全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-24
基金项目 ：北方民族大学科学研究资助项目（2009Y040）
作者简介 ：张靠稳，男，教授，硕士生导师，研究方向 ：微生物资源开发利用教学与研究 ; E-mail ：zkw620821@yahoo.com.cn
四种贺兰山紫蘑菇 rDNA ITS 序列分析
张靠稳 杨振华 刘建利 马爱瑛
（北方民族大学生物科学与工程学院， 银川 750021）
摘 要: 对 4 种紫蘑菇的 rDNA ITS 区段进行克隆测序和序列特征比较分析，并与 GenBank 检索获得的相似性最高菌株的
ITS 序列一起计算遗传距离并构建系统发育树，旨在探索紫蘑菇的分子鉴定方法及亲缘关系。结果显示，CM-1、CM-2、CM-3 及
CM-4 四种紫蘑菇均属于丝膜菌（Cortinarius），分别与 C.rufoolivaceus、C.coerulescens、C.humolens 和 C.calochrous 序列进行比对后，
均显示了较高的遗传相似性。 贺兰山紫蘑菇隶属于丝膜菌属（Cortinarius）。
关键词: 丝膜菌 rDNA ITS 分子鉴定
Analysis of rDNA ITS Sequence of Four Strains of
Cortinarius spp. in Helanshan
Zhang Kaowen Yang Zhenhua Liu Jianli Ma Aiying
（College of Biological Sciences and Engineering， Beifang University for Nationalities， Yinchuan 750021）
Abstract: In order to explore the molecular identification methods and phylogenetic relationship among 4 strains by the analysis of their
ITS sequences， the ribosomal DNA internal transcribed spacer （rDNA ITS）region of 4 strains were cloned and sequenced. The characteristics
of ITS sequences were compared and analyzed with the reference sequences of GenBank database by BLAST. The genetic distance was
calculated and a phylogenetic tree was constructed. Results showed that four strains are all belonged to Cortinarius spp.， and the higher genetic
similarity with C.rufoolivaceus， C.coerulescens， C.humolens and C.calochrous， respectively. Therefore， it proved that 4 strains were belonged to
Cortinarius.
Key words: Cortinarius rDNA ITS Molecular identification
贺兰山因其特殊的地理、生态环境而孕育了丰
富的森林资源，同时为多种真菌的生长、繁衍提供
了十分有利的自然条件。其中，贺兰山紫蘑菇是贺
兰山中分布较广泛的一种天然野生食用菌，以其个
体硕大、味道鲜美、营养丰富、价格不菲，成为当
地群众一项重要的经济收入。
目前，关于贺兰山紫蘑菇的研究大多集中在子
实体的成分 [1]、形态和生长习性 [2] 及人工培养 [3] 等
方面。对于种类特征描述，由于目前有关贺兰山紫
蘑菇的相关资料有限，已发表的文献中出现“同种
异名”、“同名异种”的现象，这为贺兰山紫蘑菇的
进一步研究带来困难。而利用分子鉴定辅助手段，
作为食用菌的种类鉴定和菌株间遗传分析方法已在
许多食用菌的研究中被应用，特别是 rDNA 转录内
间隔区（internal transcribed spacer， ITS）被广泛用于
真菌的菌物鉴定、系统发育及亲缘关系的研究 [4-6]。
然而有关贺兰山紫蘑菇的分子生物学及遗传结构分
析等方面研究尚未见报道。本研究主要采用 rDNA
ITS 序列分析技术对采自贺兰山的 4 种紫蘑菇进行
rDNA ITS 序列分析，从分子水平探索其区别及彼此
之间的亲缘关系，为贺兰山紫蘑菇种类的分子鉴定
和资源保护提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
测试的蘑菇样品采自贺兰山，经子实体形态鉴
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定，分别属于紫红丝膜菌，（C.rufoolivaceus，CM-1）、
白丝膜菌（C.albidus，CM-2）、蓝丝膜菌（C.coerulescens，
CM-3）、黄棕丝膜菌（C.cinnamomeus，CM-4），均被
称为紫蘑菇。
pMD 18-T Vector、Taq DNA 聚合酶、限制性内
切酶 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ均购自 TaKaRa 公司；引物
合成及序列测定由 TaKaRa 公司完成；其他试剂均为
国产分析纯；DNA 片段纯化试剂盒（宝生物公司）。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 提取 取测试菌株，外部清洁后，
掰开子实体，取里面未受污染的部分，液氮研磨处
理后分装，-80℃超低温冰箱保存备用。
取 0.2 g 左右研磨好的样品，参考文献 [7] 采用
KI 法对基因组 DNA 进行提取。然后将提取的 DNA
保存于 -20℃备用。
1.2.2 rDNA ITS 扩增及检测 参照 White 等 [8] 报道
的 ITS 通 用 引 物 序 列， 设 计 引 物 对 序 列 为 ITS1 ：
5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ；ITS4 ：5-TC
CTCCGCTTATTGATATGC-3， 由 TaKaRa 公 司 进 行
合成。
50 µL 扩 增 体 系 包 括 ：10×PCR Buffer（ 含
Mg2+）5 µL，dNTP 2.5 µL，引物各 1 µL，模板 0.5 µL，
Taq DNA 聚合酶 1 µL，ddH2O 39 µL。PCR 扩增程序：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 45 s，58℃退火 60 s，
72℃延伸 60 s，共 30 个循环 ；72℃延伸 7 min。反
应完成后，加 6× 上样缓冲液混匀，于 1.0% 琼脂糖
凝胶电泳检测。
1.2.3 rDNA ITS 序列的克隆和测序 将 PCR 反应液
用 DNA 片段纯化试剂盒（TaKaRa）进行纯化回收。
回收产物连接到 pMD 18-T 载体（TaKaRa），转化大
肠杆菌感受态细胞。每个样品均随机挑选 5 个阳性
克隆，提取质粒 DNA，酶切后，将确定为阳性克隆
的质粒 DNA，送出测序，序列测定由 TaKaRa 公司
完成。
1.2.4 序列比较及系统发育分析 将所测序列除去
5 端 18S rDNA 及 3 端 28S rDNA 序列，仅对 ITS1-
5.8S-ITS2 区域序列进行分析，保留 ITS1 和 ITS2 序
列，并以 FASTA 格式保存。通过 GenBank 数据库
BLAST 比对，找出与样品序列显示最高同源性的序
列，用 MEGA4[9] 进行系统发育分析和进化树构建，
以 Kimura 2-paramete 模型计算遗传距离，用 N-J 法 [10]
（neighbor-joining method） 构 建 分 子 进 化 树， 进 行
1 000 次自展抽值（bootstrap sampling）检验分子进
化树可靠性 [11]。
2 结果
2.1 基因组DNA提取及rDNA ITS序列扩增
以 KI 法提取的基因组 DNA 为模板， ITS1 和
ITS4 为引物，进行 PCR 扩增。产物经 1.0% 琼脂
糖凝胶电泳分析，检测到扩增片段长度 700 bp 左
右（图 1）。
M. Marker DL1000；1-4. 4种菌株的PCR扩增结果
图 1 PCR 扩增电泳图
2.2 rDNA ITS序列分析
对 PCR 产物进行回收、克隆、测序，结果得
到 4 种 样 品 序 列 的 精 确 长 度 分 别 为 CM-1 790 bp，
CM-2 790 bp，CM-3 761 bp；CM-4 770 bp。通过 Gen-
Bank 数据库 BLAST 比对初步判定为丝膜菌（Cortina
rius）， 依 据 Fr slev 等 [12] 公 布 的 Cortinarius 属 真 菌
ITS 序列为参照，对丝膜菌 ITS 序列进行界定，除去 5
端 18S rDNA 及 3 端 28S rDNA 序列，从 GenBank 检
索获得相似性最高的 5 种丝膜菌（C. rufoolivaceus、
2 个 C. calochrous、C. humolens、C. coerulescens） 的
ITS1-5.8S-ITS2 序列，利用 DNAMAN 软件，对 ITS1-
5.8S-ITS2 区域序列进行分析，结果见表 1。
由表 1 数据可知，丝膜菌的 rDNA ITS 序列长
度存在区别，其中 ITS1 序列长度分布在 236-243 bp
之间，ITS2 序列长度在 182-202 bp 之间变化，但
5.8S 序列长度完全一致，均为 160 bp ；对 rDNA ITS
序列的碱基构成进行分析，发现不同丝膜菌的 ITS1
及 ITS2 区域 G+C 含量存在一定差异，但 5.8S 序列
的 G+C 含量完全相同，均为 45%。根据几种丝膜菌
张靠稳等 ：四种贺兰山紫蘑菇 rDNA ITS 序列分析
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rDNA ITS 序列长度及 G+C 含量变异分析，发现大体
将其分为 3 类：（1）CM-1 与 C. rufoolivaceus（FJ039645）
在 rDNA ITS 序列长度及 G+C 碱基构成方面基本一
致；（2）CM-2 和 CM-4 与 C. calochrous（EU056962）、C.
humolens（FJ039640）、C. calochrous（FJ039639） 在
rDNA ITS 序列长度及 G+C 碱基构成方面基本相似 ；
（3）CM-3 与 C. coerulescens（AF389134） 虽 在 碱 基
构成方面存在一定差异，但总体看来，只有这两者
的相似性最高。
2.3 rDNA ITS序列的系统发育分析
由于 5.8S 序列无论在长度及碱基构成方面均
未 出 现 变 化， 因 此， 利 用 MEGA4 软 件 仅 对 ITS1
和 ITS2 序列进行系统发育分析和进化树构建，以
Kimura 2-paramete 模型计算遗传距离，结果见表 2。
CM-1、CM-2、CM-3、CM-4为所采集的4种紫蘑菇样品; 1.C. rufoolivaceus（FJ039645）; 2.C. calochrous（EU056962）; 3.C. humolens（FJ039640）；
4.C. coerulescens（AF389134）; 5.C. calochrous（FJ039639）
表 1 丝膜菌 rDNA ITS 序列长度及 G+C 含量变异分析
种编号 CM-1 CM-2 CM-3 CM-4 1 2 3 4 5
CM-1
CM-2 0.054
CM-3 0.105 0.105
CM-4 0.060 0.043 0.125
1 0.020 0.049 0.116 0.070
2 0.057 0.015 0.108 0.038 0.057
3 0.052 0.013 0.105 0.043 0.052 0.018
4 0.122 0.110 0.044 0.140 0.128 0.108 0.110
5 0.052 0.036 0.119 0.036 0.052 0.028 0.033 0.128
CM-1、CM-2、CM-3、CM-4为所采集4种紫蘑菇样品；1.C. rufoolivaceus（FJ039645）；2.C. calochrous（EU056962）；3.C. humolens（FJ039640）；
4.C. coerulescens（AF389134）；5.C. calochrous（FJ039639）
表 2 ITS1 和 ITS2 序列的遗传距离分析
序列编号
ITS1 5.8S ITS2 ITS
长度（bp） G+C含量（%） 长度（bp） G+C含量（%） 长度（bp） G+C含量（%） 长度（bp） G+C含量（%）
CM-1 239 37.7 160 45 184 41.3 583 40.8
CM-2 241 35.7 160 45 185 38.9 586 39.3
CM-3 239 39.7 160 45 202 40.1 601 41.3
CM-4 240 36.3 160 45 185 39.4 585 39.6
1 241 38.6 160 45 184 39.2 585 40.6
2 243 35.8 160 45 187 40.7 590 39.8
3 240 35.8 160 45 184 38.6 584 39.2
4 236 38.6 160 45 200 37.5 596 39.9
5 238 35.7 160 45 184 39.2 582 39.3
从表 2 可看出，菌株间存在一定的遗传分化，
其中，CM-1 与 C.rufoolivaceus 的遗传距离最小，表
明亲缘最近 ；CM-2 与 C.calochrous 和 C.humolens 的
遗传距离分别为 0.015 和 0.013，表明与两者的亲缘
关系最近；CM-3 与 C.coerulescens、CM-4 与 C.calochrous
的遗传距离分别为 0.044 和 0.036，说明彼此之间亲
缘关系较近。
依据 rDNA ITS 序列信息，应用 N-J 法进行系统
发育树构建，结果见图 2。
CM-1、CM-2、CM-3、CM-4均为所测样品序列，其余序列源自GenBank
图 2 ITS1 和 ITS2 序列的 N-J 系统发育树
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由图 2 可知，所有丝膜菌序列可以分为 3 个类
群（Group Ⅰ，bootstrap=78% ；Group Ⅱ，bootstrap=
99% ；Group Ⅲ，bootstrap=100%）。其中 Group Ⅰ由
CM-2、CM-4、C.humolens 和 C.calochrous 构成，Group Ⅱ
由 CM-1 及 C.rufoolivaceus 构 成，Group Ⅲ 由 CM-3
及 C.coerulescens 构 成。 同 时 由 系 统 发 育 树 可 知，
Group Ⅰ和 Group Ⅱ的亲缘关系要比 Group Ⅲ的亲缘
关系要近。系统发育树得到的结果和 rDNA ITS 序列
及 G+C 变异分析的结果表现出较高的一致性，进一
步说明了系统发育树的可靠性。
3 讨论
通 过 rDNA ITS 序 列 及 G+C 含 量 变 化，ITS1
和 ITS2 序 列 的 遗 传 距 离 分 析 及 ITS1 和 ITS2 序 列
的 N-J 系统发育树的分析，得出 CM-1 与紫红丝膜
菌 （C.rufoolivaceus） 亲 缘 关 系 最 近， 遗 传 距 离 为
0.02，相似度为 98%，；CM-2 与 C.humolens 的遗传
距离为 0.013，相似度高达 99% ；CM-3 与 蓝丝膜菌
（C.coerulescens）的遗传距离为 0.044，相似性系数为
96% ；CM-4 与托柄丝膜菌 （C.calochrous）的遗传距
离为 0.038，相似性系数为 96%。Renske 等 [13] 认为，
通过 ITS 序列比对，如果相似性大于 99%，则鉴定
为相同种 ；相似性在 95%-99%，则鉴定为相同属 ；
相似性小于 95%，则鉴定为相同科。由于其相似性
系数均大于 95%，因此可得出测试样品属于丝膜菌
属（Cortinarius）。
由于 rDNA 中 18S、5.8S 和 28S 的基因组序列
在大多数生物中趋于保守，种间变化小，而 ITS1 和
ITS2 作为非编码区，相对变化较大，而且能够提供
详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本研究仅
将 rDNA ITS 序列中的 ITS1 和 ITS2 序列作为遗传距
离及系统发育树构建的依据。
食用菌传统的种类鉴定方法主要以子实体的形
态特征作为依据，因其人为、样品等因素的影响，
使形态鉴定受到限制。随着分子生物学技术的发展，
rDNA ITS 序列分析在真菌种类鉴定中得到广泛应用，
由于该技术可以直接提取蕴含于基因组内的遗传信
息，受其它因素影响较小，作为贺兰山紫蘑菇形态
鉴定的辅助手段 rDNA ITS 序列分析技术在今后贺兰
山紫蘑菇的深入研究方面具有重要意义。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
张靠稳等 ：四种贺兰山紫蘑菇 rDNA ITS 序列分析