全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2009年第 2期
收稿日期：2008-10-06
基金项目：国家支撑计划子课题“北方粳稻育种技术与新品种选育”（2006BAD01A-6）
作者简介：王彩芬（1968-），女，硕士学位，副研究员，从事水稻生物技术育种工作
在植物遗传转化所构建的表达载体中，除含有
目的基因和各种表达调控元件外，一般情况下还插
入了便于筛选用的标记基因。 经过遗传转化，表达
载体上所有的插入序列一起整合到受体植物染色
体基因组中。选择标记基因的产物能使转化细胞产
生一种选择压力，致使未转化的细胞在施加选择剂
条件下不能生长、发育和分化。 而转化细胞对该选
择剂具有抗性，可以继续存活。 因而此方法有利于
从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株，是
一种较为方便、快捷的转基因植物鉴定方法。
1 常用的选择标记基因
目前常用的筛选标记基因主要有 2 大类：抗生
素抗性酶基因和抗除草剂抗性酶基因，前者可产生
对某种抗生素的抗性， 后者可产生对除草剂的抗
性。转化细胞可以在含有抗生素或除草剂的培养基
上正常生长。 使用最多的抗生素抗性酶基因有 npt
Ⅱ基因 （产生新霉素磷酸转移酶 ， 抗卡那霉素 、
G418、巴龙霉素、新霉素）、hpt 基因 （产生潮霉素磷
酸转移酶，抗潮霉素）、cat 基因（产生氯霉素乙酰转
移酶， 抗氯霉素）、spt 基因 （产生链霉素磷酸转移
酶，抗链霉素）和 gent 基因（产生庆大霉素乙酰转移
酶，抗庆大霉素）等。 常用的抗除草剂基因有 epsp
基因（产生 5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗
草甘膦）、gox 基因 （产生草甘膦氧化酶， 降解草甘
膦）、bar 基因（产生草丁膦乙酰转移酶，抗草丁膦或
草甘膦）等 [1]。
2 标记基因存在的问题
利用选择标记基因筛选转化细胞及植株为植
物的遗传转化提供了便利。 但是，得到所需要的转
化植株之后，选择标记基因成为多余的 ，甚至是有
害的。选择标记基因的潜在危险性主要包括以下几
个方面。
2．1 安全性
筛选标记基因的安全性包括对生态环境的安
全性和对人类健康的安全性。 例如，抗生素抗性标
记基因的转移可导致其在环境中传播；转基因植物
植物遗传转化中选择标记基因的研究进展
王彩芬
（宁夏农林科学院农作物研究所，永宁 750105）
摘 要： 标记基因在为植物遗传转化提供方便的同时也存在一些问题，综述了植物遗传转化中常用的选择标记基
因、标记基因存在的问题以及解决选择标记基因安全性的策略。
关键词： 标记基因 安全性 策略
Research Progress of Marker Gene in Plant Genetic
Transformation
Wang Caifen
（The Crop Institute of Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yongning 750105）
Abstract： Marker gene provide a convenient mathed for plant genetic transform，but there still exist some
problems. In this paper，the common marker gene and its prolems as well as the strategies that could help to solve the
security problem，were summraised.
Key words： Marker gene Security Strategies
2009年第 2期
中的标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移
至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性；除草剂
抗性标记基因通过花粉和种子等途径在种群之间
扩散 ，可能转移到杂草 ，产生抗除草剂的 “超级杂
草”；或者向其它植物中转移，从而对生态环境和生
物多样性产生潜在的危害；转基因食品的标记基因
及其产物可能对人或动物健康有害。尽管风险评估
报告对一些筛选标记基因提供了安全保证，有的抗
生素抗性基因如 nptⅡ已通过安全性评价 [2]，但还是
不能彻底消除人们对转基因植物的担忧。
2．2 影响转化细胞再生
当植物细胞被转化后，筛选标记基因同目的基
因共同转入植物细胞，需要从含有抗生素或除草剂
的培养基上鉴别并分离出转化细胞，最终转化细胞
能够存活并生长， 而非转化细胞不能生长而死亡。
非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生
长抑制剂，阻碍营养物质向转化细胞的运输 ，进而
影响转化细胞的增殖及分化 [3]。
2．3 影响多重转化
从理论上讲，通过转基因技术可以根据育种学
家的需要将多个外源目的基因导人植物体内，获得
综合性状优良的作物品种。但是在细胞第一次转化
中使用了某一种标记基因，在随后的转化中就要使
用不同的标记基因， 这就给多基因转化造成困难。
另外， 通过含不同外源基因的转基因植株杂交，可
以获得具有多个优良性状的转基因植株，同时植株
中筛选标记基因的拷贝数也随之增加，多个同源基
因的堆积会大大增加基因沉默的可能性 [4]。
3 解决选择标记基因安全性的策略
转基因植物的安全性问题是决定转基因植物
能否商业化利用的主要因素之一，而标记基因的安
全性是近年来国际上关注的热点，许多研究人员正
在致力于这方面的研究。 目前，解决转基因植物安
全性的主要策略有 3 种：利用传统的抗性标记基因
获得转基因植株后再消除标记基因；开发利用无争
议的生物安全标记基因；研究开发无标记基因的转
化系统。
3.1 标记基因的消除
从转基因植物中消除标记基因的方法有 4 种：
共转化、位点特异性重组、同源重组和转座子介导
的再定位。
3.1.1 共转化 （co-transformation） 共转化是将标
记基因和目的基因分别构建在不同载体或同一载
体的不同 T-DNA 区域，共同转化受体细胞，通过筛
选和分子鉴定获得共整合植株，在后代分离中选择
只含有目的基因而不含有标记基因的转化植株。农
杆菌介导的转化方法比基因枪转化方法更能有效
地将目的基因与标记基因分离。共转化根据所使用
的方法不同可以分为以下 3 种。
2 个质粒 2 个菌株法 ：2 个菌株含 2 个不同的
双元质粒，其中一个含选择标记基因，另一个含有
目的基因。 通过选择标记基因筛选转化植株，再通
过杂交后代分离获得无选择标记基因的转基因植
株。 例如，Komari 等 [5]用含有 nptⅡ和 GUS 的双元质
粒的根癌农杆菌混合浸染烟草和水稻，很大部分的
共转化体携带非连锁基因，自交分离后 71％的烟草
和 100％的水稻只含有 GUS。 这表明不同细菌来源
的 T-DNA 通常整合于同一位点， 但是至少存在非
连锁整合位点。
2 个质粒 1 个菌株法：该菌株含有 2 个不同的
双元质粒，分别含有一个选择标记基因及一个目的
基因。 Daley 等 [6]用含有 nptⅡ和 GUS 不同质粒的根
癌农杆菌浸染油菜和烟草，共转化效率分别为 62％
和 52％。 后代分离植株分别有 40％和 58％只含有
单一基因。这种方式容易分离获得单一目的基因转
化植株，但是由于同一细菌中含有不同质粒 ，存在
质粒不相容性问题。
2 个 T-DNA 1 个质粒方法：该菌株含有一个双
元质粒， 在其不同的 T-DNA 上分别含有一个选择
标记基因及一个目的基因。 Komari 等 [5]将标记基因
hpt 或 nptⅡ分别和目的基因 GUS 构建在双元质粒
的两个相邻 T-DNA 区域上。 质粒导入根癌农杆菌
后转化烟草和水稻 ， 共转化效率分别达 52％和
47％。 随机选取共转化烟草和水稻自交，在分离后
代共转化烟草中有 56％只含有目的基因 GUS，共转
化水稻有 65％只含有 GUS。表明在半数以上共转化
植株中，双 T-DNA 整合位点并不连锁。
3.1.2 位点特异性重组体系（site-specific recombi-
nation system） 该系统由重组酶及其识别位点组
成。同源重组是双向的，通过重组酶作用在 DNA 专
王彩芬：植物遗传转化中选择标记基因的研究进展 7
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
一性位点间实现同源交换，可以把外源基因整合到
染色体上，也可以从染色体上把外源基因切除。 目
前应用于植物遗传转化的重组酶系统有大肠杆菌
噬菌体 P1 的 Cre-lox 系统，酿酒酵母（Saccharomyces
cerevisiae）2μm 质粒的 FLP-FRT 系统 ， 接合酵母
（Zygosaccharomyces rouxii）pSR1 质粒的 R-Rs 系统 ，
链霉菌属噬菌体 ΦC31 的位点特异性重组系统和
Mu 噬菌体的 Gin 重组系统。
3.1.3 多元自主转化（multi-auto-transformation，MAT）
载体系统 该系统将由诱导型启动子调控的重组
酶基因与克隆于两段同源序列之间的标记基因连
接到同一载体上，构建成双元载体导入植物中。 对
转基因植株进行化学诱导，表达重组酶，促使同源
序列发生重组，从而将标记基因去除。 该系统不需
要对初级转化体进行有性杂交，从发生分离的后代
中筛选出不含选择标记基因的植株。
目前 MAT vector 系统主要有 2 类， 包括 ipt 型
和 rol 型 。 Ebinuma 等 （1997）用 ipt-type MAT vector
系统获得了无选择标记基因的转基因杂种杨树 。
Endo 等 （2002）也利用 ipt-type MAT vector 系统 ，仅
通过一次转化即获得了无选择标记的转基因水稻，
并且诱导无选择标记植株的频率高达 25.5％。
3.1.4 同源重组 （homologous recombination） 把标
记基因放在 2 个 DNA 同源序列之间， 发生同源重
组后，标记基因即被去除，细胞经过再生，可得到无
标记基因的植株。 Lamthan 等 [7]和 Maliga 等 [8]采用采
用同源重组的方法获得了只含有目的基因的转基
因烟草。
3.1.5 转座子介导的再定位（transposon-mediated r-
epositioning） 转座子 （transposon）是指一段可在染
色体组内移动的特定的 DNA 序列， 可将其从一个
位点切除下来，插入到一个新的位点上。 同时转座
过程并不伴随再次插入而使该转座子丢失，基于这
一原理，采用转座子系统也可以将选择标记基因去
除。
3.2 利用无争议的生物安全标记基因
目前发现的生物安全标记基因主要有绿色荧
光蛋白基因、 甜菜醛脱氢酶基因、6-磷酸甘露糖异
构酶基因 、木糖异构酶基因 、核糖醇操纵子 、谷氨
酸-1-半醛转氨酶基因、 异戊烯基转移酶基因和吲
哚-3-乙酰胺水解酶等。 与常规标记基因不同，这些
标记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生
物是安全的，因此被称为生物安全标记基因 [9]。
3.2.1 绿色荧光蛋白基因 绿色荧光蛋白 （green
fluo-rescent protein，GFP）是从维多利亚水母（Aequ-
oreavictoria） 中分离纯化出的一种可以发出绿色荧
光的物质。 与其它选择标记相比，GFP 的检测具有
不需要添加任何底物或辅助因子， 不使用同位素，
也不需要测定酶的活性等优点。 同时，GFP 生色基
团的形成无种属特异性，在原核和真核细胞中都能
表达 ，其表达产物对细胞没有毒害作用，不影响细
胞的正常生长和功能。目前，GFP 已在烟草、水稻等
植物中得到了应用。
3.2.2 甜菜碱醛脱氢酶基因 利用植物本身就具
有的基因作为选择标记基因，可以减轻大众对转基
因作物的担心。 例如 Daniell 等 [10]用菠菜的甜菜碱
醛脱氢酶 （betaine adehyde dehydrogenase，BADH）基
因作为烟草叶绿体转化的筛选标记基因，甜菜碱醛
作选择剂，在筛选过程中 BADH 可以把有毒性的甜
菜碱醛 （betaine~dehyde，BA）转化为没有毒性的甘
氨酸甜菜碱（glycine betaine，GA）。 GA 作为一种渗
透保护剂，还可以提高转基因植株的再生率。
3.2.3 与糖代谢途径相关的基因 离体培养的细
胞不能进行光合作用，必须在培养基中添加一定浓
度的碳源（如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等 ）后细胞才能
进行正常的生长分化。 近年来，利用这一点研究开
发了 3 种非抗生素标记基因，即 6-磷酸甘露糖异构
酶（6-phosphomannose isomerase）基因 （pmi）、木糖异
构酶 （xylose isomerase）基因 （xflA）和核糖醇操纵子
（ribitol operon）。 分别能使转化细胞利用 6-磷酸甘
露糖、木糖和核糖醇为碳源，而非转化细胞由于不
含有这些基因，不能利用这些碳源，会产生碳饥饿
而不能正常生长，从而达到高效选择的目的。
目前 ，应用最多的是 pmi 基因 ，已广泛用于水
稻 [11]、玉米 [12]、小麦 [13]甜菜 [14]、棉花 [15]和番茄 [16]等植
物的转化系统。
许多植物细胞不能利用木糖。然而在木糖异构
酶 （xylose isomerase）基因 （xflA）的催化下能将木糖
转变成木酮糖 （xylulose）， 再经过磷酸戊糖途径分
解代谢，为细胞生长所利用。 Haldrup 等 [3]将 xylA 分
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别转化到马铃薯、烟草和番茄愈伤组织后，再将愈
伤组织置于木糖的培养基上进行筛选，得到了能够
在该培养基上正常生长的转基因植株，且比卡那霉
素筛选系统高 10 倍左右。
3.2.4 与激素代谢途径相关的基因 包括异戊烯
基转移酶 （isopentenyltransferase）基因 （ipt）、吲哚-3-
乙酰胺水解酶 （indole-3-acetamide hydrolyse） 基因
（iaah） 及一葡糖苷酸酶 （β-glucuronidase） 基因
（gus）。 ipt 基因从农杆菌的 T-DNA 中克隆而来，编
码异戊烯基转移酶 IPT， 参与植物细胞分裂素的合
成。 细胞分裂素可以促进器官发生，转化的细胞在
未加细胞分裂素的培养基上能继续生长，形成不定
芽。 相反，未转化的细胞在不含细胞分裂素的培养
基中不能正常生长和分化而死亡 （Ebinnma，et al，
1997）。
iaah（生长素合成）也是通过调节植物体内激素
代谢而使转化细胞与非转化细胞的生长与分化造
成一定的差异，从而达到筛选出转化细胞的目的。
gus 基因在一定条件下有与标记基因的相似效
果。 在培养基中添加葡萄糖苷酸，含有 gus 基因的
转化细胞因子能在 GUS 的作用下进行水解 ， 释放
出激动素 （kinetin），从而促进转化细胞的生长 ，未
转化细胞则逐步死亡。
3.2.5 其它安全标记基因 除了以上几种主要的
安全标记基因外，还有一些有关安全标记基因的研
究报道，如汞离子还原酶基因（merA），叶绿体合成
中的关键酶基因， 谷氨酸-l-半醛转氨酶基因（hem
L）和原卟啉原氧化酶基因（PPO），以及生物合成基
因等。随着植物功能基因组学和蛋白质组学的进展
和分子生物学技术的不断发展，植物转基因技术必
将不断合理化和精确化，将会有更多的安全标记基
因被开发和利用。
3.3 无选择标记系统的研究与利用
去除标记基因的的转化系统和一些生物安全
标记基因都存在一些不足。 在遗传转化过程中，如
果不使用选择标记基因就能获得只含有目的基因
的转基因植株，应该是最理想和最有效的方法。 de
Vetten 等（2003）利用致病性强的农杆菌菌株 AGL0
转化外植体，PCR 分析方法选择转化细胞， 而用选
择标记基因。 此法的具体步骤是：在构建表达载体
时，只将目的基因和启动子及终止子插入在 T-DNA
的左边界和右边界之间，用农杆菌菌株 AGL0 浸染
马铃薯外植体。 由于 AGL0 菌株含有超强致病力的
农杆菌 A281 质粒 pTiBo542Ti 的致病区域序列 ，所
以 AGL0 菌株的转化效率较高。 共侵染之后，每个
外植体可以产生 1～2 个再生芽。再生芽培养成小植
株后用特异的引物进行 PCR 检测， 结果发现 5 次
转化实验的转化频率在 1.3％~5.6％ 之间， 平均为
4.5％。经 PCR 检测为阳性的转基因植株，有 45％的
在表型上出现所需的性状。这个系统不需要经过遗
传分离或位点特异重组酶系统去除标记基因，因此
该系统尤其是为营养繁殖的植物 （如马铃薯和木
薯）提供了一种有效的产生无标记基因的转基因植
株方法。
另外，有学者 [17]认为利用花粉管通道途径进行
基因转化可以不使用标记基因。 其技术核心是：构
建由目的基因、启动子和两侧边界序列共同组成的
线形化的基因转化元件，通过花粉管通道途径进行
基因的转化操作， 再利用分子手段进行必要的检
测， 获得无载体骨架序列和标记基因的转基因植
株。
4 小结
综上所述，去除标记基因和生物安全标记基因
的研究已经取得很大的进展，但几种去除体系都各
有优缺点。
共转化法操作简便， 目前对烟草、 拟南芥、水
稻、玉米、油菜、大麦、大豆和小麦等多种植物的试
验都已获得成功，尤其对于作物育种具有很大的优
势。
但共转化法所产生的共转化后代中只有 25％
标记基因被分离， 必须建立在高转化频率基础上，
需要获得大量的转基因植株，工作量大、周期长，并
且只有农杆菌介导的转化才能有效剔除标记 。 另
外，这一方法只适合有性繁殖植物。
利用同源重组去除标记基因， 要求两个 DNA
分子的序列同源， 而且同源区越长越容易去除，反
之，越难去除。但同源区太长，增加了基因导入的难
度。 同源重组频率低，工作量大、周期长，有时因为
错误重组的发生，目的基因会发生缺失 [18]。
利用转座子、位点特异重组酶系统等方法去除
王彩芬：植物遗传转化中选择标记基因的研究进展 9
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转基因植物中标记基因，初级转化子一般需要通过
杂交或再次转化来导入 Ac 转座酶 、Cre 重组酶等
基因，然后对杂交后代进行选择，从而筛选出不含
标记基因的植株。
MAT 载体同其它消除体系相比， 既不需要再
转化，也不需要通过有性杂交就可获得无标记基因
的转基因植株，也适合于无性繁殖作物。 该方法省
时、省力，是一种消除标记基因较为有效的途径，也
使多次转化成为可能。
大量的文献也报道了安全的标记基因的转化
效率显著高于传统的抗性标记基因，个别标记基因
还可作为目的基因而存在，并且实现了转化一次转
移 2 个基因的目的。 笔者认为，安全的标记基因大
多来自植物本身，因此不必担心“基因逃逸”和“超
级杂草”的产生，不会破坏生态平衡，从而避免了转
基因植物中标记基因而引起的安全争议。
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