋向性机
制等。相信随着对以上问题的不断深入研究,rAAV
作为基因治疗的前景将更加广阔。

参 考 文 献
[1] Hildinger M, Auricchio A. Advances in AAV-mediated gene dansfer
for the treatment of inherited disorders. Eur Hum Genet, 2004, 12:
263-271.
[2] Verma IM, Weitzama MD. Gene thearapy: Twenty-first century
medicine. Annu Rev Biochem, 2005, 74: 711-738.
[3] Bantel-Schaal U, Delius H, Schmidt R, et al. Human adeno-
associated virus type 5 is only distantly related to other known
primate helper-dependent parvoviruses. J Virol, 1999, 73(2):
939-947.
[4] Rutledge EA, Halbert CL, Russell DW. Infectious clones and vectors
derived from adeno-associated virus(AAV)serotypes other than
AAV type 2. J Virol, 1998, 72(1): 309-319.
[5] Gao G, Vandenberghe LH, Alvira MR, et al. Clades of Adeno-
associated viruses are widely disseminated in human tissues. J Virol,
2004, 78(12): 6381-6388.
[6] Boutin S, Monteilhet V, Veron P, et al. Prevalence of serum IgG and
neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1, 2,
5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy
using AAV vectors. Hum Gene Ther, 2010, 21(6): 704-712.
[7] Galibert L, Merten OW. Latest developments in the large-scale
production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward
the treatment of neuromuscular diseases. Journal of Invertebrate
Pathology, 2011, 107(suppl): S80-S93.
[8] Wu Z, Asokan A, Samulski RJ. Adeno-associated virus serotypes:
Vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther, 2006, 14: 316.
[9] Duan D, Sharma P, Yang J, et al. Circular intermediates of
recombinant adeno-associated virus have defined structural
characteristics responsible for long-term episomal persistence in
muscle tissue. J Virol, 1998, 72(11): 8568-8577.
[10] Matsushita T, Okada T, Inaba T, et al. The adenovirus E1A and
E1B19K genes provide a helper function for transfection-based ade-
no-associated virus vector production. J Gen Virol, 2004, 85(8):
2209-2214.
[11] Gao GP, Alvira MR, Wang L, et al. Novel adeno-associated viruses
from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl
Acad Sci USA, 2002, 99(18): 11854-11859.
[12] Rabinowitz JE, Rolling F, Li C, et al. Cross-packaging of a single
adeno-associated virus(AAV)type 2 vector genome into multiple
AAV serotypes enables transduction with broad specificity. J Virol,
2002, 76(2): 791-801.
[13] Urabe M, Ding C, Kotin RM. Insect cells as a factory to produce
adeno-associated virus type 2 vectors. Hum Gene Ther, 2002, 13
(16):1935-1943.
[14] 吴小兵 , 董小岩 , 伍志坚 , 等 . 一种快速高效分离和纯化
重 组 腺 相 关 病 毒 载 体 的 方 法 . 科 学 通 报 , 2000, 19(45):
2071-2075.
[15] 李桂林 , 王任直 , 王欣 , 等 . 质粒辅助重组腺病毒相关病毒的
制备和纯化 . 中华医学杂志 , 2003, 83(14):1255-1258.
[16] Miao CH, Snyder RO, Schowalter DB, et al. The kinetics of rAAV
integration in the liver. Nat Genet, 1998, 19(1): 13-15.
[17] Nakai H, Wu XL, Fuess S, et al. Large-scale molecular characteri-
zation of adeno-associated virus vector integration in mouse liver. J
Virol, 2005, 79(6): 3606-3614.
2012年第11期 53邱燕等 :重组腺相关病毒载体的研究进展
[18] Donsante A, Miller DG, Li Y, et al. AAV vector integration sites
in mouse hepatocellular carcinoma. Science, 2007, 317(5837):
477.
[19] Schnepp BC, Clark KR, Klemanski DL, et al. Genetic fate of
recombinant adeno-associated virus vector genomes in muscle. J
Virol, 2003, 77(6): 3495-504.
[20] Bell P , Wang L , Lebherz C, et al. No evidence for tumorigenesis of
AAV vectors in a large-scale study in mice. Mol Ther, 2005, 12 :
299-306.
[21] Gao GP, Alvira MR, Wang L, et al. Novel adeno-associated viruses
from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl
Acad Sci USA , 2002, 99(18): 11854-11859.
[22] Sun B, Zhang H, Franco LM, et al. Efficacy of an adenoassociated
virus 8-pseudotyped vector in glycogen storage disease type II. Mol
Ther, 2005, 11: 57-65.
[23] Wang Z, Zhu T, Qiao C, et al. Adeno-associated virus serotype
8 efficiently delivers genes to muscle and heart. Nat Biotechnol,
2005, 23: 321-328.
[24] Kawamoto S, Shi Q, Nitta Y, et al. Widespread and early myocardial
gene expression by adeno-associated virus vector type 6 with a beta-
actin hybrid promoter. Mol Ther, 2005, 11: 980-985.
[25] Mingozzi F, Schuttrumpf J, Arruda VR, et al. Improved hepatic
gene transfer by using an adeno-associated virus serotype 5 vector.
J Virol, 2002, 76(20): 10497-10502.
[26] Louboutin JP, Wang L, Wilson JM. Gene transfer into skeletal
muscle using novel AAV serotypes. J Gene Med, 2005, 7(4):
442-451.
[27] Herzog RW, Yang EY, Couto LB, et al. Long-term correction of
canine hemophilia B by gene transfer of blood coagulation factor IX
mediated by adeno-associated viral vector. Nat Med, 1999, 5(1):
56-63.
[28] Zaiss AK, Cotter MJ, White LR, et al. Complement is an essential
component of the immune response to adeno-associated virus
vectors. J Virol, 2008, 82(6): 2727-2740.
[29] Jiang H, Lillicrap D, Patarroyo-White S, et al. Multi year therapeutic
benefit of AAV serotypes 2, 6, and 8 delivering factor VIII to hemo-
philia A mice and dogs. Blood, 2006, 108(1): 107-115.
[30] Bartlett JS, Wilcher R, Samulski RJ. Infectious entry pathway of
adeno-associated virus and adeno associated virus vectors. J Virol,
2000, 74(6): 2777-2785.
[31] Bell P, Wang LL, Gao GP, et al. Inverse zonation of hepatocyte
transduction with AAV vectors between mice and non-human
primates. Molecular Genetics and Metabolism, 2011, 104(3):
395-403.
[32] Mayra A, Tomimitsu H, Kubodera T, et al. Intraperitoneal AAV9-
shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac
muscles. Biochemical and Biophysical Research Communications,
2011, 405(2): 204-209.
[33] Ren XW, Liang M, Meng X, et al. A tumor-specific conditionally
replicative adenovirus vector expressing TRAIL for gene therapy
of hepatocellular carcinoma. Cancer Gene Ther, 2006, 13(2):
159-168.
[34] Lv FJ, Qiu YH, Zhang YX, et al. Adeno-associated virus-mediated
anti-DR5 chimeric antibody expression suppresses human tumor
growth in nude mice. Cancer Letters, 2011, 302(2): 119-127.
[35] Noe F, Vaghi V, Balducci C, et al. Anticonvulsant effects and
behavioural outcomes of rAAV serotype 1 vector-mediated
neuropeptide Y overexpression in rat hippocampus. Gene Ther,
2010, 17: 643-652.
[36] Su H, Takagawa J, Huang Y, et al. Additive effort of AAV-mediated
angiopoietin-1 and VEGF expression on the therapy of heart.
International Journal of Cardiology, 2009, 133(2): 191-197.
(责任编辑 狄艳红)