全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 1期
载 ZnO /活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究
韩绪军 1 张立波 2 冯悦 1 唐颖蕾 1 魏大巧1 彭金辉 2 夏雪山 1
( 1昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224; 2昆明理工大学材料与冶金工程学院,昆明 650093)


摘
要:
废催化剂微波烧结法制备的 ZnO /活性碳复合材料, 在多孔活性炭表面附载有 ZnO,是一种新型的环保材料。
为评价其抗菌活性和使用安全性,本研究进行了材料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及酵母菌的抑菌试验, 结果
表明 ZnO /活性碳复合材料有很好的抑制细菌增殖效果,低浓度下 ( 0
1
g /mL )作用 2 h的抑菌率能达到 90%以上, 对真菌 -
酵母菌的抑制活性相对较低; 经细胞毒性试验、动物口服急性毒性试验,皮肤过敏性试验发现, 材料对小鼠经口灌喂半致死剂
量 ( LD50 ) > 2 000 m g /kg,对兔皮肤刺激性积分为 0, 对细胞生长无影响 ,属于实际生物无毒级。试验结果表明 ZnO /活性碳复
合材料具有很好的抗菌效果及使用安全性。
关键词:
ZnO
活性碳 抗菌作用 抑菌率 生物安全性
Evaluation on Antibacterial Affects and Bio
safety of
ZnO /active Carbon CompositeMaterial
H an Xujun
1
Zhang L ibo
2
FengYue
1
TangY ing lei
1
W e iDaqiao
1
Peng J inhui
2
XiaXueshan
1
(
1
Faculty of L ife Science and T echnology, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224;
2
Faculty of M aterial and M etallurgicalEngineering, Kunm ing University of Science and T echnology, K unm ing 650093)


Abstrac:t
As a nove l env ironm enta l protec tion m ater ia ,l the ZnO / ac tive carbon com pos item a terial is prepa red w ith m icrow ave
sinter ing m ethods from deserted cata ly st, w hich carry ZnO in its plen tifu l ho les
To evalua te its antibacte rial affects and b io
safety, the
experim ent o f anti
bac teria and anti
fung iwas conducted
The results showed tha tm ore than 90% bacter ia were inactivated whenE sch

er ich ia coli, S taphy lococcus aureaus andB
subtilisw ere incubated at 37
fo r tw o hours toge therw ith m ate rial
In com pa rison, its e ffect
on yeast is low
The cu ltured ce ll tox ic ity, an ima l o ra l acute tox ic ity and sk in allergy tests w ere a lso perfo rm ed
Accord ing the its
effects, the o ra l LD50 of the m ater ia l for m icew as m ore than 2 000 m g /kg, its stimu lating score on the rabbit skin w as zero, and the
ce lls can grew no rm ally, wh ich suggested its h igh b io
safety
These find ings ind ica te th is ZnO / active carbon com positem ate rial has a
good anti
bac terial a ffects and cou ld be used b io
safe ly

Key words: ZnO A ctivated carbon Antibacter ia l effec t Rate of antibacter ia B iosafety
收稿日期: 2009
11
02
基金项目:云南省科技厅国际合作项目 ( 2006GH 01) ,科技部国际合作项目 ( 2008DFA91500)
作者简介:韩绪军,男,硕士研究生,研究方向:生物化工专业; E
m ai:l h anxu jun4318@ 163
com
通讯作者:夏雪山,博士,副教授,主要从事病原生物学及抗菌材料生物功能方面的研究; E
m a i:l oliverxia2000@ yahoo
com
cn
随着社会发展及人民生活水平的提高, 健康的
生存环境日益成为人类的追求目标, 人们在利用微
生物有益性的同时, 也十分警惕其作为病原菌的危
害性。利用抗菌材料及其制品抗菌、杀菌是净化
环境保障健康的有效措施 [ 1 ]。近年来, 具有抗菌
活性的无机抗菌材料因其安全性稳定性应用越来
越广 [ 2- 4]。将具有杀菌能力的金属或金属氧化物
负载于性能稳定的无机材料上制备的复合材料,
是无机抗菌剂主要类型。氧化锌是最早用于抗菌
的金属氧化物之一, 据认为可通过接触反应和光
催化产生活性氧两种方式起到杀菌作用 [ 5] , 同时
具有良好生物相容性、环境协调性和使用安全
性 [ 6]。 ZnO的主要抗菌活性分子是颗粒表面能产
生的过氧化氢 (H 2O2 ) [ 7, 8] , 要求与被作用菌体近
2010年第 1期 韩绪军等:载 ZnO /活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究
距离接触而发挥抗菌活性 [ 9] , ZnO最佳的抗菌 pH
值范围在 7- 8之间 [ 10]。氧化锌超细粉 [ 11 ]及四针
状氧化锌 [ 12 ]对多种病原菌的抑制作用及其安全性
已被有效证实。
目前无机抗菌材料用载体多是一些多孔材料如
沸石, 硅胶, 活性碳等。活性碳性质稳定, 耐高温,比
表面积大,微孔丰富,对各种无机和有机气体, 水溶
液中的有机物,贵重金属离子等有较大的吸附量和
较快的吸附速率,并且可以再生。同时,活性碳对微
生物也有很好的吸附作用 [ 13 ] ,能够将大量的微生物
(细菌 )吸附在活性碳材料表面。若将具有抗菌活
性金属氧化物负载在活性碳载上, 将可能使这种复
合材料具有吸附和抗菌双重功能。
本研究在利用化工废催化剂微波烧结法制备获
得载氧化锌活性炭复合材料,主要进行了材料对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌的
抑制 /杀灭作用试验, 以确定其抗菌活性, 并通过细
胞毒性试验、小鼠口服急性毒性试验和白兔皮肤刺
激性试验评价其使用安全性。
1
材料和方法
1
1
材料
ZnO /活性碳复合材料 ( 1# - 10# )由昆明理工大
学高校微波冶金重点实验室制备。受试菌和细胞:
大肠杆菌 (E scherichia coli )、金黄色葡萄球 (S taphy

lococcus aureaus)、枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis)及
酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae H ansen )、H epG2
细胞株,为本实验室保存。
清洁级昆明小鼠体重 20
2 g, 26只, 雌雄各
半;普通级新西兰白兔 4只,体重 2
0
2 kg,雌雄各
半。从昆明医学院实验动物中心购买。
1
2
方法
1
2
1
材料浸泡接触杀菌试验 将受试菌按照在
各自生长适宜条件下制备好的菌悬液, 控制菌液浓
度为 105 - 107 CFU /mL,分装 50 mL的三角瓶, 每瓶
各 20mL菌悬液,分别加入预先灭好菌的 1# - 10#号
ZnO /活性碳复合材料样品各 1 g, 同时设不加材料
的阴性对照。 37
、150 r /m in的摇床处理 2 h后,
采用梯度稀释平板菌落计数法计算菌悬液中活菌
数。根据处理后菌悬液活菌数的差异, 计算出材料
的杀菌率。
在上述试验的基础上,选取 5#材料对以上几种
受试菌进一步试验, 20mL的培养液内,加入不同量
5
#
ZnO /活性碳复合材料, 使其终浓度呈现梯度分
布, 同样条件处理受试菌,测定其不同材料浓度条件
下的抑菌情况, 绘制量效曲线, 分析确定 5#材料对
各受试菌的最小抑菌浓度。
1
2
2
细胞毒性试验 称取 0
25 g复合材料 ( 1#
- 10
#
) , 高压湿热灭菌, 干燥后, 加入 10 mL MEM
完全培养基, 37oC浸提 36 h, 离心取上清为原始材
料浸提液。复苏肝癌细胞系 H epG2, MEM培养基
生长至对数生长期, 消化传代, 接种 96孔板,铺板
密度为 105 /孔。 24 h后待细胞贴壁长好, 加入原
始材料浸提液, 同时设置活性炭粉浸提液处理细
胞和只有浸提液的无细胞对照孔。继续培养 24 h
后, M TT法测定细胞成活率。按公式:细胞生长抑
制率 (% ) = ( 1- 试验孔 OD值 /对照孔 OD值 )

100, 评价材料的细胞毒性 [ 14 ]。选取 5#材料, 用
MEM培养基配制的不同浓度梯度的浸提液, 同样
条件处理细胞, 评价不同浓度材料浸提液的细胞
毒性。
1
2
3
口服急性毒性试验 26只健康昆明小鼠,
体重 20
2 g。在动物房环境中适应 3 d, 试验前禁
食 (不限制饮水 ) 16 h。将选取的 3#、5#材料用 PBS
制成 0
2 g /mL的 ZnO /活性碳复合材料 (研磨后 )
悬液,按 0
1 mL /10 g(体重 )计算灌喂剂量,采用一
次经口灌胃后, 继续禁食 3 h, 在恢复正常供水、供
食。两种材料剂量灌喂小鼠的数量均为 10只,雌雄
各半; 同时设仅灌喂无材料 PBS的空白对照组 ( 6
只 ) ,两周内观察动物的中毒症状和死亡情况, 计算
其 LD50。
1
2
4
急性皮肤刺激试验 将约 2 kg重的新西
兰大耳白兔背部脊柱两侧被毛剪掉,不损伤表皮,
去毛范围约 3 cm
3 cm。用凡士林与 3#、5#材料
1
1 g , 1
5 g调成均匀糊状, 取 1 g涂于 2
5 cm

2
5 cm 4层纱布上, 马上敷贴在白兔一侧的去毛
皮肤上, 再用无刺激性胶布加以固定。另一侧敷
用凡士林作为对照。敷用 24 h后用温水除去残留
物,于试验后 24 h和 48 h观察涂抹部位皮肤反
应,按表 1进行皮肤刺激反应积分, 积分低于 0
4
为无刺激性 (表 1)。
201
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
表 1 皮肤刺激强度积分
红斑形成 积分 水肿形成 积分
无红斑
勉强可见
明显红斑
中等 -严重红斑
紫红色红斑并有焦痂
形成
0
1
2
3
4
无水肿
勉强可见
皮肤隆起轮廓清楚
水肿隆起约 1 mm
水肿隆起超过 1 mm, 范围
扩大
0
1
2
3
4
2
结果
2
1
抑菌试验结果
试验条件下, ZnO /活性碳复合材料对原核细菌
能起到很好的杀灭作用, 无论对革兰氏阴性的大肠
杆菌, 还是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌,以及能产生
芽孢的枯草芽孢杆菌,都有明显的抑菌效果 (表 2)。
20 mL菌悬液中加入 1 g复合材料 ( 1# - 10# )对 3种
细菌的生长抑制率均高达 99%。材料对真菌



酿酒酵母的抑菌效果相比较细菌来说要差, 抑菌率
从 28
91% ( 10# )至 64
34% ( 6# )不等。
对 5#材料进行了 5
, 2
系列稀释,不同浓度
材料抑菌试验发现, 0
1
g /mL以上浓度的材料有
明显的抑菌效果,对 3种细菌的抑菌率分别为大肠
杆菌 94
89%、金黄色葡萄球菌 92
03%、枯草芽孢
杆菌 94
99%。 0
1- 50
g /mL的之间的 6个受试
材料浓度, 抑菌效果稳定,浓度 /抑菌率曲线的斜率
趋近与零,说明 0
1
g /mL的 5#材料悬液就可达到
明显的抑菌效果。在低浓度情况下, 金黄色葡萄球
菌和枯草芽孢杆菌似乎对该材料更敏感, 在低的浓
度 ( 0
0125
g /mL)抑菌率仍约 80% ,但此浓度大肠
杆菌下就能达到 71%的抗菌效果 (图 1)。材料对真核
细胞
酵母菌的增殖也有一定的抑制作用, 0
1
g /mL
的 5#材料混悬液就达到最高抑制率 ( - 60% ),说明酵
母菌对该材料具有很好的耐受性。
表 2
复合材料抑菌率
材料 抑菌率 (% )大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 酿酒酵母
1# 99
70 99
99 99
99 54
97
2# 99
99 99
99 99
99 36
37
3# 99
99 99
99 99
99 52
25
4# 99
95 99
99 99
98 83
41
5# 99
83 99
99 99
98 64
22
6# 99
72 99
99 99
98 64
34
7# 99
99 99
76 99
97 54
74
8# 93
60 99
53 99
97 62
68
9# 99
97 99
47 99
95 53
91
10# 77
28 98
34 99
89 28
91
2
2
细胞毒性试验结果
根据处理细胞经 MTT法测定、数据分析结果,
炭粉浸提液对 H epG2细胞生长抑制率为 23
44%,
而 1# - 10#材料浸提液对细胞生长抑制率为 15% -
25%之间,对细胞生长所有材料浸提液无明显影响。
0
25 g的 5#材料 /10mL MEM完全培养基浸提液处
理细胞,对细胞生长的抑制率为 16
06% , 该浸提液
经 2
系列稀释 ( 6个稀释度 )处理细胞, 未发现对
细胞明显的毒害作用,材料浸提液对受试细胞属于
实际无毒级。
图 1
不同浓度 5#材料的抑菌率
202
2010年第 1期 韩绪军等:载 ZnO /活性碳复合材料抗菌性能及安全性研究
2
3
口服急性毒性试验
20只受试小鼠分为两个组 (每组 10只 ) ,按灌
喂剂量,分别喂饲了 0
04 g 3#和 5#复合材料材,另
外 6只对照组喂饲 0
04 g活性碳, 小鼠受试剂量为
2 000 mg /kg体重。经口灌喂小鼠 ( 20只 ) , 14 d观
察期内无一只中毒或死亡, 饲料消耗量及体重不断
增加, 外观、行为、精神状态、大、小便及其颜色、背
毛、肤色、呼吸均正常, 鼻、眼、口腔无异常分泌物。
经学生 t检验和卡方检验, 此二处理组与对照组 ( 6
只 )间的体重等各项指标比较无显著差异 ( P >
0
05) ,证明该 ZnO /活性碳复合材料口服无毒。
2
4
急性皮肤刺激试验
白兔去毛皮肤分别用浓度 (凡士林与 ZnO /活性
碳复合材料比 )为 1
1 g和 1
5 g的 3#、5# ZnO /活性
碳复合材料悬液,处理 24 h后,在不同时间观察,未
发现处理部位有红斑和水肿反应, 与对照部位皮肤
比较无异常。ZnO /活性碳复合材料对兔皮肤一次
性刺激积分为 0,材料对皮肤无刺激性。
3
结论
抑菌试验表明, 高浓度 ZnO /活性碳 1# - 10#复
合材料对细菌具有明显的抑制效果 (抑制率 99% ),
低浓度的 ZnO /活性碳复合材料 ( 0
1
g /mL)对细
菌也有较好的抑菌效果 (抑制率 > 90% ), 对酵母菌
的抑制率平均在 50%左右。安全性试验表明, ZnO /
活性碳复合材料对小鼠经口灌喂半致死剂量 LD50
> 2 000mg /kg,对兔皮肤刺激性积分为 0,对细胞生
长无影响,属于实际生物无毒级。 ZnO /活性碳复合
材料具有高效抗菌活性,同时使用安全。
4
讨论
Zn( Ac) 2 /活性炭是聚乙烯醇生产过程中的必
需催化剂,其催化寿命只有 5- 6个月, 因而规模生
产时大量废催化剂堆积, 对环境造成潜在危害。本
研究中的 ZnO /活性碳复合材料,为废催化剂经微波
加热、高温烧结、蒸馏水洗而制备获得, 高温使得其
中的残留有机废物被燃烧挥发, 高温氧化生成的
ZnO被吸附在多孔的活性炭载体材料上, 该制备工
艺是固体废物再利用和循环经济的有效体现。经烧
结活性碳材料保持了其较大比表面积特性, 具有良
好的吸附作用,除可以负载 ZnO外, 还可以将微生
物吸附在材料表面 [ 13] , 充分发挥 ZnO的抗菌活
性 [ 6- 8]。此机制是本研究复合材料可能较好抑制受
试菌生长的理论基础。
1
#
- 10
#样品都是 ZnO /活性碳复合材料, 制备流
程相同但条件不同 (微波烧结温度、加热时间、蒸馏
水漂洗时间等 ) ,因而活性碳材料吸附 ZnO量及一
些其他性质方面可能稍微的不同, 同时生产的成本
也不一样。一些研究 [ 5]已经证实, ZnO /活性碳复合
材料的抗菌性能与材料中 ZnO的含量及炭化温度
有关。因此,本研究将在 10种材料中, 在保证较高
抑菌率的前提下, 找到一个制备材料制备成本相对
低的工艺用于将来的生产。
已有研究报道 [ 15]在 ZnO浓度为 10 ppm时其对
枯草杆菌的抑制率为 90%,而在 1 000 ppm时对大肠
杆菌的抑菌率为 48%。研究中选用了大肠杆菌
( G
-
) ,金黄色葡萄球菌 ( G+ )、枯草芽孢杆菌 ( G+ )、
酵母菌 (真菌 )为受试菌, 因 ZnO /活性碳复合材料
不溶于水,试验用材料悬液浸泡试验, 保障 ZnO与
菌体可以有效接触,近距离发挥材料的接触抑制作
用和可能的氧化杀菌作用, 并采用梯度稀释平板培
养菌落计数法,检测材料的抑菌率。Tam等 [ 16]报道
在 ZnO的表面能够产生 H2O2, 能够穿透细菌的细
胞壁。这个过程中产生的
O -2 和
OH 自由基可
能杀灭细菌 [ 17]。检测的结果显示材料对 G
和 G +
细菌均有较高的杀菌活性, 提示该材料可能对细菌
具有很好的广谱杀灭作用。材料对酵母菌的杀灭作
用远远不及细菌, 从酵母菌属于真核微生物的角度
来考虑,该材料对真核、原核细胞的作用机理或部位
可能不一致, 推测材料在使用上对真核细胞的安
全性。
无抗菌材料使用已久, 一般认为氧化锌的使用
是安全的 [ 18] , 抗菌杀菌作用类似次氯酸, 漂白粉
等 [ 12]。现在人们的物质生活水平日渐提高, 对健康
要求也更高。材料的使用安全性是必须考虑的问
题。从材料对细菌的抗菌试验结果来看, 1#- 10#样
品对受试菌的杀灭率相差不多, 故在做细胞毒性试
验及动物研究时,选择制备工艺相对简单、成本较低
的 3#和 5#材料, 评价出该材料系列的生物安全性。
研究中从细胞毒性水平, 小鼠口服毒性及白兔皮肤
刺激试验几个层面证实了材料良好的使用安全
203
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
性能。
氧化锌的最佳抗菌形式尚不确定,制备工艺复
杂, 资源有限, 因而未得到全面研究和广泛应用。
ZnO /活性碳复合材料是废催化剂回收利用, 成本
低,环保节能, 材料经高温烧结, 不溶于水, 稳定性
好。因该材料以活性碳为载体,也具有活性碳的基
本性质,本研究相关试验也已经证实了该材料同时
具有吸附甲醛等有害气体的功能, 说明该材料具有
多方面的应用价值,为该材料在环保、建筑、包装、家
电和日化等方面的应用打下了良好的前期研究
基础。
参 考 文 献
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