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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
牦牛 hnRNP K基因的克隆及序列分析
方鸿滨1，2 王永1，2 江明锋1，2 陈达文2
(1青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，成都 610041;2西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041)
摘 要: 为研究 hnRNP K基因的生物学功能及其在牦牛中的特异性，利用 RT-PCR 和粘性末端连接法，分两段克隆了
牦牛 hnRNP K基因 cDNA序列。序列分析结果表明，牦牛 hnRNP K基因 cDNA序列长 11 706 bp，开放阅读框(ORF)长 1 389
bp，编码 463 个氨基酸。序列比对结果表明，牦牛与黄牛 hnRNP K cDNA 序列的同源性达 99. 1%，编码的氨基酸同源性达到
97. 0%;在牦牛氨基酸序列中有 15 个突变。通过同源建模的方法成功构建了牦牛 hnRNP K 蛋白质三级结构，结果表明牦牛
hnRNP K属于 A型结构，而黄牛 hnRNP K 蛋白属于 B 型结构，其差异是由第 459 － 463 位氨基酸序列由“ADVEG”突变为
“SGKFF”所致。乙酰化分析结果显示，牦牛 hnRNP K对基因转录的影响水平跟黄牛是一致，表明不同物种 hnRNP K 功能的
差异可能跟其氨基酸序列的差异有关。成功克隆的牦牛 hnRNP K基因的 cDNA序列为进一步分析该基因的功能提供参考。
关键词: 牦牛 hnRNP K RT-PCR 粘性末端连接法 基因克隆 蛋白质三级结构
Cloning and Sequence Analysis of hnRNP K Gene in Bos grunniens
Fang Hongbin1，2 Wang Yong1，2 Jiang Mingfeng1，2 Chen Dawen2
(1Key Laboratory for the Qing-Tibet Plateau Animal Genetic Resource Conservation and
Exploitation of Sichuan Province，Chengdu 610041;
2College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041)
Abstract: In order to study the biological function of hnRNP K gene and its specificity in Bos grunniens，the cDNA sequence of
hnRNP K gene in Bos grunniens was cloned by RT-PCR and cohesive end connecting method． Results showed that the size of hnRNP K
cDNA was 11 706 bp，and the ORF was 1 389 bp，encoding 463 amino acids，which performed similarity to Bos taurus(nucleotide:
99. 1%;amino acids:97. 0%)． There were 15 mutations in deduced amino acids of hnRNP K protein sequence in Bos grunniens． The
tertiary structure of Bos grunniens hnRNP K protein belongs to type A according to the results of homology modeling，and Bos taurus
hnRNP K protein belongs to type B． The tertiary structure difference between two kinds of structure model was due to the mutations
from ADVEG(type B)to SGKFF(type A)at position 459 － 463 in hnRNP K amino acids sequence． Acetylizing analysis showed that
hnRNP K of Bos grunniens performs the same functions as Bos taurus’during the process of transcription． Therefore，it can be de-
duced the different functions of hnRNP K among different species were relate to the discrepancy of its amino acid sequence． The re-
sults of this study suggests that hnRNP K of Bos grunniens was cloned successfully and could provide reference for future analysis．
Key words: Bos grunniens hnRNP K RT-PCR Cohesive end connecting method Gene clone Protein tertiary structure
收稿日期:2010-03-01
基金项目:四川省青年重点基金项目(09ZQ026-011)
作者简介:方鸿滨，男，硕士研究生，研究方向:动物遗传育种与繁殖;E-mail:littlebird-208@ 163． com
通讯作者:王永，男，博士，教授，研究方向:动物遗传育种与繁殖;E-mail:wangyong010101@ swun． cn
牦牛(Bos grunniens)自古具有“高原之舟”的美
称，主要分布于青藏高原及其毗邻的高原地区［1］。
牦牛是牛属中惟一对低氧环境具有强适应能力的动
物，为高原地区人民提供乳、肉、皮毛等重要衣食资
源，在高原地区人民生活和经济生活中占有不可替
代位置［2］;另外，牦牛体内有数十种药用物质，是珍
贵的医药和生化制品资源［3］。
hnRNP K(heterogeneous nuclear ribonucleropro-
tein K)是 hnRNP 家族中的主要成员之一，也属于
poly(C)结合蛋白的一种，Matunis 等［4］首先在人体
2010 年第 7 期 方鸿滨等:牦牛 hnRNP K基因的克隆及序列分析
中克隆得到该基因。hnRNP K 被发现后，人们对其
主要功能进行了深入的研究，Burd 等［5］发现 hnRNP
K中的第一个 KH(K-homology domain)结构域，即
KHⅠ，这也是人们在 poly(C)结合蛋白中发现的第
一个 KH结构域。进一步研究表明，hnRNP K 主要
包括 KHⅠ、KHⅡ和 KHⅢ3 个 DNA 或 mRNA 富 C
区结合区，在 KHⅡ和 KHⅢ之间还有一个促进
hnRNP K 在核孔复合体间穿梭的信号位点 KNS
(hnRNP K nuclear shutting)信号位点，是基因从转
录到翻译以及 mRNA前体剪接的整个过程的主要蛋
白质之一［6］。近年来，人们还发现 hnRNP K 不但与
激素的分泌和精子的产生有关［7］，其表达量变化是直
接导致癌症细胞病变主要原因［8］。因此，对各种动物
hnRNP K 基因进行研究具有重大意义。目前，对
hnRNP K基因的克隆鲜有报道，对牦牛 hnRNP K 基
因的克隆研究未见报道。综上所述，对牦牛 hnRNP K
基因的克隆及分析具有较大意义，其结果可为牦牛生
理特征的分子机理研究提供理论基础。本试验拟对
hnRNP K基因进行克隆，并进行相应的生物信息学
分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验动物 试验用成年健康母牦牛选自四
川九龙县，屠宰后马上取其卵巢后放入液氮罐中带
回实验室，储存于 － 80℃超低温冰箱中。
1. 1. 2 主要试剂 RNA 提取试剂盒、TaKaRa RNA
PCR Kit反转录试剂盒、Ex Taq DNA 聚合酶反应体
系、胶回收试剂盒、pMD19-T Vector载体均购自大连
宝生物(TaKaRa)工程有限公司;感受态细胞购自成
都天根生物技术有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计及合成 从 NCBI 网站下载 Gen-
Bank登录号为黄牛(NM_001034562)、人类(NM_
002140)、家鼠(NM_025279)、兔(NM_001082125)、褐
鼠(NM_057141)的 hnRNP K 基因序列用 DNAMAN
进行对比分析。以黄牛 hnRNP K基因 cDNA序列为
模板，用 primer5. 0软件设计两对引物如表 1所示。
表 1 PCR用 hnRNP K引物序列
引物 序列 产物大小(bp)
引物 1(P1)
上游引物(PF1) 5-CAAGAAAATGGAAACTGAACAGCCAGAGGA-3
下游引物(PR1) 3-AATACTACTTTGGATACTAATACCACCA-5
720
引物 2(P2)
上游引物(PF2) 5-GACAGAGTTGTTCTTATCGGAG-3
下游引物(PR2) 3-AACGAAACACCAGTGACATTGT-5
1 190
引物 1 扩增所得的序列的 5-末端和引物 2 扩增所得的序列的 3-末端重复
1. 2 . 2 RT-PCR扩增方法 RT-PCR扩增分为分段
克隆 PCR和连接 PCR两部分。分段克隆 PCR分别
以 P1 和 P2 为引物，反应体系如下:dNTP 2 μL，上、
下游引物各 1 μL，模板 0. 4 μL，Mg2﹢2 μL，10 × buff-
er 2. 5 μL，酶 0. 2 μL 加 ddH2O 水至总体积 25 μL。
以 cDNA 第一链产物作为 PCR 反应模板。PCR 反
应程序为 94℃ 4 min;94℃ 30 s，55℃，30 s，72℃，
1 min，32 个循环;72℃ 5 min。
连接 PCR以 PF1 为上游引物，以 PR2 为下游引
物(表 1) ，以等体积的 P1 和 P2 产物为模板，反应程
序为 94℃ 4 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，
32 个循环;72℃ 5 min。
1. 2. 3 克隆质粒的构建与重组子阳性克隆的鉴定
利用胶回收试剂盒对连接 PCR 产物目的条带
进行回收纯化。纯化后的引物 1 产物﹑引物 2 产物
和连接 PCR产物与 pMD19-T Vector连接，连接产物
转化到感受态细胞，随机挑选数个阳性克隆于 LB
培养液中过夜培养，用菌液 PCR再次确认后送英俊
生物技术有限公司测序。
1. 2. 4 生物信息学分析相关软件 DNASTAR 分
析测出序列的编码区序列，用 DNAMAN5. 0 软件翻
译出氨基酸序列并进行同源性分析。乙酰化特点预
测用在线软件 http:/ /www． cbs． dtu． dk /services 中
的 NetAcet 1. 0 软件分析;蛋白质的三级结构预测用
在线软件 http:/ /www． expasy． net / tools 中的 SWISS-
MODEL软件进行分析。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
2 结果与分析
2. 1 PCR扩增结果
采用 RT-PCR 方法去克隆 hnRNP K 基因。引
物 1 和引物 2 的 PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检
测如图 1 所示，条带的大小都与预测一致。连接
PCR扩增结果如图 2 所示，条带的位置也与预测的
一致，初步确定所扩增的片段为目的片段。
2. 2 测序结果
测序结果(图 3)表明，所克隆的牦牛 hnRNP K
基因 cDNA 全长 1 706 bp，开放阅读框(ORF)长
1 389 bp，编码 463 个氨基酸。
M． DL2000 Marker;1．引物 1 PCR
产物;2．引物 2 PCR产物
图 1 引物 1、引物 2 的
PCR产物电泳图
1．连接 PCR产物;
M． DL2000 Marker
图 2 连接 PCR
产物电泳
粗体部分为乙酰化位点;下划线为 KH区域;斜体部分为 KNS sigal;方框中为 RGG-box;“* ”表示终止密码子
图 3 牦牛 hnRNP K基因序列测序结果及其编码的氨基酸序列
471
2010 年第 7 期 方鸿滨等:牦牛 hnRNP K基因的克隆及序列分析
2. 3 序列分析
2. 3. 1 牦牛 hnRNP K基因编码区核酸序列与其它物
种的同源性比较 用 DNAMAN5. 0 软件对牦牛的
hnRNP K编码区核酸序列及氨基酸与已知物种的进
行分析比较，结果表明，牦牛 hnRNP K基因核酸序列
与人、家鼠、兔子、褐鼠和黄牛的序列相似性分别为
95. 7%、93. 6%、95. 5%、93. 9%、99. 1%;与人、家鼠、
兔子、褐鼠和黄牛 hnRNP K 氨基酸序列相似性分别
为 96. 8%、97. 6%、97. 4%、97. 6%、97. 0%。与黄牛
的 hnRNP K核酸序列对比结果如表 2 所示，氨基酸
对比结果如表 3 所示。另外，牦牛 hnRNP K的核苷
酸第 1 374 － 1 386 个碱基序列由黄牛的“GCAGAT-
GTTGAA”序列突变为“TCTGGAAAGTTT”序列，第
1 387 － 1 389 个碱基缺失。结合表 2 和表 3 可见，
牦牛第 165、253、276、369、376、385、423、424 位核酸
突变是同义突变。
表 2 牦牛和黄牛的 hnRNP K核酸之间的差异性分析
核酸位点 165 253 256 276 319 369 372 376 385 409 423 424 570 577 598 1158
Bos grunniens A A T C G T A A A T T A A A A G
Bos Taurus G G C T A C G G G C C G C G G T
表 3 牦牛和黄牛的 hnRNP K氨基酸之间的差异性分析
氨基酸位点 85 86 107 125 128 137 190 193 200 458 459 460 461 462 463
Bos grunniens K C A K T Y E I N S G － K F F
Bos Taurus E R T E A H D V D A D V E G －
2. 3. 2 牦牛 hnRNP K氨基酸序列与其它物种的同
源性比较 用 DNAMAN5. 0 软件对牦牛的 hnRNP
K氨基酸序列跟家兔、褐鼠、黄牛、人类和家鼠的进
行同源性比对，从结果(图 4)可以看出，牦牛 hnRNP
K编码的氨基酸与黄牛对比出现 15 个氨基酸突变，
其中包括第 460 位氨基酸缺失一个 V和第 463 位氨
基酸多一个 F。
2. 3. 3 核酸进化树和氨基酸系统进化树的比较 根
据牦牛 hnRNP K基因编码的氨基酸序列跟其它物种的
序列差异，利用 DNAMAN5. 0 建立核苷酸和氨基酸进
化树如图 5 所示。从核苷酸进化树(图 5-a)看，牦牛
hnRNP K与黄牛的遗传距离比较近，与家兔、人类、褐
鼠和家鼠的遗传距离比较接远;从氨基酸进化树(图
5-b)看，各物种间的 hnRNP K的遗传距离很近，牦牛
hnNP K与家兔、褐鼠和家鼠的遗传距离比较接远，与
黄牛和人的遗传距离比较近。
2. 4 HnRNP K成熟肽蛋白质高级结构的分析与功
能结构模型的建立
2. 4. 1 牦牛 hnRNP K 高级结构分析 用在线
SWISS-MODEL软件对牦牛、黄牛、人、家鼠、兔子的
hnRNP K 蛋白质进行分析对比［9 － 11］，结果显示
hnRNP K蛋白质三级结构在 5 个物种上都含有 3 个
α-螺旋、3个 β-折叠、4个无规则卷曲和 1 个 β-转角;
主要区别在于第 3 个 α-螺旋不同。根据此特点可分
为两种不同的类型:牦牛 hnRNP K与家兔、和家鼠的
完全相同，归为 A型;人类和黄牛的完全相同，归为
B型;第 3 个 α-螺旋上 A型比 B型多了近 1 个螺旋
周期，如图 6 所示。另一方面，将黄牛的 hnRNP K
氨基酸 C 端突变序列“ADVEG”换成“SGKFF”序
列，其它不变。对其蛋白质三级结构预测，结果发
现，新的蛋白质三级结构由原来的 B 型变为 A 型，
说明了“ADVEG”突变为“SGKFF”氨基酸序列是导
致 hnRNP K C 端 α-螺旋出现两种结构类型的主要
原因。
2. 4. 2 乙酰化分析 组蛋白的乙酰化水平是影响
真核生物的转录调控的主要因素［12］，用在线软件
NetAcet 1. 0 软件对牦牛和黄牛的 hnRNP K 氨基酸
序列进行乙酰化特征分析。结果发现牦牛和黄牛的
hnRNP K乙酰化特点完全一致，均表现为可乙酰
化，乙酰化位点为第 3 个氨基酸 T(苏氨酸，图 3) ，
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
说明牦牛 hnRNP K 对基因转录的影响水平跟其他
物种一致，同时说明，对所克隆得到的牦牛 hnRNP K
基因乙酰化所产生的影响与其它物种类似。
图 4 牦牛 hnRNP K编码氨基酸序列与其它物种间的序列比对比较
2. 4. 3 牦牛 hnRNP K 功能区模型的建立 根据
Aleksandr等［4］描述人类的 hnRNP K 的结构特点，
即 KHⅠ从第 41 位氨基酸到 109 位氨基酸区域、KH
Ⅱ从第 142 位氨基酸到 214 位氨基酸区域、KHⅢ从
第 385 位氨基酸到 454 位氨基酸区域，在 KHⅡ和
KHⅢ之间的第 318 位氨基酸到 382 位氨基酸之间
还有一个促进 hnRNP K 在核孔复合体间穿梭的信
号位点 KNS(hnRNP K nuclear shutting)。因此，结
合氨基酸序列对比结果建立牦牛 hnRNP K 的功能
结构模型，如图 7 所示，各个功能区所对应的氨基酸
序列如图 3 所示。
3 讨论
hnRNP K是基因从转录到翻译以及 mRNA 前
体剪接的整个过程的主要蛋白质之一［13］，主要分布
于真核生物的细胞核内，能够与多种信号蛋白结合
并参与了从转录、mRNA 前体加工到 mRNA 输出细
胞核的整个过程，也是 mRNA 前体发生可变剪接的
主要蛋白之一，而且对 mRNA 前体发生可变剪接的
强弱起调节性作用［13 － 17］。目前研究表明，hnRNP K
是通过两条途径实现对 mRNA 前体加工的影响:第
一条途径是通过调节 hnRNP K 的表达量来影响其
对 mRNA前体剪接;第二条途径是通过 hnRNP K的
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2010 年第 7 期 方鸿滨等:牦牛 hnRNP K基因的克隆及序列分析
KH I和 KH II 两个 RNA 结构域与 Vav，Src 家族激
酶和 PKC异构体的脯氨酸富集域和酪氨酸磷酸化
位点之间的结合，直接影响多种蛋白 －蛋白，蛋白-
RNA相互结合的能力，从而影响 mRNA 前体的剪
切 ［18］。
图 5 牦牛和其它动物 hnRNP K核苷酸(a)和
氨基酸(b)进化树
本研究成功地克隆了牦牛 hnRNP K 的 cDNA
全序列，用 DNAMAN软件分析表明，该基因的 ORF
编码 463 个氨基酸。与已知的物种的 hnRNPK cD-
NA序列相比，同源性达到 93. 6% －99. 1%，与黄牛
的同源性最高为 99. 1%;氨基酸序列的同源性达到
96. 8% － 97. 6%，与家鼠和褐鼠的同源性最高。说
明 hnRNP K基因高度保守，但也存在种属特异性。
研究表明［13，21，22］，hnRNP K 的 KHⅠ与其他 RNA
结合蛋白一样，有一段高度保守的“VIGXXGXXI基序
和 C端富 RGG-box区，前者功能尚未清楚，后者主要
功能是辅助介导蛋白质之间的相互作用，影响 RNA
和蛋白质的活性，从而影响蛋白质在细胞内的定位。
现有的资料和相关生物信息学分析结果显示，牦牛
hnRNPK基因功能区中的 KHⅠ位于 41 －109位氨基酸
序列，KHⅡ位于 142 － 214 位氨基酸，KHⅢ位于 385 －
462位氨基酸序列;KNS signal 位于 318 － 382 位氨基
酸序列。与已经公布的其它物种的 hnRNPK一样，牦
牛的 hnRNPK氨基酸序列在第 258 － 320 位氨基酸间
存在 5 个“RGG-box”(图 3 中方框部分)。HnRNP K
的 KHⅠ与其他 RNA 结合蛋白的 KHⅠ的保守区
“VIGXXGXXI”基序表现为“VIGKGGKNI”，位于第 58
－67位氨基酸。另外发现，hnRNP K 的 KHⅡ中有个
跟 KHⅠ很相似的氨基酸序列 IIGVKGAKI，即可表示为
IIGXXGXXI，位于第 161 －169位氨基酸;而在 KHⅢ中
没有类似区域。上述功能结构在牦牛和其他物种中
完全相同，所以 hnRNP K 在牦牛中的表达调控的差
异可能跟功能区中的氨基酸的差异有关，具体机制有
待于进一步研究。
图 6 A型(左)与 B型(右)hnRNP K蛋白质三级结构预测对比分析
图 7 牦牛 hnRNP K主要功能结构模型
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
从蛋白质的三级结构看，牦牛 hnRNP K的结构
域是由“β1α1α2β2β3α3”组成，所有的 KH 结构域
均位于 β折叠上，这与 Musco 等［19，20］研究的剪接因
子 KH结构域的研究结果是一致的。
4 结论
本试验通过分段克隆产物连接成完整的
hnRNP K cDNA 序列，结果表明，与黄牛、人、家鼠、
兔子等哺乳动物 hnRNP K 相比，牦牛 hnRNP K cD-
NA序列及其编码的氨基酸序列具有高度的保守
性，其突变位点较少。hnRNP K 蛋白质三级结构存
在 A、B两种结构类型，与黄牛不同，牦牛属于 A 型
结构，其空间结构的差异是否意味着牦牛与黄牛的
hnRNP K基因功能上有差异，尚需要进一步研究。
下一步将对牦牛 hnRNP K 基因在不同组织中的表
达量及其真核表达、该基因对牦牛基因表达调控的
影响等方面进行全面研究，以进一步对其生物学功
能进行研究。
本试验的成功填补了国内外对牦牛 hnRNP K
基因研究的空白，为牦牛的基因表达调控及其基因
可变剪接的原理的研究打下基础。
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